范 蕊，李田寬，王 超，董 瑞，陳 琪，郭金和

肝細(xì)胞癌（HCC）是占全球發(fā)病率第6 位惡性腫瘤［1］。對(duì)于巴塞羅那臨床肝癌（Barcelona Clinic Liver Cancer，BCLC）分期0～A 期肝癌，消融治療是最常用策略［2］。 單發(fā)肝癌病灶＜2 cm 患者消融后總生存率與手術(shù)切除術(shù)相比無顯著差異，但消融總體獲益優(yōu)于外科切除，因此推薦為一線治療［3］。諸多臨床研究顯示微波消融（MWA）治療小肝癌（＜3 cm）與射頻消融（RFA）相比具有相同效果和安全性［4］。 由于肝臟是富血供臟器，MWA 與RFA 相比，可在更短時(shí)間內(nèi)形成更大消融區(qū)，并在肝組織內(nèi)形成長(zhǎng)徑達(dá)10 cm 消融范圍［5］。 目前在布針策略上尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，在消融大肝癌（＞5 cm）或外形極不規(guī)則病灶后殘留活性腫瘤組織是MWA 術(shù)后復(fù)發(fā)的主要原因，因此迫切需要有效的輔助治療［6］。 低頻超聲靶向擊破載藥微泡是一種新興的腫瘤靶向給藥技術(shù)［7］。 本研究旨在觀察超聲靶向擊破載阿霉素微泡能否彌補(bǔ)MWA 適形性不足，嘗試新的肝癌聯(lián)合治療方案并評(píng)估其抗腫瘤效果。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)器材

無特定病原體（SPF）級(jí)5 周齡雄性BALB/c 小鼠（上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司），小鼠H22 肝癌細(xì)胞株（中科院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心），二棕櫚酰磷脂酰膽堿（DPPC）、二棕櫚?；字Ｒ掖及罚―PPE）（日本精化株式會(huì)社），鹽酸阿霉素（大連美侖生物技術(shù)有限公司），六氟化硫（SF6）（安徽強(qiáng)源氣體公司），磷酸緩沖液（PBS）、1640 培養(yǎng)基（RPMI）（美國HyClone 公司），胎牛血清（FBS）（美國Gibco 公司），兔抗鼠CD31、Ki-67 抗體（美國CST 公司），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（杭州大衛(wèi)科教儀器公司），超聲細(xì)胞破碎儀（美國Spring 科學(xué)公司），Zeta 電位及粒度分析儀（美國Brookhaven 儀器公司），UV-3600 紫外分光光度計(jì)（日本島津公司），BX53 光學(xué)顯微鏡（日本Olympus 公司），高速離心機(jī)、KY-2000 MWA 儀（南京康友醫(yī)療科技公司），WED-100 超聲治療儀（深圳市威爾德醫(yī)療電子公司）。

1.2 微泡制備與檢測(cè)

取DPPC 25 mg 和DPPE 10 mg 溶解于10 mL甲醇與三氯甲烷（2∶3）混合液，取10 mg 阿霉素溶解于3 mL 雙蒸水，磷脂類混合液與阿霉素溶液經(jīng)聲振儀混勻后倒入圓底燒瓶，負(fù)壓蒸發(fā)后形成脂質(zhì)膜；向燒瓶中加入PBS 2 mL，聲振儀震蕩后附壁脂質(zhì)膜洗脫于PBS 中形成混懸液，吸取混懸液至5 mL U 型管，置于充滿SF6的超聲細(xì)胞破碎儀內(nèi)，經(jīng)高頻振蕩形成微泡；300 r/s 離心10 min 后收集表層微泡溶解于PBS，所得即為載阿霉素微泡，同法制備空白無載藥微泡。 光學(xué)顯微鏡下觀察微泡形態(tài)，Zeta 分析儀檢測(cè)載阿霉素微泡粒徑分布和平均電位。 配制阿霉素標(biāo)品梯度濃度溶液，紫外分光光度計(jì)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過檢測(cè)載藥微泡制備過程收集的游離液中藥物含量，計(jì)算載藥微泡包封率（EE）、載藥量（DL）。EE＝（質(zhì)量總阿霉素-質(zhì)量游離阿霉素）/質(zhì)量總阿霉素×100%；DL＝（質(zhì)量總阿霉素-質(zhì)量游離阿霉素）/質(zhì)量磷脂×100%。

