趙秀平，王 雙，閆星伊，段 強(qiáng)，張 帥，陳永勝，李國(guó)瑞

(內(nèi)蒙古民族大學(xué) 生命科學(xué)與食品學(xué)院，內(nèi)蒙古自治區(qū)高校蓖麻產(chǎn)業(yè)工程技術(shù)研究中心，內(nèi)蒙古自治區(qū)蓖麻育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古自治區(qū)蓖麻產(chǎn)業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，蓖麻產(chǎn)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新內(nèi)蒙古自治區(qū)工程研究中心，內(nèi)蒙古 通遼 028043)

水稻是重要的糧食作物，在我國(guó)有超過(guò)60%的地區(qū)以稻米為主食[1-2]。稻瘟病是水稻破壞性最強(qiáng)的病害之一，可造成水稻在世界范圍內(nèi)年減產(chǎn)至少10%，大規(guī)模發(fā)病時(shí)可引發(fā)絕產(chǎn)[3-5]。稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)是一種絲狀子囊菌，可引發(fā)水稻患稻瘟病，嚴(yán)重影響水稻的產(chǎn)量和品質(zhì)[6-7]。該病菌也可附著在谷子、小麥等多種重要經(jīng)濟(jì)作物植株表面侵染致病[8-10]，其具有絲狀病菌的典型特征，已成為絲狀病原菌相關(guān)研究的模式生物[11]。因此，與稻瘟病菌生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的研究均具有重要意義。

MGG-01005是與稻瘟病菌的菌絲生長(zhǎng)相關(guān)的基因，其所編碼的蛋白屬于Tctex-1家族成員。有研究表明，缺失該基因會(huì)導(dǎo)致稻瘟病菌的菌絲生長(zhǎng)緩慢，并且它不依賴動(dòng)力蛋白調(diào)節(jié)菌絲生長(zhǎng)，該基因的59～65區(qū)段可能與菌絲生長(zhǎng)相關(guān)[12-13]。動(dòng)力蛋白由重鏈、中鏈和輕鏈等組分組成，Tctex-1是在細(xì)胞質(zhì)和鞭毛動(dòng)力蛋白中發(fā)現(xiàn)的輕鏈，是動(dòng)力蛋白輕鏈中的一種[13-14]。Tctex-1不存在于植物體中，最初因其突變體可導(dǎo)致雄性不育，被確定為參與動(dòng)力蛋白復(fù)合體的組裝[15]。Tctex-1是由2個(gè)α-螺旋和4個(gè)β-鏈構(gòu)成的同源二聚體[16]，參與許多基本的細(xì)胞活動(dòng)過(guò)程：可與包括動(dòng)力蛋白中間鏈、視紫紅質(zhì)、Fyn和Trk激酶等在內(nèi)的眾多細(xì)胞質(zhì)蛋白相互作用[13]；在病毒發(fā)病機(jī)制中扮演重要角色[17]；參與纖毛形成與伸長(zhǎng)的調(diào)控等[18]。

本研究利用生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測(cè)了MGG-01005的一般理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)域、功能位點(diǎn)等基本特性，成功構(gòu)建了原核表達(dá)載體pETM13-MGG-01005，利用IPTG誘導(dǎo)該重組蛋白表達(dá)，并通過(guò)鎳離子親和層析、陰離子交換層析以及分子篩層析進(jìn)行蛋白純化，以期為該蛋白的功能以及稻瘟病菌的后續(xù)相關(guān)研究提供一定的理論與實(shí)踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

本實(shí)驗(yàn)使用的MGG-01005的氨基酸序列來(lái)自Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)，種間聚類分析的多物種氨基酸序列來(lái)自NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)。大腸埃希菌表達(dá)載體pETM13，由本實(shí)驗(yàn)室提供；大腸埃希菌克隆菌株DH5α及表達(dá)菌株E.coliBL21(DE3)的感受態(tài)細(xì)胞，購(gòu)自北京莊盟國(guó)際生物科技有限公司。

