黃 睿， 羅佳佳， 吳遠(yuǎn)航， 劉攀道*， 劉國道*

(1.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所，農(nóng)業(yè)部華南作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室， 海南 ?？?571101；2.海南大學(xué)熱帶作物學(xué)院， 海南 ?？?570228)

磷(phosphorus，P)是植物生長發(fā)育所必需的大量營養(yǎng)元素，參與了植物細(xì)胞的膜與核苷酸合成、光合作用與能量轉(zhuǎn)換等各種新陳代謝過程[1]。無機磷酸鹽(inorganic phosphate，Pi)是能被植物根系直接吸收的主要磷形式，但其在土壤中易于被金屬離子與有機物固定，形成難于被植物直接吸收的難溶性磷和有機磷[2]。因此，在大多數(shù)耕作土壤，磷有效性低是限制作物增產(chǎn)的主要因素之一[3]。在傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)系統(tǒng)中，經(jīng)常過量施用磷肥來維持作物生產(chǎn)，但這可能導(dǎo)致土壤加速退化和水體富營養(yǎng)化[4]。因此，選育磷高效作物品種并解析其適應(yīng)低磷脅迫機理，對于減少磷肥施用量、發(fā)展生態(tài)農(nóng)業(yè)具有重要意義。植物在長期進(jìn)化過程中形成了一系列低磷脅迫適應(yīng)機制，如根系形態(tài)構(gòu)型的重塑、與叢枝菌根形成共生網(wǎng)絡(luò)、增強高親和力磷轉(zhuǎn)運子的表達(dá)及活性、分泌有機酸和酸性磷酸酶(acid phosphatase,ACP)到根際等[5-6]。值得注意的是，土壤中30%～65%的磷以有機磷的形式存在，如植酸磷、膜磷脂、核苷酸及其衍生物等[7]，但有機磷只有被ACP水解后釋放出Pi才能被植物利用[8]。從不同植物的根系中，已鑒定了眾多受低磷脅迫誘導(dǎo)增強表達(dá)的ACP，其中絕大多數(shù)由紫色酸性磷酸酶(purple acid phosphatase，PAP)家族基因編碼[9]。植物PAP屬于多基因家族(multigene family)，如擬南芥(Arabidopsisthaliana)、水稻(Oryzasativa)和大豆(Glycinemax)的基因組中分別有29，26和38個PAP基因[10]。但是，已被證明在植物適應(yīng)低磷脅迫過程中發(fā)揮生物學(xué)功能的PAP基因主要來源于雙子葉植物，如擬南芥、大豆、菜豆(Phaseolusvulgaris)和白羽扇豆(Lupinusalbus)等[9]，而單子葉植物中，僅水稻中的3個低磷響應(yīng)PAP基因(OsPAP10a，OsPAP10c和OsPAP21b)被闡明了參與腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)的利用[11]。對于其他單子葉植物，PAP基因?qū)Φ土酌{迫的響應(yīng)及其生物學(xué)功能仍有待深入研究。

象草(Pennisetumpurpureum)是禾本科狼尾草屬多年生大型草本植物[12]。象草具有生長快、產(chǎn)量高、分蘗多、再生性強、適口性好等特點，是一種適合在我國南方熱帶亞熱帶地區(qū)種植的優(yōu)質(zhì)飼草[13]。但在我國南方的酸性土壤中普遍存在磷有效性低的問題，象草對低磷脅迫的適應(yīng)機理仍不清楚。本研究將分析象草對外源ATP的利用能力，隨后同源克隆了象草中可能參與ATP利用的3個PAP家族基因(PpPAPs)，并分析了PpPAPs響應(yīng)低磷脅迫的表達(dá)模式，以期為解析象草適應(yīng)低磷脅迫機理提供一定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料和培養(yǎng)條件

