姚亞文，趙其平，朱順海，黃 兵，董 輝，黃文浩,2，劉 展，于 鈺，韓紅玉

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部動物寄生蟲學(xué)重點實驗室，上海 200241; 2.上海師范大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，上海 200234)

雞球蟲病是由艾美耳屬的幾種艾美耳球蟲寄生雞腸道引起的一種危害嚴重的寄生蟲病.臨床表現(xiàn)為感染的雞腹瀉、營養(yǎng)吸收不良、飼料轉(zhuǎn)化低、腸道出血和死亡等，對全世界養(yǎng)雞業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失[1].目前控制球蟲病的主要方法包括化學(xué)藥物防治和疫苗免疫預(yù)防.現(xiàn)有疫苗主要是由雞球蟲活蟲種(株)制備的強毒疫苗和弱毒疫苗，并在產(chǎn)蛋雞場和部分肉雞場中應(yīng)用，但活疫苗存在保存難、散毒及潛在的致病威脅等缺點，使其未能在雞場得到廣泛使用，因此，防治雞球蟲病主要還是依靠藥物[2].目前，臨床常用的抗球蟲藥物主要分為離子載體類和化學(xué)合成類.離子載體類藥物主要包括馬杜拉霉素、鹽霉素和莫能菌素等，化學(xué)合成藥物主要包括地克珠利、托曲珠利和氨丙啉等[3].由于藥物的長期廣泛使用導(dǎo)致雞球蟲對藥物產(chǎn)生嚴重的耐藥性[4].目前，幾乎從現(xiàn)場分離到對所有使用的抗球蟲藥產(chǎn)生耐藥性的蟲株，而且出現(xiàn)了多重或交叉耐藥性蟲株，隨著耐藥性的產(chǎn)生，抗球蟲藥的使用年限大為縮短，防治效果逐漸降低甚至失效[5].因此，研究了解雞球蟲耐藥性的產(chǎn)生機制及建立耐藥性快速檢測方法，是急需解決的重要問題.自發(fā)現(xiàn)雞球蟲對抗球蟲藥產(chǎn)生耐藥性以來，各國學(xué)者對雞球蟲產(chǎn)生耐藥性的原因機制進行了研究，但至今尚未弄清楚雞球蟲耐藥性產(chǎn)生的分子機理，也未找到控制球蟲產(chǎn)生耐藥性的靶基因，無法解釋雞球蟲耐藥性產(chǎn)生的分子機制.

研究發(fā)現(xiàn)雞球蟲耐藥性的發(fā)生機制十分復(fù)雜，可能與核苷酸堿基序列的突變、基因表達水平的變化以及表觀遺傳學(xué)如甲基化修飾等有關(guān)[6].在對其它頂復(fù)們原蟲和雞球蟲耐藥性的研究發(fā)現(xiàn)，與敏感株相比，耐藥株的部分基因出現(xiàn)顯著的上調(diào)或下調(diào).如研究發(fā)現(xiàn)臨床分離的對銻耐受的杜氏利什曼原蟲(Leishmaniadonovani)，其體內(nèi)表面抗原2基因的表達量升高[7].Thabet等采用LC-MS/MS相對蛋白組學(xué)定量方法對柔嫩艾美耳球蟲(Eimeriatenella,Et)敏感株和田間分離的莫能霉素耐藥株進行比較分析，發(fā)現(xiàn)97個差異蛋白，其中25個蛋白在耐藥株表達上調(diào)[8].同樣，利用cDNA微陣列技術(shù)對柔嫩艾美耳球蟲莫能霉素耐藥株和馬杜拉霉素耐藥株與敏感株進行分析發(fā)現(xiàn)敏感株和耐藥株基因的轉(zhuǎn)錄存在差異[9].

