和 友，王曉愛，潘曉賦，楊君興

(1.中國科學(xué)院 上海高等研究院 上海光源科學(xué)中心, 上海 201204; 2.中國科學(xué)院 昆明動物研究所 遺傳資源與進(jìn)化國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 云南省高原魚類育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 云南 昆明 650223)

金線鲃屬是我國特有的鯉科魚類，分布于我國西南喀斯特地區(qū)地下暗河及與之相連的水體中.至今已有超過60種金線鲃魚類被報(bào)道[1].分子系統(tǒng)發(fā)育研究顯示：金線鲃屬與鯽屬、鯉屬、原鯉屬、須鯽屬、似鱤屬構(gòu)成一個(gè)單系群[2].該屬魚類中一半為典型洞穴魚類，表現(xiàn)出視覺退化、體色白化等表型，其基因組和轉(zhuǎn)錄組水平變化機(jī)制不同于國際上所用的脂鯉科洞穴魚墨西哥麗脂鯉[3-5]，是研究退行性演化的新模型.頭部結(jié)構(gòu)是魚類比較解剖學(xué)研究的重要內(nèi)容之一[6]: 一方面頭部是全身骨骼最復(fù)雜組合之處，包含了豐富的分類與進(jìn)化信息；另一方面，對頭部所在的眼、嗅囊、內(nèi)耳等感覺器官以及腦的比較解剖有助于認(rèn)識其對洞穴環(huán)境的感覺適應(yīng).二十世紀(jì)八九十年代，我國學(xué)者曾對當(dāng)時(shí)已知的少數(shù)金線鲃物種的體鱗形態(tài)、圍眶骨系等特征進(jìn)行過描述[7-9]，但對金線鲃魚類的腦結(jié)構(gòu)的研究迄今尚未見報(bào)道.滇池金線鲃是金線鲃屬魚類的旗艦物種，其全基因組測序已經(jīng)完成[4]，并已成功實(shí)現(xiàn)人工繁殖[10].滇池金線鲃具有正常發(fā)育的眼，對其腦結(jié)構(gòu)的研究，可作為該屬魚類神經(jīng)系統(tǒng)比較解剖的基礎(chǔ).作者基于同步輻射顯微CT方法對金線鲃顱腦結(jié)構(gòu)開展了3維無損研究，獲得相關(guān)物種頭部骨骼、腦大體形態(tài)、耳石結(jié)構(gòu)等信息[4,11].新近，利用顯微光學(xué)切片斷層成像(Micro-Optical Sectioning Tomography, MOST)技術(shù)，我們完成了一套基于Nissl染色的滇池金線鲃亞微米分辨率的3維腦圖譜，為開展金線鲃屬魚類的腦結(jié)構(gòu)和功能研究提供了一套比對標(biāo)準(zhǔn).

本文對滇池金線鲃中腦視頂蓋結(jié)構(gòu)進(jìn)行報(bào)道.視頂蓋是硬骨魚類中腦背側(cè)的一對顯著的解剖結(jié)構(gòu)(又稱作視葉)，是重要的視覺中樞，主要接受對側(cè)視神經(jīng)的纖維投射，具有明顯的分層結(jié)構(gòu)(lamination).顯微光學(xué)切片斷層成像以1μm步長對染色后的腦進(jìn)行自動連續(xù)切片和圖像采集，通過高精度配準(zhǔn)后獲取亞微米精度的全腦3維圖譜.我們基于MOST技術(shù)對Nissl染色的滇池金線鲃視頂蓋3維復(fù)原后進(jìn)行組織學(xué)觀察，并參照鯽魚視頂蓋Bodian(蛋白銀)染色結(jié)果[12]識別其分層結(jié)構(gòu)，探討了相關(guān)的解剖學(xué)名詞，為后繼相關(guān)腦區(qū)的功能與演化研究提供解剖學(xué)基礎(chǔ).