本研究所用象草材料由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所的“農(nóng)業(yè)農(nóng)村部儋州熱帶牧草種質(zhì)資源圃”收集保存并提供。營養(yǎng)液配方如下：1 500 μmol·L-1KNO3，1 200 μmol·L-1Ca(NO3)2，400 μmol·L-1NH4NO3，25 μmol·L-1MgCl2，500 μmol·L-1MgSO4，300 μmol·L-1K2SO4，0.3 μmol·L-1(NH4)2SO4，1.5 μmol·L-1MnSO4，0.5 μmol·L-1CuSO4，1.5 μmol·L-1ZnSO4，0.16 μmol·L-1(NH4)6Mo7O24，2.5 μmol·L-1NaB4O7，40 μmol·L-1Fe-Na-EDTA。象草的營養(yǎng)液水培試驗方法如下：選取長度為10 cm左右的象草種芽，在含600 μmol·L-1KH2PO4的營養(yǎng)液中預(yù)培養(yǎng)使其生根。預(yù)培養(yǎng)10 d后，選擇長勢均一的幼苗，分別移至添加不同磷源的營養(yǎng)液中進(jìn)行處理，即：添加600 μmol·L-1KH2PO4(+P處理)、添加200 μmol·L-1ATP(+ATP處理)和不添加KH2PO4(-P處理)。每隔5 d更換一次營養(yǎng)液，每個處理設(shè)4個生物學(xué)重復(fù)。分別在處理5 d，10 d和15 d后分地上部和根部收取樣品。

1.2 方法

1.2.1干重與全磷含測定 將所收樣品放入烘箱于70℃烘干至恒重后稱干重。象草干樣品粉碎后稱取50 mg于消煮管中，先用雙蒸水濕潤后，再加濃硫酸2 mL，搖勻，在消煮爐中消解，期間加2～3次過氧化氫，每次加5～10滴，消解至無色后再消解1 h。消解完成后冷卻，用雙蒸水定容至100 mL，澄清后溶液待測。參照Murphy和Riley[14]的方法測定全磷含量，取適量體積的樣品磷待測液，用雙蒸水定容至1.8 mL后加入0.2 mL鉬銻抗顯色液，混勻并靜置30 min后測定OD700的吸光度值。

1.2.2ACP活性測定 根系胞內(nèi)ACP活性測定：稱取根系鮮樣品100 mg，加入2 mLTris-HCl緩沖液(0.1 M，pH 8.0)，冰浴研磨成勻漿，12 000 rpm離心15 min，收集上清液即為胞內(nèi)蛋白提取液。參照Bradford[15]的方法測定蛋白濃度。酶活性的測定參照Liang等[16]的方法，取一定體積蛋白提取液于2 mL離心管中，用雙蒸水定容至0.2 mL，加入0.8 mL含2 mM ATP底物溶液(用pH 5.5的20 mM Tris-HCl緩沖液配制)，搖勻，于35℃反應(yīng)15 min后加入0.5 mL三氯乙酸溶液(10%)終止反應(yīng)?？瞻讓φ找?0 mM Tris-HCl緩沖液(pH 5.5)替代底物溶液，用于評估王草根系樣品中的含磷量。ACP催化底物水解后釋放出的磷，參照Irving和McLaughlin[17]的孔雀石綠定磷法測定。酶活性用單位蛋白(mg)的酶活力單位(U)表示。根系分泌ACP活性測定以ATP為底物，參照黃睿等[18]的方法進(jìn)行。

1.2.3象草PpPAPs的同源克隆與進(jìn)化樹分析 為克隆象草中分別與OsPAP10a(Gene loci:Os01 g56880)、OsPAP10c(Gene loci:Os12 g44020)和PvPAP3(Gene loci:Phvul.002G181500)同源的基因序列，分別根據(jù)這3個PAPs的保守結(jié)構(gòu)域序列設(shè)計EST擴增引物PpPAP3/10a/10c-EST-F/R，通過PCR擴增出它們的EST片段并測序。隨后，根據(jù)這3個PpPAPs的EST序列設(shè)計5′末端特異擴增引物PpPAP3/10a/10c-5′RACE-R和3′末端特異擴增引物PpPAP3/10a/10c-3′RACE-F，并分別與通用引物RACE-UPM和RACE-NUP配對，采用cDNA末端快速擴增試劑盒SMARTer RACE 5′/3′Kit(Clontech，美國)，分別擴增出它們的5′和3′末端序列并測序。每個PpPAP的EST，5′和3′端序列，通過MEGA 5軟件拼接后獲cDNA全長序列。設(shè)計引物PpPAP3/10a/10c-ORF-F/R進(jìn)行PCR擴增全長序列并測序驗證。本研究所用引物見表1。多序列比對與蛋白進(jìn)化樹構(gòu)建分別采用Cluster X和MEGA 5軟件。蛋白分子量與等電點預(yù)測采用Editseq軟件。