1.3 體外細(xì)胞流式實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)H22 肝癌細(xì)胞培養(yǎng)于6 孔板內(nèi)（每孔細(xì)胞5×106個(gè)，完全培養(yǎng)液2.5 mL），用移液槍向4 個(gè)孔內(nèi)添加阿霉素溶液（250 μg/mL）各100 μL、8 個(gè)孔內(nèi)添加載阿霉素微泡（1.8×108/mL）各100 μL；用低頻超聲探頭（1.0 MHz，2 W/cm2）向其中4 個(gè)載藥微泡孔輻照3 min，處理后6 孔板置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育4 h； 分開收集經(jīng)上述不同處理的3 組細(xì)胞，PBS 液清洗3 遍，調(diào)整細(xì)胞濃度至5×106/mL 后取500 μL，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)阿霉素自發(fā)紅色熒光強(qiáng)度。

1.4 動(dòng)物模型建立和實(shí)驗(yàn)分組

H22 肝癌細(xì)胞置于含10%FBS 的1640 培養(yǎng)基，在37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)細(xì)胞并調(diào)整其濃度為5×106/mL，于每只實(shí)驗(yàn)鼠右腋皮下注射0.2 mL 細(xì)胞懸浮液，等待成瘤。取荷直徑0.8～1.0 cm 皮下瘤且瘤體形狀規(guī)則的實(shí)驗(yàn)鼠（體重18～22 g）72 只，4%水合氯醛腹腔注射麻醉后行MWA 術(shù)（功率為50 W，消融時(shí)長(zhǎng)20 s，術(shù)后腫瘤周邊殘留活性區(qū)），構(gòu)建不完全消融模型；經(jīng)荷瘤鼠尾靜脈注射超聲對(duì)比劑SF6微泡（聲諾維）0.2 mL，計(jì)算仍有強(qiáng)化的殘余活性區(qū)體積（V）：V（mm3）=V總-V消。 將荷瘤鼠隨機(jī)分為4 組（每組18 只），均在不完全MWA 術(shù)后24 h（0 d）、4 d、8 d、12 d 接受后續(xù)治療——①單純MWA 組（A 組）作為空白對(duì)照，②尾靜脈注射阿霉素溶液（2 mg/kg）0.2 mL（B 組），③注射空白微泡（1.8×108/mL）0.2 mL（C 組），④注射載阿霉素微泡（1.8×108/mL）0.2 mL（D 組），其中C、D組在注射后立即于皮下瘤處放置低頻超聲探頭（1.0 MHz，2 W/cm2）行靶向輻照（占空比50%）3 min擊破微泡。 對(duì)比給藥治療前各組殘余腫瘤體積基線水平。

1.5 描繪腫瘤生長(zhǎng)曲線與生存曲線

記錄每組隨機(jī)抽取的10 只鼠生存時(shí)間，Kaplan-Meier 法繪制生存曲線。 采用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法比較各組平均生存期和最大生存期并分析結(jié)果。 每組中再隨機(jī)抽取4 只鼠，實(shí)驗(yàn)24 h 起每3 天用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤長(zhǎng)短徑，計(jì)算腫瘤體積（TV）：TV（mm3）＝（長(zhǎng)×寬2）/2，描繪腫瘤生長(zhǎng)曲線，比較各組治療方案抑制腫瘤生長(zhǎng)效果。

1.6 組織內(nèi)藥物濃度檢測(cè)

每組余下4 只小鼠于末次給藥治療后24 h 處死，剝?nèi)⌒呐K和腎臟；0.9%氯化鈉溶液擦凈組織表面后稱重、剪碎，研磨均勻后用0.9%氯化鈉溶液定容，配制10%均漿；超聲破碎儀處理30 min 后，離心取上清液，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)阿霉素含量。

1.7 免疫組化染色

處死B 組、D 組鼠，立即剝離腫瘤大體標(biāo)本，4%多聚甲醛溶液固定24 h；組織切片，行蘇木精-伊紅（HE）染色，CD31、Ki-67 免疫組化染色。 CD31 將血管內(nèi)皮細(xì)胞染成棕黃色，20 倍鏡下分別由5 人各計(jì)數(shù)5 個(gè)視野，取平均值作為該標(biāo)本微血管密度（MVD）值。 Ki-67 染色后細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒記為陽性細(xì)胞，低倍鏡下選擇每張切片中“高熱點(diǎn)”靶區(qū)，從中隨機(jī)選擇5 個(gè)高倍鏡視野，計(jì)數(shù)1 000 個(gè)腫瘤細(xì)胞內(nèi)陽性細(xì)胞數(shù)并算出百分?jǐn)?shù)，取平均值（%）作為Ki-67 增殖指數(shù)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 連續(xù)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，不同組間比較用單因素方差分析和多重比較，兩組均數(shù)間比較用t 檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

制備的微泡觀察顯示，光鏡下可見分散、粒徑大小較均勻的球形微泡（圖1①），Zeta 粒徑儀檢測(cè)顯示微泡平均粒徑（2.93±0.012） μm（圖1②），平均電位（-2.72±0.26） eV。 紫外分光光度計(jì)法計(jì)算顯示，載阿霉素微泡包封率為（88.65±5.60）%，載藥量為（25.33±4.20）%。

