馬永紅，朱四元，嚴(yán)理，劉頭明

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所，湖南 長沙 410205）

小RNA（miRNA）是一段長22 bp左右、具有頸環(huán)結(jié)構(gòu)的小分子非編碼RNA，其在生物體內(nèi)含量較rRNA、tRNA、mRNA等主要RNA要低得多。miRNA雖然不編碼蛋白，但具有轉(zhuǎn)錄因子的作用，通過多種酶的剪切加工作用形成成熟的miRNA沉默復(fù)合體后，通過堿基互補(bǔ)配對(duì)靶向沉默mRNA，抑制靶基因的翻譯或靶向降解靶基因，進(jìn)而調(diào)控植物的生長發(fā)育［1-7］、逆境脅迫［8-9］等多種生物過程。例如miR319調(diào)控靶基因TCP4在擬南芥中的表達(dá)，miR319表達(dá)下調(diào)會(huì)使TCP表達(dá)量上升，促進(jìn)了次生壁細(xì)胞的合成，篩管增厚［10］。在番茄中，miR319的過表達(dá)下調(diào)了幾個(gè)TCPs基因，導(dǎo)致小葉變大，葉片邊緣持續(xù)生長，而miR319表達(dá)水平的降低或TCP表達(dá)水平的提高會(huì)使番茄葉片變小。在柑橘中，miR397通過調(diào)控LAC基因調(diào)節(jié)細(xì)胞壁多糖的二次沉積，調(diào)控細(xì)胞壁的形成［11］。對(duì)于miRNA的研究引起生物學(xué)界廣泛關(guān)注。

苧麻（BoehmerianiveaL.Gaud）是一種多年生草本植物，具有宿根性，纖維含量豐富，早期通過抽取纖維制作麻繩等，是中國主要的紡織纖維作物，具有悠久的種植歷史。苧麻作為重要的天然纖維作物，其產(chǎn)量決定因素在于韌皮部，韌皮纖維次生壁的生物合成決定纖維產(chǎn)量。纖維素合成酶是植物纖維合成的關(guān)鍵酶，基于轉(zhuǎn)錄組序列，Liu等［12］發(fā)現(xiàn)苧麻中36個(gè)可能與韌皮纖維發(fā)育相關(guān)的纖維素合成酶基因。miRNA也可能參與了苧麻的韌皮纖維發(fā)育調(diào)控。Wang等［13］構(gòu)建了苧麻纖維伸長、胞壁增厚和端壁溶解階段miRNA表達(dá)譜，并在纖維伸長增厚和端壁溶解階段識(shí)別到298個(gè)miRNA，推測(cè)他們可能與苧麻的纖維發(fā)育相關(guān)。在擬南芥、水稻、柑橘等中也有關(guān)于miRNA調(diào)控纖維發(fā)育功能的報(bào)道，如在擬南芥中，miR397b通過調(diào)控其靶基因AtLAC4的表達(dá)進(jìn)而影響木質(zhì)素的含量，miR397b過表達(dá)株系木質(zhì)素含量降低，次生壁厚度變?。?4］。在陸地棉中，調(diào)控纖維發(fā)育的GhLAC4基因與miR397b的堿基互補(bǔ)區(qū)域發(fā)生了mRNA的切割，也說明了miRNA對(duì)棉花纖維發(fā)育的調(diào)控作用［15］。研究表明，具有較高同源性的基因在不同植物體中可能具有不同的生物學(xué)功能，例如mir397a在番茄中主要參與非生物脅迫過程［16］，而在梨果肉中主要調(diào)控石細(xì)胞的發(fā)育形成［17］。在苧麻中關(guān)于纖維發(fā)育的miRNA研究較少，所以本研究擬針對(duì)苧麻莖皮進(jìn)行miRNA測(cè)序，并進(jìn)行表達(dá)分析，以研究和發(fā)現(xiàn)苧麻中可能與纖維發(fā)育相關(guān)的miRNA，旨在為闡明miRNA在苧麻纖維發(fā)育中的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料處理