表1 本研究所用引物列表Table 1 A list of primers used in the study

1.2.4熒光定量PCR(qRT-PCR) 象草鮮樣使用RNA-solve試劑盒(Omega Biotech，美國)提取總RNA。經(jīng)DNase I處理后的RNA通過M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(Promega，美國)合成cDNA第一鏈。qRT-PCR用SYBR Premix ExTaq II(Takara，日本)試劑盒在Rotor-Gene RG-3000實時熒光定量PCR儀(Corbett Research，澳大利亞)上進(jìn)行。3個PpPAPs基因的qRT-PCR引物PpPAP3/10a/10c-RT-F/R見表1。以象草的肌動蛋白actin 1編碼基因(PpACT1，NCBI accession number：MT784734)為內(nèi)參看家基因?；蛳鄬Ρ磉_(dá)量參照Larionov等[19]的方法計算，即：基因相對表達(dá)量=目的基因表達(dá)量/內(nèi)參看家基因表達(dá)量。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

本研究相關(guān)數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤(SE)表示，數(shù)據(jù)單因素方差分析和相關(guān)性分析均通過SPSS 18.0軟件(IBM-SPSS，美國)進(jìn)行，分別采用多重比較LSD法和Pearson法。數(shù)據(jù)可視化作圖采用Microsoft Excel 2013軟件(Microsoft，美國)。

2 結(jié)果與分析

2.1 象草對有機磷的利用能力評價

水培條件下對象草進(jìn)行-P,+ATP和+P處理，分別在5 d,10 d和15 d后收取樣品測定植株干重和全磷含量。如圖1A所示，不同磷源處理5 d 的植株干重?zé)o顯著差異，但10 d和15 d后，+ATP處理下的植株干重比-P處理增加38.7%～73.4%，差異顯著(P<0.05)。對于全磷含量，從5～15 d，+ATP處理與-P處理相比增加1.6～2.6倍，差異顯著(P<0.05)(圖1B)。但是，處理10 d和15 d后，+ATP處理下的植株干重與全磷含量均低于+P處理，差異顯著(P<0.05)(圖1)。以上結(jié)果表明，象草對外源有機磷源(+ATP)具有利用能力，但低于對無機可溶性磷源(+P)的利用能力。

圖1 不同磷源對象草植株干重(A)與全磷含量(B)的影響Fig.1 Effects of different P sources on plant dry weight (A) and total P content (B) in elephant grass注：-P為不添加KH2PO4處理，+ATP為添加200 μmol·L-1 ATP處理，+P為添加600 μmol·L-1 KH2PO4處理。不同的小寫字母表示在同一處理時間下，不同磷源處理之間差異顯著(P<0.05)，下同Note:-P indicated no KH2PO4added treatment,+ATP indicated 200 μmol·L-1 ATP added treatment,+P indicated 600 μmol·L-1 KH2PO4 added treatment. Different lowercase letters indicate significant differences among different P sources at the 0.05 level at the same treatment time,the same as below

2.2 不同磷源處理對象草根系A(chǔ)CP活性的影響

如圖2A所示，處理5～15 d之后，與+P處理相比，-P和+ATP處理分別使根系胞內(nèi)ACP活性分別提高1.1～2.7倍和0.9～2.0倍，差異顯著(P<0.05)。而對于根系分泌ACP活性，不同磷源處理5 d時無顯著差異(圖2B)；但處理10～15 d后，-P和+ATP處理的根系分泌ACP活性分別比+P處理分別提高2.2～5.1倍和1.9～2.7倍，差異顯著(P<0.05)(圖2B)。以上結(jié)果說明，象草在有效磷缺乏條件下(-P和+ATP處理)，會增加根系A(chǔ)CP的合成與分泌。