為研究雞球蟲耐藥性產(chǎn)生的分子機制，實驗室前期采用藥物濃度遞增法從柔嫩艾美耳球蟲敏感株誘導(dǎo)出柔嫩艾美耳球蟲地克珠利耐藥株和柔嫩艾美耳球蟲馬杜拉霉素耐藥株.之后對兩株耐藥株和敏感株進行轉(zhuǎn)錄組測序分析，獲得耐藥株與敏感株的差異表達基因，其中柔嫩艾美耳球蟲保守蛋白40(Conserved hypothetical protein, EtCHP40；基因號：ETH_00025040)在馬杜拉霉素耐藥株中轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)[10].本文對該保守蛋白基因進行克隆，成功構(gòu)建重組表達質(zhì)粒，并在大腸桿菌誘導(dǎo)表達重組蛋白，通過熒光定量PCR和間接免疫熒光等實驗，對該蛋白分子特性進行初步分析，為進一步研究其功能及與雞球蟲耐藥產(chǎn)生的關(guān)系提供基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 動物和細胞

試驗所用三黃雞購自上海奉賢區(qū)某種雞場，新西蘭大白兔購自上海嘉根生物公司.雞胚成纖維細胞系(DF-1)來源于東蘭辛系(EL-0)雞胚，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所動物原蟲病創(chuàng)新團隊球蟲組傳代并保存.

1.2 蟲株

試驗所用雞球蟲蟲株均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所動物原蟲病創(chuàng)新團隊球蟲組分離傳代并保存.分別為柔嫩艾美耳球蟲藥物敏感株(DS)，柔嫩艾美耳球蟲地克珠利耐藥株(DZR)，柔嫩艾美耳球蟲馬杜拉霉素耐藥株(MRR)，柔嫩艾美耳球蟲鹽霉素不同濃度耐藥株(15ppm，30ppm，45ppm，60ppm，SMR)，田間雞球蟲混合株(A1)和單卵囊分離的田間柔嫩艾美耳球蟲鹽霉素耐藥株(S2，S3，S4，S5)[11-12].

將1日齡三黃雞，在無球蟲環(huán)境下飼養(yǎng)7天，檢查無球蟲感染后，經(jīng)口服的方式接種柔嫩艾美耳球蟲孢子化卵囊(5萬/雞)，一周后收集盲腸，收集純化未孢子化卵囊(Unsporulated Oocysts, UO)和孢子化卵囊(Sporulated Oocysts, SO)[13-14].通過對純化的孢子化卵囊體外脫囊，消化，純化和回收子孢子(Sporozoites, SZ)[15].第二代裂殖子(second generation Merozoite, ME)在雞接種孢子化卵囊后112h從雞的盲腸粘膜中收集和純化[16].

1.3 試劑

RNA提取試劑TRIzol和M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Invitrogen公司.DL2000 DNA Marker、PCR Master Mix、DNA膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒均購自于上海天根生物科技有限公司.pGEM?-T Easy載體購于美國Promega公司.限制性核酸內(nèi)切酶BamHⅠ、XhoⅠ、去除基因組DNA試劑盒和DNA純化試劑盒購自于寶生物工程(大連)有限公司.弗式完全佐劑、弗氏不完全佐劑、抗熒光猝滅劑、抗α-Tubulin單克隆抗體和蛋白酶抑制劑均購自于美國Sigma公司.胎牛血清、細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基(DMEM)、青霉素和鏈霉素、預(yù)染蛋白Marker和SuperSignalTMWest Pico Plus化學(xué)發(fā)光底物試劑盒購自于美國Thermo Scientific公司.BCA蛋白濃度測定試劑盒和DAPI(4’,6’-diamidino-2-phenylindole)購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司.硝酸纖維素膜(PVDF)購自于Milipore公司.HRP標記山羊抗鼠IgG和HRP標記山羊抗兔IgG購自于美國Proteintech公司.FITC標記抗兔IgG購自Jackson Immuno Research公司.

1.4 cDNA模板的制備和基因克隆

使用RNA提取試劑TRIzol從柔嫩艾美耳球蟲敏感株孢子化卵囊提取總RNA，經(jīng)1%核酸凝膠電泳及紫外分光光度計檢測所提總RNA的濃度和純度，用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成單鏈cDNA第一鏈.實驗所用器具均是無核酸酶器具，所有實驗過程均在無核酸酶環(huán)境中進行.