苧麻材料為中苧1號(hào)，取自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所試驗(yàn)基地，所取材料均經(jīng)過清水沖洗，取葉（中部葉）、5芽（頂端芽）、頂皮（頂端韌皮部）、中皮（中間韌皮部）、莖（中間木質(zhì)部）、根（根尖）6個(gè)部位迅速轉(zhuǎn)入液氮后移至-80℃冰箱中保存?zhèn)溆茫苑乐筊NA降解。

1.2 RNA提取及RNA純度、產(chǎn)率和完整性檢測(cè)

將0.5 g苧麻組織在液氮中迅速研磨至粉末狀，按照植物RNA提取試劑盒說明書（Takara）的要求提取RNA，-80℃保存。苧麻根部含有大量多糖多酚類物質(zhì)，在研磨樣品后按說明書提取方法二（去除多糖多酚法）進(jìn)行操作。

取1μL RNA樣品，用微量分光光度計(jì)（NANO 100，中國）測(cè)其A260/A280和A260/A230的比值和RNA濃度。取所得的RNA約2μL，加2μL無RNAase的水和1μL 6×loading buffer后制備1.0%的瓊脂凝膠，在1×TBE緩沖液中電泳檢測(cè)總RNA的完整性。

1.3 反轉(zhuǎn)錄及qRT-PCR體系的建立

分別取苧麻6個(gè)部位RNA 1μg，按照cDNA合成試劑盒（TransgenAT311）上的說明書操作進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)體系為 20μL，反應(yīng)條件：30°C 10min，42°C 20min，95°C 5min，反轉(zhuǎn)錄完成后再加無菌水稀釋5倍至100μL。反轉(zhuǎn)錄后的cDNA置于-80℃冰箱保存。

1.4 miRNA測(cè)序以及內(nèi)參基因的選擇

對(duì)中苧1號(hào)苧麻中韌皮部進(jìn)行miRNA的提取、文庫構(gòu)建和高通量測(cè)序，對(duì)miRNA測(cè)得的原始數(shù)據(jù)需進(jìn)行質(zhì)量控制，得到高質(zhì)量序列，為了識(shí)別miRNA，將miRNA序列中的優(yōu)質(zhì)數(shù)據(jù)分別采用AASRA［18］和 CMsearch軟件［19］與 miRbase［20］和 Rfam［21］數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)。通過使用 PIPmiR［22］和默認(rèn)參數(shù)，未匹配到這兩個(gè)數(shù)據(jù)庫的序列被認(rèn)為是新的miRNAs。與已知miRNA數(shù)據(jù)庫miRBase（v21）中的成熟miRNA序列進(jìn)行比對(duì)，完全相同的序列被認(rèn)為是已知miRNA。

所選內(nèi)參基因要具有穩(wěn)定表達(dá)的特性，且與要定量的基因表達(dá)量相近，為了獲得可靠的qPCR結(jié)果，必須為每個(gè)研究物種和需要定量的基因選擇合適的內(nèi)參基因［23］。內(nèi)參基因的穩(wěn)定性取決于樣本和條件，因?yàn)槠r麻沒有完善的qPCR內(nèi)參設(shè)定體系，因此從常用作內(nèi)參的管家基因中選擇18s、ACT、TUB、UBQ4個(gè)基因。設(shè)計(jì)引物，凝膠電泳檢測(cè)引物設(shè)計(jì)是否合適，然后進(jìn)行qPCR檢測(cè)。

在NCBI中查找測(cè)序鑒定到的候選基因的保守序列，用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物（表1）。引物的退火溫度為53～57°C，引物長度為18～21 bp，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為150～250 bp。引物序列由擎科生物有限公司合成，實(shí)時(shí)定量PCR使用的引物見下表1。