2.3 象草PpPAPs基因的克隆及蛋白進(jìn)化樹分析

為克隆象草中與水稻OsPAP10a，OsPAP10c及菜豆PvPAP3的同源基因，分別根據(jù)這3個基因的保守結(jié)構(gòu)域序列設(shè)計引物，通過PCR擴增獲得了象草中3個同源基因的EST序列。隨后通過RACE技術(shù)，獲得了象草的這3個PpPAPs基因cDNA全長序列，開放閱讀框(ORF)分別為1 083 bp，1 422 bp和1 389 bp(圖3)，并將它們分別命名為PpPAP3，PpPAP10a及PpPAP10c(NCBI accession number：MT784735,MT784736,MT784737)。PpPAP3，PpPAP10a和PpPAP10c預(yù)測的蛋白分子量分別為40.6 kDa，53.7 kDa和52.1 kDa；蛋白等電點分別為5.9，6.7和6.8。隨后的蛋白進(jìn)化樹分析表明，植物的PAPs可被分為Ⅰ,Ⅱ和Ⅲ共3個亞家族，其中Ⅰ亞家族可進(jìn)一步被分為Ⅰa-1，Ⅰa-2，Ⅰb-1和Ⅰb-2共4個子族；Ⅱ亞家族包含Ⅱa和Ⅱb兩個子族；Ⅲ亞家族包含Ⅲa和Ⅲb兩個子族(圖4)。Ⅰ和Ⅱ亞家族為大分子量PAPs，而Ⅲ亞家族為小分子量PAPs。象草的PpPAP10a及PpPAP10c屬于Ⅰa-2子族，分別與水稻的OsPAP10a和OsPAP10c同源；而PpPAP3屬于Ⅲb子族，與擬南芥的AtPAP3同源(圖4)。

圖2 象草在不同磷源處理下的根系胞內(nèi)酸性磷酸酶(A)和根系分泌酸性磷酸酶(B)活性Fig.2 Root intracellular ACP activity (A) and root secreted ACP activity (B) of elephant grass at different P sources

圖3 象草PpPAPs全長cDNA的克隆Fig.3 Full length cloning of PpPAPs in elephant grass注：泳道1，PpPAP3的ORF擴增片段；泳道2，PpPAP10a的ORF擴增片段；泳道3，PpPAP10c的ORF擴增片段Note:lane 1,ORF amplified fragment of PpPAP3;lane 2,ORF amplified fragment of PpPAP10a;lane 3,ORF amplified fragment of PpPAP10c

2.4 象草PpPAPs基因在根系中的表達(dá)模式分析

利用qRT-PCR技術(shù)，分析不同磷源處理下象草根系中3個PpPAPs基因的表達(dá)模式。如圖5A所示，與+P處理相比，-P和+ATP處理5～15 d，分別使PpPAP3在根系的相對表達(dá)量增加2.1～7.2倍和1.5～2.9倍，差異顯著(P<0.05)。對于PpPAP10a，在-P和+ATP處理5～10 d的根系中，相對表達(dá)量比+P處理分別增加1.4～5.2倍和1.0～4.0倍，差異顯著(P<0.05)；但處理15 d時，PpPAP10a在不同磷源處理根系中的相對表達(dá)量無顯著差異(圖5B)。與PpPAP3和PpPAP10a不同，-P和+ATP處理5 d對PpPAP10c在根系中的相對表達(dá)量無影響；但處理10～15 d后，-P和+ATP處理分別使PpPAP10c在根系的相對表達(dá)量比+P處理提高1.9～9.0倍和1.7～21.3倍，差異顯著(P<0.05)(圖5C)。隨后，對不同磷源處理下3個PpPAPs基因在象草根系中的表達(dá)量水平與根系A(chǔ)CP活性進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析，結(jié)果如圖6所示，PpPAP3和PpPAP10a的相對表達(dá)量與根系胞內(nèi)ACP和分泌ACP活性均顯著正相關(guān)，但PpPAP10c的相對表達(dá)量與根系胞內(nèi)ACP和分泌ACP活性均無顯著相關(guān)性。以上結(jié)果表明，在有效磷缺乏條件下(-P或+ATP處理)，象草根系會誘導(dǎo)PpPAPs基因增加表達(dá)，且PpPAP3和PpPAP10a基因的表達(dá)水平與根系A(chǔ)CP活性密切相關(guān)。

圖4 象草紫色酸性磷酸酶的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.4 Phylogenetic analysis of purple acid phosphatase in elephant grass注：PAP蛋白的前兩個字母表示物種拉丁名簡寫Note:The first two letters of each PAP protein label represent the abbreviated species name

圖5 不同磷源處理下象草根系PpPAP3(A)，PpPAP10a(B)和PpPAP10c(C)的相對表達(dá)量Fig.5 Relative expression levels of PpPAP3 (A),PpPAP10a (B) and PpPAP10c (C) in roots of elephant grass under different P treatment

