楊冬梅 綜述 邢艷 審校

(川北醫(yī)學院醫(yī)學檢驗系·轉(zhuǎn)化醫(yī)學研究中心，四川 南充 637000)

中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)(Neutrophil extracellular traps，NETs)是由中性粒細胞解體后釋放的DNA、組蛋白及胞漿蛋白形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，是固有免疫系統(tǒng)抵抗感染的重要屏障[1]。NETs形成包括三個關(guān)鍵因素：活性氧(Reactive oxygen species，ROS)產(chǎn)生、組蛋白瓜氨酸化及自噬激活?，F(xiàn)有研究已經(jīng)基本闡明ROS和組蛋白參與NETs形成的機制，而自噬依賴的NETs形成機制近期才受到關(guān)注。細胞自噬是一種程序化的胞內(nèi)降解過程，主要依賴溶酶體降解自身胞質(zhì)成分而實現(xiàn)細胞自身代謝和細胞器更新，以維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。深入研究發(fā)現(xiàn)細胞自噬和中性粒細胞的多種功能有著密切關(guān)聯(lián)，包括中性粒細胞脫顆粒、ROS產(chǎn)生和中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)形成等[2]。本文對中性粒細胞自噬參與NETs形成機制進行綜述，以期為揭示相關(guān)疾病的發(fā)病機制以及探索藥物作用靶點提供參考依據(jù)。

1 中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)

中性粒細胞是人體最豐富的固有免疫細胞，被稱為宿主防御的“前鋒”，在疾病發(fā)生、進展及預(yù)后過程中起關(guān)鍵作用。2004年，Brinkmann等[3]首先發(fā)現(xiàn)用IL-8、佛波肉豆蔻酸酯乙酸酯(phorbol myristate acetate，PMA)或脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激中性粒細胞后，會釋放一種網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，將其稱為NETs。釋放NETs過程被稱為“NETosis”，包括三種類型：①自殺式NETosis，該過程持續(xù)2～4 h，主要依賴Raf/MERK/ERK 信號轉(zhuǎn)導通路激活、肽基精氨酸酶脫氨酶4(PAD4)介導的組蛋白瓜氨酸化以及大量ROS產(chǎn)生[4-5]，導致核染色體解聚，其中NADPH氧化產(chǎn)生的ROS是觸發(fā)NETs形成的必要中間體。②依賴細胞核DNA釋放式NETosis，又稱“真實NETosis”，該過程需5～60 min，不依賴于ROS產(chǎn)生和 Raf/MERK/ERK 信號通路激活，而受Toll樣受體、補體C3和血小板等影響[6]，中性粒細胞通過囊泡形式，將解旋的染色體和組蛋白釋放到胞外組裝成NETs[7]。③依賴線粒體DNA釋放式NETosis，中性粒細胞在補體C5a、LPS等刺激下，快速釋放線粒體DNA參與形成NETs，該過程主要依賴線粒體ROS產(chǎn)生[8-9]。研究[10-13]發(fā)現(xiàn)缺氧、過敏、IL-1等因素可通過調(diào)控自噬/REDD1、RIPK3/MLKL及PAD4等信號途徑，使得中性粒細胞核膜和大量顆粒膜破裂，釋放中性粒細胞彈性蛋白酶、髓過氧化物酶；同時煙酰胺腺嘌呤(NADPH)氧化產(chǎn)生大量ROS，PAD4介導組蛋白瓜氨酸化等，進一步誘導形成NETs[14]。

NETs具有捕獲、殺死和清除各種微生物，包括細菌、真菌、病毒和寄生蟲的作用。然而，當體內(nèi)中性粒細胞釋放NETs過多，如果不能及時被清除，將作為自身抗原參與破壞機體免疫耐受而誘發(fā)自身免疫性疾病，如類風濕性關(guān)節(jié)炎和ANCA相關(guān)性血管炎等[15-16]。此外，NETs還能介導組織因子驅(qū)動血栓形成，導致急性心肌梗死[17]等。