1 材料與方法

云南省高原魚類育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室人工繁殖兩年齡滇池金線鲃，全長10～12cm.丁香油麻醉后，斷頭取腦，置于4%多聚甲醛(PFA)溶液中4℃過夜后，重新更換4%PFA保存8月以上.隨后進(jìn)行增強(qiáng)型Nissl染色，由中國科學(xué)院上海藥物研究所MOST及圖像融合分析平臺完成顯微光學(xué)切片斷層成像.魚腦置于2.5%硫堇染液中染色12d，再用70%的乙醇浸泡4d脫色.隨后用梯度乙醇、乙醇-丙酮(體積比1∶1)溶液、100%丙酮各浸泡2h脫水，在新的100%丙酮中過夜.將脫水后的魚腦依次浸入50%、75%的Spurr樹脂中滲透，最后在100%Spurr樹脂中滲透3d，60℃烘箱內(nèi)加熱聚合36h后包埋.包埋后樣品裝MOST組織切片機(jī)，以1μm切片厚度和20×鏡頭條件下進(jìn)行連續(xù)自動切片與圖像采集；單張圖像以8位jpg格式保存.所獲取全套圖像(image stack)導(dǎo)入AVIZO軟件中分析觀察；8位灰度圖像反相處理后以藍(lán)綠色調(diào)渲染觀察；體積元素(Volume Pixel)大小為0.35μm×0.35μm×1μm.

2 結(jié) 果

通過顯微光學(xué)切片斷層成像，我們獲取了一套滇池金線鲃的自端腦至菱腦(小腦與延腦)的腦圖譜(圖1).滇池金線鲃中腦解剖結(jié)構(gòu)與其他鯉科魚類大體相同：背側(cè)為一對視葉(即視頂蓋)，腹側(cè)中腦被間腦下葉遮擋；中腦嘴端與間腦交界處通過后聯(lián)合相區(qū)分；中腦本身分為背部與腹部，背部為一對視頂蓋(tectum opticum)，腹部為中腦被蓋(tegmentum)；左右視頂蓋中線結(jié)合處下方為一對縱枕；視頂蓋與被蓋間具有左右腦室(tectal ventricle)；中腦尾端小腦瓣伸入視頂蓋與被蓋之間(圖2).

圖1 滇池金線鲃Nissl染色腦橫切片

視頂蓋從前到后覆蓋整個(gè)中腦.我們選取中后段位置、背內(nèi)側(cè)部位的視頂蓋進(jìn)行觀察(圖2).經(jīng)過3維重建后，可清晰辨別5條神經(jīng)元胞體的聚集帶(圖2(b)，圖3).我們以此為依據(jù)，并通過與文獻(xiàn)報(bào)道的鯽魚視頂蓋Bodian染色結(jié)果進(jìn)行比對[12]，將滇池金線鲃視頂蓋由內(nèi)向外劃分為: 圍腦室層(Stratum Periventriculare, SPV)、中央白質(zhì)層(Stratum Album Central, SAC)、中央灰質(zhì)層(Stratum Griseum Central, SGC)、表面灰質(zhì)與纖維層(Stratum Fibrosum et Griseum Superficiale, SFGS)、邊緣層(Stratum Marginale, SM).各層簡介如下.

圖2 (a)中腦后部經(jīng)視頂蓋、小腦瓣、被蓋、下葉的3維復(fù)原斷層(50μm厚,標(biāo)尺: 1mm),(b)自(a)中ROI區(qū)域視頂蓋3維復(fù)原(標(biāo)尺: 150μm).

1)圍腦室層(SPV): 此層位于視頂蓋最內(nèi)側(cè)，與側(cè)腦室相鄰.由大約6排圓形神經(jīng)元胞體緊密排列而成.Nissl染色組織切片上也極易識別(圖3(c)).

圖3 滇池金線鲃視頂蓋分層(自圖2(b)中ROI區(qū)域)

2)中央白質(zhì)層(SAC): 此層最薄.其內(nèi)側(cè)與圍腦室層相接，外側(cè)邊界由一層神經(jīng)元胞體聚集帶界定.該層神經(jīng)元中有較大的錐體神經(jīng)元和中等大小梭形細(xì)胞.在鯽魚視頂蓋Bodian染色結(jié)果中[12]，此層為視頂蓋傳出纖維所在的區(qū)域.

3)中央灰質(zhì)層(SGC): 此層最厚，包含兩層細(xì)胞聚集帶.內(nèi)側(cè)神經(jīng)元胞體聚集帶位于此層中部，外側(cè)神經(jīng)元胞體聚集帶形成本層的外側(cè)邊界，因此該層可分為內(nèi)、外兩部分.

4)表面灰質(zhì)與纖維層(SFGS): 此層內(nèi)側(cè)與中央灰質(zhì)層相接，外側(cè)以整個(gè)視頂蓋中最外側(cè)神經(jīng)元胞體聚集帶為邊界.在鯽魚視頂蓋Bodian染色結(jié)果中[12]，此層為接受對側(cè)視神經(jīng)纖維傳入的主要部位.