表1 qRT-PCR檢測(cè)中基因的引物序列Table 1 Primer sequences of genes in qRT-PCR analysis

1.5 纖維發(fā)育相關(guān)miRNA的靶基因測(cè)定

miRNA為具有負(fù)調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子，其所調(diào)控的靶基因才可能具有實(shí)際調(diào)控纖維發(fā)育的作用，為了進(jìn)一步闡明miRNA調(diào)控纖維發(fā)育的生物學(xué)機(jī)制，取苧麻韌皮部轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行測(cè)序，構(gòu)建RNA文庫并進(jìn)行高通量測(cè)序，根據(jù)miRNA與靶基因堿基互補(bǔ)配對(duì)高度的保守性進(jìn)行具有差異表達(dá)的miRNA的靶基因預(yù)測(cè)。常用的靶基因預(yù)測(cè)軟件有TAPIR［24］和TargetFinder［25］，參數(shù)設(shè)置為默認(rèn)參數(shù)。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量

PCR試劑采用Transgen公司的熒光定量PCR試劑盒，采用SYBRGreen熒光染料法在CFX96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行定量。按照說明書進(jìn)行操作，選取管家基因18s為內(nèi)參基因。PCR體系按照TB GreenPremix酶（Transgen公司）說明書的要求設(shè)置，對(duì)6個(gè)部位進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)，體系為20μL，擴(kuò)增程序95℃預(yù)變性3 min，40個(gè)循環(huán)的程序?yàn)?5℃變性30 s，62℃退火30 s，72℃延伸30 s。

1.7 數(shù)據(jù)處理

采用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析，CFX96分析軟件制作擴(kuò)增曲線。用BestKeeper軟件分析內(nèi)參基因表達(dá)的穩(wěn)定性。相對(duì)表達(dá)量的計(jì)算以18s為內(nèi)參基因，計(jì)算Ct值（Ct代表目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物達(dá)到設(shè)定閾值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)），參照魏敏［26］計(jì)算方法，得到RQ值（表達(dá)量變化倍數(shù)）。即通過計(jì)算 ΔCt（ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參），獲得 ΔΔCt（ΔΔCt=ΔCt（實(shí)驗(yàn)組）-ΔCt（對(duì)照組），再計(jì)算RQ值（RQ=2-ΔΔCt），取3次生物學(xué)重復(fù)的平均值作為該基因在該處理組的表達(dá)量，并計(jì)算RQ的誤差。

2 結(jié)果與分析

2.1 苧麻中的miRNA測(cè)序

通過對(duì)苧麻韌皮部miRNA的測(cè)序，在苧麻韌皮部共計(jì)378個(gè)miRNA中，將測(cè)序序列進(jìn)行注釋，共鑒定出176個(gè)已知miRNA和202個(gè)新miRNA，為了研究miRNA在苧麻不同部位是否具有表達(dá)差異，選定了3個(gè)在模式生物中同源且與纖維發(fā)育相關(guān)的常見miRNA進(jìn)行了實(shí)時(shí)定量PCR檢驗(yàn)，分別為miR828、miR166和miR156。

2.2 纖維發(fā)育相關(guān)miRNA的靶基因預(yù)測(cè)

通過與擬南芥同源序列對(duì)比發(fā)現(xiàn)有許多和擬南芥一致的靶標(biāo)，如HDZIP基因、MYB基因、NAC基因等，被miRNA（分別為miR166、miR828、miR156）靶向調(diào)控，具體見表2。而擬南芥中的HDZIP基因、MYB基因、NAC基因具有調(diào)控纖維發(fā)育的功能，由于miRNA具有反向調(diào)控靶基因表達(dá)的作用，通過抑制靶基因的表達(dá)調(diào)控植物生長發(fā)育。在擬南芥纖維發(fā)育過程中，莖頂端miRNA基因的表達(dá)量高，從而抑制靶基因的程度也高，在莖中部，miRNA基因表達(dá)量降低，使靶基因表達(dá)量上升，從而引起次生壁細(xì)胞發(fā)生增厚或增多，莖稈增粗，纖維量增加［27］。推測(cè)在苧麻中miRNA表達(dá)也具有這種規(guī)律性。