圖1 球形微泡觀察和粒徑檢測(cè)情況

流式細(xì)胞儀檢測(cè)腫瘤細(xì)胞紅色熒光強(qiáng)度顯示，阿霉素溶液處理、經(jīng)低頻超聲輻照的載阿霉素微泡處理的腫瘤細(xì)胞相對(duì)熒光強(qiáng)度分別為6.92±1.42、13.66±3.44，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.011）；載阿霉素微泡處理的腫瘤細(xì)胞相對(duì)熒光強(qiáng)度僅為4.73±2.68，明顯低于經(jīng)輻照的載阿霉素微泡處理的細(xì)胞（P=0.006），見圖2。

不完全消融鼠模型構(gòu)建后，A、B、C、D 組皮下瘤殘余活性區(qū)平均體積分別為（54.31±14.70） mm3、（63.91±17.30） mm3、（57.82±21.60） mm3、（66.27±15.40）mm3，4 組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖3。

荷瘤小鼠腫瘤體積測(cè)量顯示，實(shí)驗(yàn)第15 天A、B、C、D 組分別為 （1 562.3±176.9） mm3、（1 374.5±133.5）mm3、（1 511.3±231.4）mm3、（1 070.8±138.7）mm；D 組與A 組相比差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.0085），B 組、C 組與A 組相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.456，P=0.975）；可見D 組與其他3 組相比，在抑制腫瘤生長(zhǎng)方面有優(yōu)勢(shì)（圖4①②）。 A、B、C、D 組生存時(shí)間分別為（28.40±2.02） d、（39.10±3.19） d、（31.50±2.06）d、（42.10±3.67） d，B 組、D 組與A 組相比差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.009，P=0.003），但B、D組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.324），C 組與A 組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.292）（圖4③）。 t 檢驗(yàn)分析B、D 組心、腎組織內(nèi)阿霉素濃度顯示，兩組間心、腎組織內(nèi)藥物濃度差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P心=0.001，P腎=0.014）（表1）；結(jié) 果 顯 示D 組 與B 組相比，可明顯降低心、 腎組織內(nèi)藥物濃度（圖4④）。

圖2 不同處理后腫瘤細(xì)胞相對(duì)熒光強(qiáng)度值不同表示細(xì)胞內(nèi)藥物濃度存在差異

圖3 不完全消融鼠模型構(gòu)建后皮下瘤殘余活性區(qū)體積計(jì)算結(jié)果

圖4 消融后荷瘤小鼠腫瘤體積、生存時(shí)間和和末次治療后藥物濃度

表1 D 組、B 組心、腎組織藥物濃度對(duì)比

腫瘤標(biāo)本常規(guī)HE 染色切片光鏡觀察發(fā)現(xiàn)，A、B、C 組腫瘤細(xì)胞排列較D 組紊亂，A 組內(nèi)可見多個(gè)癌巢，且細(xì)胞核大深染、異型性明顯；B、C、D 組未消融區(qū)邊緣腫瘤組織內(nèi)可見壞死區(qū)域，其中D 組壞死區(qū)域面積較大，且微血管擴(kuò)張、血管壁不完整、管腔內(nèi)可見血栓形成，而微血管內(nèi)血栓形成現(xiàn)象在C 組中較少見到，A、B 組中均未見（圖5①）。 A、B、C、D組殘存活性腫瘤組織區(qū)內(nèi)平均MVD 分別為（36.6±7.16）個(gè)、（28.0±4.36）個(gè)、（19.2±4.82）個(gè)、（13.8±4.97）個(gè)，D 組與A 組、B 組差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.000 1，P=0.004），C 組與A 組差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.000 1），C 組與D 組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.420）（圖5①②）。 200 倍光鏡下分別統(tǒng)計(jì)4 組小鼠Ki-67 增殖指數(shù)，A、B、C、D 組分別為6.10±1.55、2.76±0.69、5.12±0.89、2.40±0.72，B、D 組與A 組差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），表明抑制腫瘤細(xì)胞增殖效果明顯；C 組與A 組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（圖5①③）。

圖5 免疫組化染色結(jié)果

3 討論

諸多臨床研究表明，MWA 治療巨塊型（＞10 cm）肝癌與RFA 相比雖具有升溫快速、受熱沉淀效應(yīng)影響小的優(yōu)勢(shì)，但仍有一定的術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率［8］。為進(jìn)一步降低消融術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移率，提高姑息性治療中減瘤效果，國內(nèi)外學(xué)者近年嘗試應(yīng)用各種消融聯(lián)合其他治療新策略。 Zhu 等［9］研究報(bào)道MWA 聯(lián)合免疫抑制劑治療小鼠乳腺癌。 Li 等［10］報(bào)道在兔VX2 肝腫瘤中觀察RFA 聯(lián)合SF6微泡的治療效果。