圖6 象草根系PpPAPs相對表達(dá)量與胞內(nèi)ACP(A)或分泌ACP(B)活性的相關(guān)性分析Fig.6 Correlation analysis between relative expressions of PpPAPs and intracellular ACP activity (A) or secreted ACP activity (B) in roots of elephant grass注：R表示相關(guān)系數(shù)。R2表示相關(guān)系數(shù)的平方值(決定系數(shù))。*表示在P<0.05水平顯著正相關(guān)，**表示在P < 0.01水平顯著正相關(guān)，N.S.表示無顯著相關(guān)性Note:R represents correlation coefficient. R2 is the square of the correlation coefficient (coefficient of determination). A single asterisk indicates significant positive correlation at the 0.05 level,two asterisks indicates significant positive correlation at the 0.01 level. N.S. indicates no significant correlation

3 討論

有機磷是土壤磷庫的重要組分，但其不能被根系直接吸收[20]。通過根系的ACP水解外源有機磷釋放出Pi，是植物適應(yīng)低磷脅迫的機制之一[21]。為評估象草對外源有機磷(ATP)是否具有利用能力，本研究首先通過水培試驗分析不同磷源對象草生長的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，+ATP處理處理15 d后的象草生物量比-P處理高出70%以上(圖1)，說明象草能夠活化利用外源ATP。

植物ACP可被分為胞內(nèi)ACP和分泌型ACP兩類[22]。胞內(nèi)ACP指定位于細(xì)胞質(zhì)及胞內(nèi)細(xì)胞器中的ACP，主要參與植物細(xì)胞內(nèi)貯存有機磷庫的再活化利用。分泌型ACP主要是從植物根系分泌到根際或質(zhì)外體的這類ACP，主要功能是參與植物對土壤有機磷的活化利用[23]。在單子葉作物(如水稻、玉米(Zeamays)、小麥(Triticumaestivum)等)和雙子葉作物(如菜豆、大豆、白羽扇豆等)中均發(fā)現(xiàn)，低磷脅迫會誘導(dǎo)胞內(nèi)ACP活性增加，并伴隨著大量ACP從根系分泌到根際[24-25]。本研究中，ACP活性的定量測定發(fā)現(xiàn)，象草根系胞內(nèi)和分泌的ACP活性在有效磷缺乏條件下(-P和+ATP處理)均顯著提高(圖2)。以上結(jié)果表明，增加ACP的合成與分泌是植物中普遍存在的適應(yīng)低磷脅迫機制。

由于根系分泌ACP在土壤有機磷利用中的重要作用，在不同植物中，已有眾多低磷脅迫誘導(dǎo)ACP被鑒定，其中絕大多數(shù)屬于紫色酸性磷酸酶(PAP)家族[26]。但是，這些被證明參與植物適應(yīng)低磷脅迫的PAP成員，主要來源于雙子葉植物，如擬南芥AtPAP10,AtPAP12和AtPAP26參與對腺嘌呤核苷二磷酸(ADP)的活化利用[27]；大豆GmPAP4和GmPAP14參與植酸磷的活化利用[28]；菜豆PvPAP3參與ATP的活化利用[16]；柱花草SgPAP7,SgPAP10和SgPAP26參與脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)的活化利用[29]。而對于單子葉植PAP基因在低磷脅迫適應(yīng)中的功能研究，僅水稻3個OsPAPs(OsPAP10a/10c/21b)被證明參與ATP的活化利用[30]。為挖掘象草中潛在參與ATP利用的PAP成員，本研究從象草中分別克隆了與OsPAP10a,OsPAP10c和PvPAP3同源的3個PpPAPs基因(圖3)。隨后的表達(dá)模式分析表明，在有效磷缺乏條件下(-P或+ATP處理)，這3個PpPAPs基因在象草根系不同程度的增強表達(dá)(圖5)。其中，PpPAP3和PpPAP10a的相對表達(dá)量與根系A(chǔ)CP活性顯著正相關(guān)關(guān)系(圖6)。這些結(jié)果表明，PpPAPs可能參與了象草對ATP的利用，但有待進(jìn)一步的基因功能分析試驗來驗證。

4 結(jié)論

本研究證明了象草對外源ATP具有利用能力，并從象草中首次克隆了3個受低磷脅迫上調(diào)表達(dá)的PpPAPs基因。研究結(jié)果將為解析象草磷素高效利用機理提供一定基礎(chǔ)。