2 自噬

自噬，又稱“自食”，是細胞在能量供應(yīng)不足時通過消化自身代謝廢物來回收營養(yǎng)物的生存機制。自噬始于半圓形膜雙層結(jié)構(gòu)逐漸內(nèi)陷，包裹需要降解的代謝廢物，逐漸形成封閉的自噬小體，再與溶酶體融合形成自溶體，將消化的內(nèi)容物釋放到細胞質(zhì)中用于生物合成，又稱“自噬流”。自噬體是由一些自噬相關(guān)基因(ATG)表達的蛋白組成的復合體，包括Atg5、Atg12、Atg6(beclin-1)、Atg8和Atg12等，其形成過程為Atg5與Atg12結(jié)合形成復合物后，募集游離的LC3(ATG8)與之形成共軛復合物，靶向定位在空泡膜上形成自噬小體，再與Atg6-Atg14L-VPS復合物結(jié)合形成自噬前體復合物(UKL)[18-20]。ULK主要受哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)負調(diào)控，其上游又包括AMPK、PI3K/Akt和MAPK/ERK等多條通路。多種因素通過影響這些信號通路實現(xiàn)對自噬的調(diào)控，如生長因子、胰島素等通過PI3K-Akt信號軸激活mTOR，抑制自噬；應(yīng)激、營養(yǎng)不足條件下經(jīng)AMPK抑制mTOR，上調(diào)自噬，這在很多代謝性疾病和腫瘤相關(guān)研究中得到證實[21-23]。自噬信號通路調(diào)控機制見圖1。

自噬具有“雙向”作用，可發(fā)揮保護性作用或損害性作用。自噬平衡對機體抵抗病原體入侵、調(diào)節(jié)抗原遞呈參與適應(yīng)性免疫反應(yīng)至關(guān)重要，當自噬失衡，入侵的病原體和損傷的細胞器不能被完全清除，可能誘發(fā)自身免疫性疾病。因而體內(nèi)恰當水平的自噬是機體維持正常生理功能的前提。有研究[24]指出中性粒細胞自噬在調(diào)控NETs形成中發(fā)揮重要作用，自噬激活加速NETs形成，早期或中晚期自噬抑制劑可抑制NETs釋放，這充分證明自噬與NETs形成之間存在必然聯(lián)系。

圖1 自噬信號通路圖

3 自噬與NETs

mTOR是自噬調(diào)節(jié)的重要節(jié)點，自噬被活化或是抑制，取決于mTOR上游的作用因子，抑制mTOR信號軸，促進中性粒細胞自噬的同時加速了NETs形成，說明自噬和NETs形成具有協(xié)同關(guān)系。自噬參與NETs形成受多種機制調(diào)控。

3.1 細菌衍生肽作用機制 中性粒細胞可以響應(yīng)內(nèi)外環(huán)境中各種刺激，包括炎癥因子、細胞因子和微生物組分，常見如細菌衍生肽(N-Formylmethionyl-leucyl-phenylalanine, fMLP)、LPS等[25-26]。在中性粒細胞中，fMLP通過與特異性G蛋白偶聯(lián)受體(主要是甲酰肽受體，F(xiàn)PR)結(jié)合，調(diào)控下游mTOR信號分子，介導自噬參與NETs形成。Itakura等[24]發(fā)現(xiàn)當利用特異性自噬誘導劑雷帕霉素處理中性粒細胞，自噬、NETs水平均明顯升高；在雷帕霉素和fMLP共處理下，中性粒細胞自噬水平降低，同時NETs形成速率明顯減慢，表明fMLP可抑制雷帕霉素作用下的自噬激活及NETs形成，fMLP-FPR-mTOR信號軸在介導自噬參與NETs形成中發(fā)揮重要作用。此外，fMLP-mTOR信號軸還能通過影響組蛋白瓜氨酸化影響NETs形成，該過程也需要自噬參與。當中性粒細胞受到各種炎癥刺激后，核膜破裂，染色體裂解成組蛋白及DNA，釋放到胞漿中，經(jīng)PAD4介導的瓜氨酸化的組蛋白是NETs的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)蛋白[27]。Itakura等[24]也發(fā)現(xiàn)雷帕霉素誘導自噬激活的同時組蛋白H3(H3Cit)表達上調(diào)，而fMLP能抑制雷帕霉素誘導下的自噬水平，同時降低組蛋白H3(H3Cit)表達，導致NETs形成速率減慢，表明自噬可通過影響組蛋白瓜氨酸化參與NETs形成，該過程受fMLP- mTOR信號軸負調(diào)控。微管、肌球蛋白、肌動蛋白是細胞骨架的重要組成部分，不僅參與形成NETs的結(jié)構(gòu)骨架，也有利于自噬小體形成及溶酶體融合[28-29]。研究[30]發(fā)現(xiàn)激活mTOR能通過介導肌動蛋白細胞骨架動力學抑制黑素瘤細胞自噬水平，同時抑制NETs形成。由此可見，mTOR信號分子在自噬依賴的NETs中發(fā)揮重要作用。