1.1.2 主要試劑

IPTG、AMP、Tris-HCl、NaCl、SDS、咪唑，Amersco公司；蛋白質(zhì)Marker，TaKaRa公司；Ni sepharose 4FF、Resource Q、SuperdexTM75 increase 10/300 GL，GE生命科學(xué)部。

1.2 儀器與設(shè)備

瓊脂糖凝膠成像系統(tǒng)、SDS-PAGE電泳儀，伯樂(lè)生物技術(shù)有限公司；蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)(KTA purifierTM UPC-10)、蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)(KTA purifierTM 10)，GE Healthcare。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 生物信息學(xué)分析

利用在線軟件ExPASy-ProtParam(https://web.expasy.org/protparam)和Prot Scale(http://web.expasy.org/protscale/)分析MGG-01005的一般理化性質(zhì)及親疏水性[19-21]；使用NCBI Blastp 在線分析MGG-01005的保守結(jié)構(gòu)域和序列同源性[22]；在線軟件ExPASy Prosite(http://prosite.expasy.org/)預(yù)測(cè)MGG-01005結(jié)構(gòu)功能位點(diǎn)[23-24]；在線軟件TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/)和Signal P(http://www.cbs.dtu.dk/services/Signal p)預(yù)測(cè)MGG-01005跨膜結(jié)構(gòu)域和信號(hào)肽位點(diǎn)[25-26]；在線軟件NetPhos 3.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/)預(yù)測(cè)MGG-01005的潛在磷酸化位點(diǎn)[27]；在線軟件SOPMA(http://npsa-prabi.ibcp.fr/)和Phyre 2(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) 預(yù)測(cè)MGG-01005的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)[28-30]；MEGA7.0.軟件采用鄰接法(N-J法)建立系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)進(jìn)行聚類分析，修改部分參數(shù)：在Test of Phylogeny選擇Bootstrapmethod；No.of Bootstrap replications輸入2000；Mode/Method選擇Poisson model；Rates among sites選擇Uniform rates；Gaps/Missing Data Treatment選擇Compele deletion[31]。

1.3.2 pETM13-MGG-01005蛋白的構(gòu)建

根據(jù)MGG-01005基因序列設(shè)計(jì)引物，克隆MGG-01005基因；用Sticky-End法將MGG-01005基因與表達(dá)載體pETM13連接形成重組表達(dá)載體pETM13-MGG-01005，通過(guò)熱激法將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌克隆菌株DH5α，對(duì)重組子進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)并將陽(yáng)性質(zhì)粒測(cè)序[7]。

1.3.3 pETM13-MGG-01005蛋白表達(dá)與純化

將重組蛋白pETM13-MGG-01005熱激轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)中。在含100 μg·mL-1氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中37 ℃、220 r·min-1振搖8 h，培養(yǎng)至D600為0.5～0.6。以0.1 mmol·L-1IPTG為誘導(dǎo)劑，18 ℃、180 r·min-1誘導(dǎo)16 h后收集菌體[32-33]。菌體重懸液中加入裂解緩沖液(20 mmol·L-1Tris-HCl，pH 8.0，500 mmol·L-1NaCl)經(jīng)超聲裂解后得到蛋白粗提液，15 000 r·min-1離心后，上清過(guò)Ni-親和柱，用20 mmol·L-1Tris-HCl，500 mmol·L-1NaCl，濃度梯度為20～300 mmol·L-1(20、40、60、80、100、200、300 mmol·L-1)的咪唑緩沖液洗脫結(jié)合蛋白，將含有大量蛋白的咪唑洗脫液使用截留相對(duì)分子質(zhì)量為3 ku的濃縮管進(jìn)行適當(dāng)濃縮[34-35]。根據(jù)該蛋白的理論等電點(diǎn)，選用ResourceTMQ離子交換層析柱進(jìn)一步純化(A泵緩沖液為20 mmol·L-1Tris-HCl，pH 8.0；B泵緩沖液為20 mmol·L-1Tris-HCl，pH 8.0，1.0 mol·L-1NaCl)[36]。純化前需進(jìn)行脫鹽處理，緩沖液為20 mmol·L-1Tris-HCl，pH 8.0。純化后再次濃縮洗脫液。最后進(jìn)行分子篩層析純化，選用SuperdexTM75 10/300GL層析柱，緩沖液為20 mmol·L-1Tris-HCl，pH 8.0，150 mmol·L-1NaCl[37]。收集高含量洗脫液濃縮至8 mg·mL-1，-20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｒ陨喜僮鹘Y(jié)果均使用SDS-PAGE進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物信息學(xué)結(jié)果分析