5)邊緣層(SM): 此層神經(jīng)元胞體十分稀少.在鯽魚視頂蓋Bodian染色結(jié)果中[12]，此層含有大量無髓鞘神經(jīng)纖維.

3 討 論

3.1 滇池金線鲃視頂蓋的分層

中腦視頂蓋是魚類的重要視覺中樞，主要接受對側(cè)視神經(jīng)的纖維投射.在輻鰭魚類各代表類群研究中，通過Golgi染色等重金屬染色、結(jié)合逆行性追蹤，顯示視頂蓋都具有明顯分層結(jié)構(gòu)[12-13].Vanegas等[14]將銀鱸單側(cè)眼球摘除后，結(jié)合硝酸鈾酰重金屬染色，將對側(cè)視頂蓋(即摘除眼球的視神經(jīng)投射側(cè))由內(nèi)向外分為6層(stratum)(表1Ⅱ).而同側(cè)視頂蓋中(未摘除眼球的視神經(jīng)投射側(cè))由于不存在退行性神經(jīng)纖維標(biāo)記，其分層結(jié)構(gòu)除可識別出SPV、SAC兩層外，其余各層界限并不明顯.Von Bartheld等[15]基于辣根過氧化物酶(HRP)追蹤標(biāo)記視神經(jīng)對輻鰭魚類各代表類群的視頂蓋比較研究中沿用Vanegas的6層分層模式.其結(jié)果表明視神經(jīng)的主要投射部位為SFGS層，這是所有魚類接受視神經(jīng)投射的保守區(qū)域.同時(shí)不同類群的視頂蓋分層存在差別，主要在于: 1)是否存在單獨(dú)的視覺層(Stratum Opticum, SO); 2)SGC層是否接受視神經(jīng)投射.對于鯉科魚類而言，基于HRP的追蹤標(biāo)記實(shí)驗(yàn)中SO層與SFGS層的界限不明顯[15].而Northcutt基于Bodian蛋白銀染色對輻鰭魚類視頂蓋分層的研究結(jié)果與此一致[12].他將視頂蓋由內(nèi)向外先分為4區(qū)(zone): PGZ、DWZ、CZ、SGWZ(表1Ⅰ)；各區(qū)下再以阿拉伯?dāng)?shù)字分“帶(layer)”(由于中文“層”已經(jīng)用于“stratum”，我們將“l(fā)ayer”翻譯為“帶”，以免混淆).PGZ區(qū)相當(dāng)于SPV層，DWZ區(qū)相當(dāng)于SAC層、CZ區(qū)相當(dāng)于SGC層，而SGWZ區(qū)則對應(yīng)SFGS、SO、SM 3層.這樣4分區(qū)的分層結(jié)構(gòu)在所有輻鰭魚類中是保守的，而對不同類群則可再以“帶(layer)”進(jìn)行細(xì)致劃分.

表1 視頂蓋分層名詞

Nissl染色(及HE曙紅染色)主要對神經(jīng)元胞體進(jìn)行著色，但無法對神經(jīng)纖維著色，因此在傳統(tǒng)Nissl染色的腦組織切片中，無法準(zhǔn)確區(qū)分視頂蓋中除SPV，SM層外的分層結(jié)構(gòu)界限.本文通過MOST方法獲取了基于Nissl染色的滇池金線鲃三維腦圖譜.通過3維復(fù)原的視頂蓋，可以清晰辨別出5條神經(jīng)元胞體聚集帶(圖3(a)).我們以此為依據(jù)，并參照鯽魚Bodian染色結(jié)果[12]，識別出滇池金線鲃視頂蓋5層結(jié)構(gòu)(圖3)(表1Ⅴ)，SAC、SGC、SFGS 3層外側(cè)邊界由對應(yīng)的神經(jīng)元胞體聚集帶清晰界定.SFGS層與SM層分界明顯，但在SFGS層內(nèi)神經(jīng)元胞體連續(xù)分布，無法進(jìn)一步區(qū)分出一個(gè)單獨(dú)的SO層；這與基于Bodian蛋白銀染色和HRP逆向追蹤的鯽魚視頂蓋分層研究相一致[12,15].