表2 miRNA靶基因功能注釋Table 2 Functional annotation ofmiRNA target genes

2.3 苧麻內(nèi)參基因的分析

對(duì)4對(duì)候選內(nèi)參基因18s、ACT、TUB和UBQ進(jìn)行測(cè)試，Ct值在6～37，表達(dá)豐度分布范圍較廣（圖1）。由此可初步判斷，18s和ACT表達(dá)較為穩(wěn)定，TUB和UBQ表達(dá)差異較大。通過比較兩個(gè)基因的變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）和平均標(biāo)準(zhǔn)偏差（standard deviation，SD）來確定基因的穩(wěn)定性［28］。一般穩(wěn)定的內(nèi)參基因具有較低的SD值和CV值。而SD的臨界值為1.5，若SD＞1.5，則表明穩(wěn)定性較差［29］。但是在對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行校準(zhǔn)時(shí)，不僅要求所用內(nèi)參基因的表達(dá)水平穩(wěn)定，而且要求其穩(wěn)定的表達(dá)，與目標(biāo)基因的表達(dá)量相近，表達(dá)量過高或過低，都可能導(dǎo)致定量結(jié)果出現(xiàn)明顯偏差［30］。由表3可知，18s在不同部位中表達(dá)量較為穩(wěn)定，為了保證試驗(yàn)的準(zhǔn)確性，選定18s作為標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)參，取相對(duì)變量。

圖1 苧麻內(nèi)參基因的Ct值分布Fig.1 Distribution of Ct values of reference genes in ramie

表3 4個(gè)候選內(nèi)參基因在苧麻不同部位的表達(dá)穩(wěn)定性Table 3 The expression stability of 4 candidate internal reference genes in different tissues of ramie

2.4 miRNA中miR156、miR166和miR828的表達(dá)分析

對(duì)miR156、miR166和miR828進(jìn)行定量分析，得到溶解度曲線見圖2，采用表達(dá)量變化倍數(shù)（RQ值）對(duì)3個(gè)mirRNA基因在中苧1號(hào)不同部位的表達(dá)情況進(jìn)行分析。以中苧1號(hào)根的表達(dá)量作為對(duì)照，設(shè)定表達(dá)量為1。由圖3可知，miR828、miR166和miR156在頂皮和芽中表達(dá)量較高，miR828在芽中表達(dá)量最高，miR166其次，miR156最低。miR828、miR166和miR156在頂端韌皮部中表達(dá)量高，miR828表達(dá)量最高，miR156其次，miR166最低。miR828、miR166和miR156在苧麻的葉、莖和根中表達(dá)量均較低。

圖2 苧麻中miR828、miR166和miR156擴(kuò)增曲線Fig.2 Amplification curves of miR828，miR166 and miR156 in ramie

圖3 候選基因在中苧1號(hào)不同部位的相對(duì)表達(dá)量Fig.3 The relative expression levels of candidate genes at different sites of Zhonghu No.1

2.5 纖維發(fā)育相關(guān)miRNA鑒定

將miRNA在頂皮和中皮兩個(gè)部位進(jìn)行定量表達(dá)見圖4，由圖4可以看出，3個(gè)miRNA在頂皮中的表達(dá)量要顯著高于中皮，也進(jìn)一步證明其與苧麻纖維發(fā)育相關(guān)。

圖4 miRNA在頂皮和中皮的表達(dá)差異Fig.4 Expression differences of miRNA in the apical and mesothelial

苧麻頂端韌皮部與中間韌皮部中的纖維發(fā)育差異明顯，中皮纖維處于生長期，次生壁處于正在加厚或增厚結(jié)束時(shí)期，而頂皮纖維處于剛開始生長期，纖維發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)必定活躍。