3.2 PI3K分子作用機制 磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)是重要的信號分子，其中參與調(diào)控自噬主要有Ⅰ類PI3K(PI3K-1)和Ⅲ類 PI3K(PI3K-3)。體內(nèi)胰島素可激活磷脂酰肌醇3激酶1(PI3K-1)，使蛋白激酶(AKT)磷酸化，并與之形成PI3K-1-Akt復合物，該復合物可以進一步促進腫瘤抑制因子TSC2磷酸化，TSC2磷酸化是激活mTOR的先決條件之一[31]，mTOR通過抑制ULK從而阻礙自噬啟動[32]。PI3K-3參與亮氨酸激活mTOR信號通路，當體內(nèi)亮氨酸濃度升高，激活mTOR，抑制自噬發(fā)生[33]。上文中我們已經(jīng)總結(jié)了mTOR調(diào)控自噬參與NETs形成的關(guān)鍵作用，因而推測PI3K-1和PI3K-3可以通過mTOR信號分子調(diào)控自噬參與NETs形成。此外，在mTOR下游，哺乳動物中的PI3K-3(Vps34)，與Vps15、Beclin -1結(jié)合形成復合體[34]，該復合物主要結(jié)合Atg14，參與形成自噬泡。自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)，通過抑制VPS34能有效降低ANCA相關(guān)性血管炎患者中性粒細胞自噬水平和NETs，推測ANCA患者體內(nèi)NETs形成過程依賴自噬，并受PI3K-3調(diào)控[35]。Ma等[36]也發(fā)現(xiàn)用急性早幼粒細胞白血病(APL)患者血漿刺激中性粒細胞后，NETs明顯增加，而自噬抑制劑3-MA作用后可明顯降低該效應(yīng)，表明APL誘導的NETs形成依賴PI3K-3介導的自噬。然而，Germic等[37]的研究否認了這一結(jié)論，該研究發(fā)現(xiàn)3-MA僅能消除暴露于低濃度的PMA介導的NETs水平，而對雷帕霉素刺激下的NETs形成無抑制作用，推測3-MA抑制NETs形成是通過抑制ROS產(chǎn)生，該過程依賴PI3K-1活性[38]，而不依賴自噬，3-MA不僅可以阻斷PI3K-3抑制自噬，也能阻斷PI3K-1活化、降低NADPH氧化酶活性使NETs形成減少。

3.3 自噬基因調(diào)控機制 自噬受多種基因調(diào)控，目前已經(jīng)鑒定出約71種自噬基因[39]，以ATG1、5、6、7、8、12最為重要。近期研究發(fā)現(xiàn)部分自噬基因也參與調(diào)控NETs形成。Xu等[40]通過動物研究發(fā)現(xiàn)成年鼠中TLR樣受體2(Toll-like receptor 2)誘導的NETs形成減少依賴于低水平的ROS和自噬，其中ATG5基因缺陷是自噬參與NETs形成減少的主要原因，當敲低鼠中性粒細胞中的ATG5基因，自噬活性明顯降低且NETs形成速率明顯減慢；該研究還發(fā)現(xiàn)成年鼠中NETs形成減少而凋亡增加可能是自噬調(diào)控的結(jié)果。然而，另一研究[41]發(fā)現(xiàn)在急髓白血病M3細胞株(HL-60)中過表達ATG5，能明顯促進ROS產(chǎn)生，但對自噬和NETs形成均無明顯上調(diào)或抑制作用，提示ATG5依賴的NETs可能受細胞類型差異影響。Ma等[36]的研究也發(fā)現(xiàn)利用小干擾RNA(siRNA)敲低自噬基因ATG7，幾乎完全消除了APL血清誘導下的自噬，并抑制了NETs 形成，表明APL血清誘導的NETs 形成可能也依賴自噬基因ATG7。ATG1(ULK1)調(diào)控NETs形成受mTOR 信號通路上游刺激影響在前文中已經(jīng)闡明，其他特異性自噬基因是否參與NETs形成有待進一步考證。