2.1.1 一般理化性質(zhì)分析

通過(guò)在線軟件ExPASy-ProtParam 分析MGG-01005的一般理化性質(zhì)。數(shù)據(jù)結(jié)果表明：該蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為16 471.49 u，編碼153個(gè)氨基酸，包含20種不同氨基酸；不穩(wěn)定指數(shù)為40.58，平均親和性為-0.443，表明該蛋白為不穩(wěn)定親水性蛋白，與在線軟件Prot Scale分析結(jié)果一致(圖1)，其等電點(diǎn)為6.27，正電荷殘基數(shù)(Arg+Lys)14個(gè)，負(fù)電荷殘基數(shù)(Asp+Glu)16個(gè)，總原子數(shù)2 285個(gè)，脂肪指數(shù)67.06。

2.1.2 保守結(jié)構(gòu)域及功能位點(diǎn)分析

通過(guò)NCBI blastp分析MGG-01005的保守結(jié)構(gòu)域，結(jié)果表明：此蛋白含有Tctex-1保守結(jié)構(gòu)域，屬于Tctex-1家族(圖2)。ExPASy Prosite預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)功能位點(diǎn)的結(jié)果為無(wú)活性位點(diǎn)。

2.1.3 跨膜結(jié)構(gòu)域及磷酸化位點(diǎn)分析

使用在線軟件TMHMM和Signal P對(duì)MGG-01005進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)域和信號(hào)肽預(yù)測(cè)，結(jié)果表明：該蛋白無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)和明顯信號(hào)肽(圖3)。利用在線軟件NetPhos 3.1預(yù)測(cè)MoMGG-01005的潛在磷酸化位點(diǎn)，表明：MGG-01005具有23個(gè)磷酸化位點(diǎn)，分別為14個(gè)絲氨酸(Serine)、8個(gè)蘇氨酸(Threonine)和1個(gè)酪氨酸(Tyrosine)(圖4)。

圖1 蛋白親疏水性分析Fig.1 Analysis of Protein Hydrophilicity and Hydrophobicity

圖2 蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)Fig.2 Protein conserved domain mapping

圖3 蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)Fig.3 Protein transmembrane structure diagram

圖4 蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)Fig.4 Prediction of protein phosphorylation sites

圖5 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.5 Protein secondary structure prediction

2.1.4 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析

通過(guò)在線軟件SOPMA和Phyre 2預(yù)測(cè)MGG-01005的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明：該蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)包括α-螺旋(Alpha helix)、延伸鏈(extended strand)、β-轉(zhuǎn)角(Beta turn)和無(wú)規(guī)則卷曲(random coli)，分別占總氨基酸的31.37%、13.73%、4.48%和50.33%(圖5)；三級(jí)結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖6。

圖6 蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.6 Protein tertiary structure prediction