3 結(jié)論與討論

本研究在苧麻中共檢測(cè)到378個(gè)miRNA，其中包括176個(gè)已知miRNA和202個(gè)新miRNA。Wang等［31］對(duì)苧麻纖維發(fā)育莖皮中miRNA的表達(dá)譜進(jìn)行了表征，得到51個(gè)具有差異表達(dá)的miRNA?？梢?，本研究中識(shí)別的miRNA數(shù)量上更加全面和豐富。在所選的4個(gè)管家基因中，18s在苧麻各個(gè)部位都能夠穩(wěn)定表達(dá)，建議在苧麻研究中作為內(nèi)參基因。在測(cè)定的378個(gè)miRNA中選取的3個(gè)miRNA經(jīng)實(shí)時(shí)定量PCR鑒定，在韌皮部頂端和中部具有差異表達(dá)。而頂端韌皮和中部韌皮主要存在纖維發(fā)育方面的差距。在模式植物擬南芥中miRNA具有調(diào)控纖維發(fā)育的作用，如miR319可以通過靶向調(diào)控TCP4轉(zhuǎn)錄因子激活次生壁的生物合成。miR319過表達(dá)導(dǎo)致莖中TCP4豐度降低和次生壁的形成，表明miR319介導(dǎo)TCP4發(fā)育過程中次生細(xì)胞的生物合成［32］。據(jù)此，推測(cè)苧麻中miRNA具有調(diào)控纖維發(fā)育的作用。

在擬南芥的纖維組織中，Yang等［33］發(fā)現(xiàn)MYB26過表達(dá)會(huì)引起木質(zhì)素的異位沉積，導(dǎo)致表皮纖維組織次生增厚。并發(fā)現(xiàn)在兩個(gè)NAC結(jié)構(gòu)域基因NAC次生壁促因子1（NST1）和NST2的表達(dá)也發(fā)生了變化，這兩個(gè)基因與花藥內(nèi)膜的次生增厚有關(guān)。NAC基因作為MYB26基因的上游基因，共同調(diào)控了纖維組織次生壁的增厚。擬南芥基因組包含47個(gè)HDZIP基因，具有調(diào)控纖維發(fā)育的作用。薛宇［34］比較不同發(fā)育時(shí)期棉纖維的表達(dá)譜深度測(cè)序數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)大量HD-Zip家族基因可能參與棉纖維發(fā)育過程。這說明MYB、NAC和HDZIP在纖維發(fā)育中具有重要調(diào)控作用。

在本研究中，通過生物信息學(xué)預(yù)測(cè)miR166、miR828和miR156分別靶向調(diào)控MYB、NAC和HDZIP基因。通過對(duì)比擬南芥同源序列發(fā)現(xiàn)，具有纖維發(fā)育相關(guān)的HDZIP基因、MYB基因、NAC基因的同源基因被miRNA（分別為miR166、miR828、miR156）靶向調(diào)控。一般來說，如果預(yù)測(cè)的靶基因具有調(diào)控苧麻纖維發(fā)育的作用，那么莖頂端miRNA基因的表達(dá)量高，從而抑制靶基因的程度也高，在莖中部，miRNA基因表達(dá)量降低，會(huì)使靶基因表達(dá)量上升，從而會(huì)引起次生壁細(xì)胞發(fā)生增厚或增多，莖稈增粗，導(dǎo)致苧麻纖維量增加。而HDZIP基因、MYB基因［35］和NAC基因在擬南芥等模式生物中對(duì)纖維發(fā)育的調(diào)控作用已被證實(shí)。MYB作為一類轉(zhuǎn)錄因子廣泛參與木質(zhì)部中木質(zhì)素、細(xì)胞壁的合成。這說明miR166、miR828、miR156可能通過調(diào)控MYB、NAC和HDZIP基因來進(jìn)一步參與到苧麻纖維發(fā)育的生物網(wǎng)絡(luò)中去。本研究只對(duì)miRNA在苧麻不同部位的表達(dá)進(jìn)行了定量分析，表明miRNA可能通過調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)來調(diào)控苧麻纖維發(fā)育。對(duì)于以上推測(cè)需要對(duì)預(yù)測(cè)靶基因的表達(dá)量開展進(jìn)一步的研究。因此，本研究為探究miRNA在苧麻纖維發(fā)育調(diào)控中的功能奠定了基礎(chǔ)。