在滇池金線鲃視頂蓋各層中SGC層最厚，根據(jù)該層中部的神經(jīng)元胞體聚集帶3(圖3(a))又可將SGC層分為內(nèi)外兩部分，外側(cè)部分相當(dāng)于銀鱸視頂蓋中的內(nèi)網(wǎng)狀層(Inner Plexiform Layer, IPL)[16].將3維復(fù)原圖與對應(yīng)Nissl染色組織切片圖配準(zhǔn)后，各分層結(jié)構(gòu)清晰可見(圖3(b)).而與之形成明顯對比，在Nissl染色組織切片中，除內(nèi)外兩側(cè)的SPV、SM層外，其他SAC、SGC、SFGS各層邊界很難界定(圖3(c)).

3.2 解剖學(xué)名詞

現(xiàn)在，國際上基于Vanegas等的6分層結(jié)構(gòu)在魚類視頂蓋的比較解剖和相關(guān)功能研究中被廣泛接受，但早期不同研究者對視頂蓋分層采用名詞各不相同[12].國內(nèi)對硬骨魚類的視頂蓋組織學(xué)研究，主要見于鯉魚[17]、真鯛[18]、羅非魚[19]、貝氏高原鰍[20]、寬體沙鰍[21]等.所用中文名詞各有差別.秉志基于Cajal染色并參照文獻(xiàn)[22]，將鯉魚視頂蓋分為8層[17]，第1～4層分別為室管膜與視蓋深層纖維、結(jié)層、視蓋聯(lián)合層、視蓋臂纖維層；第7層為外結(jié)層，第8層為視神經(jīng)層；第5、6層未給出名稱.其分層依據(jù)和所用解剖學(xué)名詞，無論中英文至今已有較大變化.上世紀(jì)90年代國內(nèi)研究者相繼對其他硬骨魚類視頂蓋組織學(xué)進(jìn)行了研究，對分層結(jié)構(gòu)所用的中文名稱有所不同，但外文詞源(包括本研究)都來自前述Vanegas等的工作[14,16].王藝?yán)诘萚18]基于Golgi染色并依循Vanegas等(1974)對鱸形目魚類的研究[16]，將真鯛視頂蓋分為6層，中文名稱由內(nèi)向外分別為: 圍腦室層(SPV)、中央白質(zhì)層(SAC)、中央灰質(zhì)層(SGC)、表面灰質(zhì)及纖維層(SFGS)(原文中“灰質(zhì)”打印為“灰管”)、視覺層(SO)、邊緣層(SM)(表1Ⅲ).黃靜等[20]在對貝氏高原鰍中腦視頂蓋進(jìn)行Nissl染色/HE染色組織學(xué)研究時(shí)，給出的分層結(jié)構(gòu)中文名依次為: 圍腦室層(SPV)、中央纖維層(SAC)、中央細(xì)胞層(SGC)、表面纖維層(SFGS)、視神經(jīng)層(SO)、邊緣層(SM)(表1Ⅳ).陳蓉等[19]基于HE染色對羅非魚的研究、史晉絨等[21]基于Nissl染色/HE染色對寬體沙鰍的研究所采用的名稱與此相同.

如上節(jié)所述，由于Nissl染色(和HE染色)無法對神經(jīng)纖維著色，因此在基于Nissl染色標(biāo)本中無法觀察到神經(jīng)纖維(圖3(c))；若將視頂蓋6分層結(jié)構(gòu)表述為“神經(jīng)纖維與細(xì)胞層交替排列的層狀結(jié)構(gòu)”則并不準(zhǔn)確.遵循Vanegas等原始文字[14]，本文中采用“中央灰質(zhì)層”代替“中央細(xì)胞層”來翻譯“Stratum Greiseum Centrale”，采用“表面灰質(zhì)與纖維層”代替“表面纖維層”來翻譯“Stratum Fibrosum et Greiseum Superficiale”(表1Ⅴ).同時(shí)需要指出的是：盡管魚類視頂蓋中具有“視覺層(SO)”，但SO層并不是在所有魚類中均可區(qū)分，而“表面灰質(zhì)與纖維層(SFGS)”是視神經(jīng)纖維投射的主要部位[15].此外，本文中采用“區(qū)”、“層”、“帶”翻譯視頂蓋研究中相應(yīng)的“zone”、“stratum”、“l(fā)ayer”3級結(jié)構(gòu).

致謝:顯微光學(xué)切片斷層成像由中國科學(xué)院上海藥物研究所MOST及圖像融合分析平臺完成，特此致謝.