2.1.5 同源性分析及聚類分析

通過(guò)NCBI blastp對(duì)MGG-01005進(jìn)行物種間同源性分析，經(jīng)ClustalX比對(duì)序列后，再使用MEGA7.0軟件建立系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，進(jìn)行聚類分析。NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)提供的諸多序列，從中選取相似度高于80%的序列進(jìn)行聚類分析(共選取8個(gè)序列)。結(jié)果見(jiàn)圖7，MGG-01005與PspLS_03243和動(dòng)力蛋白輕鏈Tctex-1A鏈聚類到一起，表明與這兩個(gè)蛋白親緣關(guān)系更近。

2.2 pETM13-MGG-01005蛋白表達(dá)與純化結(jié)果分析

圖7 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.7 Phylogenetic tree

通過(guò)重組蛋白pETM13-MGG-01005的誘導(dǎo)表達(dá)和NI-親和層析結(jié)果(圖8)可看出，該蛋白可溶于裂解后的上清中，能夠用于后續(xù)蛋白純化。SDS-PAGE檢測(cè)顯示，當(dāng)咪唑濃度為80～300 mmol·L-1時(shí)均可洗脫蛋白，其中80 mmol·L-1可洗脫大量蛋白，但隨咪唑濃度增加，可洗脫蛋白量減少，表明在實(shí)驗(yàn)濃度中80 mmol·L-1為最佳咪唑濃度。洗脫蛋白相對(duì)分子質(zhì)量約為16 ku，與目標(biāo)蛋白大小相符。蛋白脫鹽和離子交換層析的結(jié)果顯示(圖9)，目的蛋白主要存在于脫鹽穿出液B液中，可使用B液進(jìn)行陰離子交換層析純化。純化結(jié)果顯示，該蛋白洗脫峰較單一，帶電性質(zhì)均一且對(duì)低鹽條件具耐受性。SDS-PAGE檢測(cè)顯示，洗脫液A2中蛋白含量最高，但存在少許雜帶，仍需進(jìn)一步純化分析。分子篩結(jié)果顯示(圖10)，該蛋白的洗脫峰形態(tài)單一，對(duì)稱性好，在層析柱約11 mL左右出峰，相對(duì)分子質(zhì)量約為35 ku，與該蛋白相對(duì)分子質(zhì)量所對(duì)應(yīng)的理論出峰位置不符，推測(cè)該蛋白以二聚體形式存在。SDS-PAGE檢測(cè)發(fā)現(xiàn)洗脫液A2中該蛋白含量最高且無(wú)雜帶，本實(shí)驗(yàn)最終成功純化該重組蛋白。

3 討論

稻瘟病菌沒(méi)有特定的發(fā)病時(shí)期和部位，它的菌絲和分生孢子可寄宿在病植體內(nèi)越冬，待次年條件適宜時(shí)可迅速繁殖導(dǎo)致流行病害[38-39]。菌絲生長(zhǎng)可侵染鄰近細(xì)胞使病菌得到擴(kuò)展，其生長(zhǎng)速度影響著病菌致病力和侵染力[40]。目前已有許多研究發(fā)現(xiàn)了與稻瘟病菌菌絲生長(zhǎng)相關(guān)的基因，如缺失MAC1基因會(huì)導(dǎo)致菌絲生長(zhǎng)緩慢；MPS1基因缺失會(huì)導(dǎo)致減少菌絲生長(zhǎng)[41]；轉(zhuǎn)錄因子Pcg1、Pcg2和HOX1、HOX4、HOX6、HOX8的基因缺失均會(huì)抑制菌絲生長(zhǎng)[42-43]。MGG-01005是新發(fā)現(xiàn)的與稻瘟病菌菌絲生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的基因，并且它不依賴動(dòng)力蛋白調(diào)節(jié)菌絲生長(zhǎng)。稻瘟病菌具潛育期短，繁殖速度快并且可遠(yuǎn)距離傳播等特點(diǎn)[39]。目前對(duì)其防治的主要手段是開(kāi)發(fā)化學(xué)藥劑和培育抗病新品種，但該病菌變異能力強(qiáng)，易于產(chǎn)生化學(xué)藥劑抗藥性和新抗病品種抗性[43]。因此，對(duì)稻瘟病菌的發(fā)生、菌絲生長(zhǎng)發(fā)育以及致病的分子機(jī)制的相關(guān)研究對(duì)于稻瘟病的防治具有重要意義。