3.4 PMA/REDD1作用機制 PMA，經(jīng)典NETs誘導劑，誘導NETs形成機制主要依賴ROS產(chǎn)生。研究指出自噬也參與了PMA誘導的NETs形成。Remijsen等[42]發(fā)現(xiàn)利用PMA刺激中性粒細胞后，雙分子層自噬囊泡和自噬標志性蛋白LC3均明顯增多，同時伴隨ROS產(chǎn)生增多；抑制自噬，ROS產(chǎn)生降低，NETs形成減少，而抑制ROS產(chǎn)生同樣阻礙自噬體形成，表明ROS產(chǎn)成和自噬激活之間存在密切的相互依賴關(guān)系，ROS產(chǎn)生介導自噬，反過來，ROS產(chǎn)生也依賴于自噬。ROS產(chǎn)生和自噬激活是PMA誘導的NETs的必要因素，缺一不可，無論抑制自噬或者NADPH氧化，都阻礙了染色體裂解，抑制NETs形成。Wang等[43]研究也發(fā)現(xiàn)利用阿特拉津(Atrazine，ATR)，一種選擇性的除草劑，體外刺激鯉魚中性粒細胞，能抑制ROS產(chǎn)生和自噬激活，明顯降低PMA誘導的NETs形成水平，而該效應(yīng)能被雷帕霉素逆轉(zhuǎn)，再次印證PMA誘導的NETs形成可能依賴于自噬。DNA損失反應(yīng)蛋白1(REDD1)，同樣在自噬依賴的NETs中發(fā)揮重要作用。研究[4]報道在家族性地中海熱患者外周血PMNs中REDD1表達明顯上調(diào)，促進NETs釋放，該過程依賴自噬激活。Frangou等[44]研究發(fā)現(xiàn)缺氧誘導因子1ɑ(Hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)和內(nèi)皮素-1誘導SLE患者中性粒細胞REDD1表達上調(diào)，激活REDD1/自噬途徑，使得NETs釋放增加。同樣，另一研究[45]也發(fā)現(xiàn)潰瘍性結(jié)腸炎(UC)患者中NETs形成增多依賴自噬，并與中性粒細胞中REDD1表達增高有關(guān)，REDD1/自噬/NETs軸參與了UC患者體內(nèi)IL-1β驅(qū)動的炎癥反應(yīng)。

3.5 其他調(diào)節(jié)機制 研究[46]發(fā)現(xiàn)C型凝集素(Mincle)缺陷的中性粒細胞中NETs形成減少，自噬體激活受損，而ROS產(chǎn)生不受影響，通過自噬誘導劑他莫昔芬外源性干預(yù)Mincle-的中性粒細胞，能逆轉(zhuǎn)Mincle-中性粒細胞中NETs形成缺陷，推測Mincle介導的NETs形成依賴自噬而不是ROS形成。此外，Zhou等[47]報道貝氏芽孢桿菌能誘導AMPK磷酸化，促進自噬體形成，同時NETs形成增加，提示自噬依賴的NETs可能受AMPK調(diào)控。另一項研究[48]發(fā)現(xiàn)用鄰苯二甲酸二酯(DEHP)體外干預(yù)鯉魚中性粒細胞后，可檢測到大量ROS產(chǎn)生，NETs形成明顯增多，自噬自噬蛋白mTOR表達降低、Atg6、LC3表達升高，推測DEH誘導的NETs形成是ROS和自噬共同作用的結(jié)果。綜合上述研究，充分證實了自噬在NETs形成中的重要作用。自噬參與NETs形成信號調(diào)控見圖2。

圖2 自噬參與NETs形成信號調(diào)控圖

4 小結(jié)

細胞自噬和NETs形成具有協(xié)同作用，NETs形成依賴于細胞自噬，其參與NETs形成的機制可能涉及到多種因素調(diào)控。鑒于兩者在多種疾病中發(fā)揮重要作用，對其相互作用機制的深入研究或?qū)榧膊≡\斷、臨床治療提供新思路。