阿霉素是臨床常用抗腫瘤藥物，廣泛應(yīng)用于實(shí)體瘤治療。 作為廣譜抗腫瘤藥物，阿霉素經(jīng)靜脈注射后半衰期較短，腫瘤局部藥物濃度較低，抗腫瘤療效受限，且其特異性差，心臟、腎臟不良反應(yīng)不可忽視，故在實(shí)際應(yīng)用中不推薦全身給藥［11-12］。近年化療藥物靶向轉(zhuǎn)運(yùn)載體系統(tǒng)研制應(yīng)用，使阿霉素靶向治療肝癌效果進(jìn)一步提高、藥物不良反應(yīng)減少成為可能。 低頻超聲靶向擊破載藥微泡，彌補(bǔ)了微泡作為轉(zhuǎn)運(yùn)載體時(shí)缺乏特異性的缺點(diǎn)［13-15］，而根據(jù)載藥微泡所載藥物理化性質(zhì)和微泡脂質(zhì)外殼構(gòu)成不同，載藥微泡載藥率、包封率、粒徑及穩(wěn)定性等均會(huì)發(fā)生變化。 本實(shí)驗(yàn)在參考其他文獻(xiàn)報(bào)道的載藥微泡和載阿霉素脂質(zhì)體制備基礎(chǔ)上，根據(jù)阿霉素具有脂溶性、帶負(fù)電荷等特性，采用創(chuàng)新的實(shí)驗(yàn)方法制備出具有合適粒徑、較其他文獻(xiàn)中載藥量和包封率高的載阿霉素微泡，且在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步驗(yàn)證了其抗腫瘤效果。

前期大量實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果提示，載藥微泡靶向擊破技術(shù)具抗腫瘤原理，可從幾方面解釋。 一是通過微泡“空化效應(yīng)”增加腫瘤細(xì)胞膜通透性，促進(jìn)抗腫瘤藥物局部釋放或吸收；二是利用微泡瞬時(shí)破裂釋放的機(jī)械能，破壞腫瘤內(nèi)新生微血管管壁，形成血栓，減少腫瘤血供；三是利用超聲波熱能或機(jī)械能，誘導(dǎo)免疫相關(guān)生物效應(yīng)［16-18］。 本研究中體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)，經(jīng)低頻超聲輻照的載阿霉素微泡顯著提高腫瘤細(xì)胞內(nèi)化療藥物濃度，無輻照載阿霉素微泡組胞內(nèi)藥物濃度并無增加，間接表明低頻超聲擊破微泡具有產(chǎn)生空化效應(yīng)、 提高細(xì)胞膜通透性的作用；動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示，傳統(tǒng)靜脈給藥（B 組）與靶向擊破載藥微泡（D 組）兩種給藥方式與單純微泡消融（C 組）相比，均顯示出抑制腫瘤生長(zhǎng)、延長(zhǎng)生存期的效果，D 組與B 組間抑制腫瘤生長(zhǎng)、 延長(zhǎng)生存期結(jié)果雖無差異，但D 組在保證抑瘤效果的同時(shí)可有效減少心、腎等非靶向器官組織內(nèi)藥物濃度，降低化療藥物不良反應(yīng)；C 組與D 組病理切片均顯示MWA 不完全的腫瘤邊緣區(qū)域微血管內(nèi)可見血栓形成，D 組為甚；MVD 檢測(cè)差異證實(shí)低頻超聲靶向擊破微泡技術(shù)能影響腫瘤微血管生成。 B、D 兩組與C組在抑制腫瘤生長(zhǎng)、 延長(zhǎng)生存期上均存在差異，可解釋為空白微泡破裂時(shí)產(chǎn)生的效應(yīng)雖能減少腫瘤微血管形成，但在無化療藥物作用于局部情況下，單純靠微泡破裂釋放能量并不能達(dá)到明顯的抑制腫瘤細(xì)胞增殖的效果。 然而微泡轉(zhuǎn)運(yùn)阿霉素并經(jīng)低頻超聲靶向擊破提高腫瘤細(xì)胞內(nèi)藥物濃度后，則表現(xiàn)出較好的抑制腫瘤增殖效果。 Ki-67 增殖指數(shù)與肝癌預(yù)后相關(guān)，A 組和C 組Ki-67 表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，也進(jìn)一步證實(shí)了此推斷。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)為臨床上降低MWA 治療肝癌后腫瘤復(fù)發(fā)率提供了新的聯(lián)合治療思路。 MWA聯(lián)合載藥微泡治療新方案有待臨床試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證，其更深層機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。