20～300依次表示洗脫液中咪唑濃度(20、40、60、80、100、200、300 mmol·L-1)。20-300 represented the concentration of imidazole in the elution buffer(20， 40， 60， 80， 100， 200， 300 mmol·L-1)， respectively.圖8 pETM13-MGG-01005 親合層析的SDS-PAGE檢測(cè)Fig.8 Affinity chromatography (Ni-NTA) and SDS-PAGE analysis of pETM13-MGG-01005

M，蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；A-C，脫鹽A-C液；X1-X2，穿出；A1-A4，洗脫液。M， Protein marker; A-C， The liquid of desalt A-C; X1-X2， Protein exudates; A1-A4， Eluents.圖9 pETM13-MGG-01005離子交換層析(Resource Q)及SDS-PAGE檢測(cè)Fig.9 Ion-exchange column chromatography (Resource Q) and SDS-PAGE analysis of pETM13-MGG-01005

M，蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；A1-A4，洗脫液。M， Protein marker; A1-A4， Eluents.圖10 pETM13-MGG-01005分子篩分析(Superdex 75 10/300 GL)及SDS-PAGE檢測(cè)Fig.10 Gel filtration (Superdex 75 10/300 GL) and SDS-PAGE analysis of pETM13-MGG-01005

本研究中通過(guò)對(duì)MGG-01005的表達(dá)純化以及生物信息學(xué)分析結(jié)果表明該蛋白分子量約為16 ku，屬于動(dòng)力蛋白輕鏈Tctex-1家族成員，以二聚體形式存在，此結(jié)果與李國(guó)瑞等[13]的研究結(jié)果一致。在KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中查詢不到MGG-01005參與的相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，因此，該基因具體功能仍暫不明確。對(duì)其進(jìn)行表達(dá)純化以及生物信息學(xué)分析對(duì)于進(jìn)一步研究該基因的功能有一定理論與實(shí)踐意義，可以為今后針對(duì)稻瘟病菌菌絲的生長(zhǎng)發(fā)育以及相關(guān)致病的分子機(jī)制的研究奠定一定的基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究使用生物信息學(xué)技術(shù)，了解到MGG-01005屬于Tctex-1家族成員，相對(duì)分子質(zhì)量約為16 471.49 u，共編碼153個(gè)氨基酸，等電點(diǎn)為6.47。該蛋白不具備跨膜結(jié)構(gòu)和信號(hào)肽，不是分泌蛋白，有23個(gè)磷酸化活性位點(diǎn)。二級(jí)結(jié)構(gòu)含有α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、延伸鏈和無(wú)規(guī)則卷曲。該蛋白可在0.1 mmol·L-1IPTG，18 ℃，180 r·min-1，16 h條件下被誘導(dǎo)表達(dá)。親和層析的最適緩沖液組分為20 mmol·L-1Tris-HCl，500 mmol·L-1NaCl，80 mmol·L-1咪唑。陰離子交換層析表明，該蛋白對(duì)低鹽條件有耐受性；當(dāng)分子篩層析的緩沖液為20 mmol·L-1Tris-HCl，pH 8.0，150 mmol·L-1NaCl時(shí)具有均一對(duì)稱構(gòu)象，洗脫峰出峰位置所對(duì)應(yīng)的蛋白分子量約為35 ku，推測(cè)該蛋白以二聚體形式存在。本研究成功純化并獲得大量重組蛋白，可為進(jìn)一步探索MGG-01005蛋白的功能以及與稻瘟病菌菌絲生長(zhǎng)的相關(guān)研究提供一定的理論與實(shí)踐依據(jù)。