根據(jù)保守蛋白EtCHP40基因(基因號：ETH_00025040)的開放閱讀框，利用Primer6.0設(shè)計特異性引物，上游引物為：5’-GCGGATCCATGCTGTGTCCGGTAGCGACAGG-3’(BamHⅠ)；下游引物為：5’-GCCTCGAGTCACAACTCCACTCCATCATTGCG-3’(XhoⅠ).以柔嫩艾美耳球蟲敏感株孢子化卵囊cDNA第一鏈為模板，擴增目的片段(預(yù)計長度約為519bp).將得到的PCR產(chǎn)物膠回收后克隆到pGEM?-T Easy載體上，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌E.coliTOP10感受態(tài)細胞中，進行藍白斑篩選.挑選白色菌落進行菌液PCR鑒定后測序.

1.5 生物信息學(xué)分析

利用NCBI上的BLAST程序(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)對EtCHP40基因序列進行比對和分析，利用ProtParam工具(http：//cn.expasy.org/tools/protparam.html)計算編碼該保守蛋白氨基酸組成、理論分子量、等電點等.利用TMHMM服務(wù)器(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)和SignalP4.0(http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)分析EtCHP40基因編碼的蛋白是否存在跨膜結(jié)構(gòu)和信號肽序列.采用Motifscan(http：//myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motifscan)分析EtCHP40氨基酸序列含有的功能結(jié)構(gòu)域.

1.6 重組蛋白的表達、純化和多克隆抗體的制備

提取測序正確的重組克隆質(zhì)粒pGEM-EtCHP40，將pGEM-EtCHP40和pET-28a空載體經(jīng)BamⅠ和XhoⅠ雙酶切后回收目的片段，4℃連接過夜，將連接成功的重組表達質(zhì)粒命名為pET-28a-EtCHP40.PCR和測序鑒定正確后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化于大腸桿菌E.coliBL21感受態(tài)細胞中，用1.0mmol/L異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)重組蛋白表達，菌液超聲后進行SDS-PAGE電泳，瞬籃染色液染色，確定重組蛋白(rEtCHP40)是否表達，且表達形式為可溶表達或包涵體.對得到的包涵體重組蛋白進行切膠分離純化，經(jīng)BCA蛋白濃度測定試劑盒測定濃度，-20℃保存?zhèn)溆?

將0.2mg純化的rEtCHP40用等量體積的弗氏完全佐劑乳化，之后將其皮下免疫體重約2.5kg新西蘭大白兔.2周后將等量的重組蛋白和弗氏不完全佐劑乳化，每隔一周注射免疫一次，共4次.最后一次免疫后7天，采集血液，分離血清并在-20℃保存.

1.7 Western blot

將純化后的重組蛋白進行SDS-PAGE，并將其轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，于5%(密度)脫脂牛奶中，4℃封閉過夜.經(jīng)0.05%(體積分數(shù))PBS-Tween20緩沖液(PBST：1% PBS中加入1‰的Tween20)洗滌3次后，分別用抗HIS單抗(1∶5000稀釋)、兔陰性血清(1∶100稀釋)和兔抗子孢子血清(1∶100稀釋)作為一抗，37℃孵育2h，PBST洗3次，每次10min，最后一次洗滌后用1∶5000比例稀釋的HRP標記山羊抗鼠IgG和HRP標記山羊抗兔IgG作為二抗，常溫下孵育45min，PBST洗滌3次后，用SuperSignalTMWest Pico Plus化學(xué)發(fā)光底物試劑盒檢測結(jié)果.

1.8 實時熒光定量PCR

為了研究基因EtCHP40在柔嫩艾美耳球蟲敏感株4個不同發(fā)育階段、柔嫩艾美耳球蟲馬杜拉霉素耐藥株、柔嫩艾美耳球蟲地克珠利耐藥株、柔嫩艾美耳球蟲鹽霉素不同濃度耐藥株、田間雞球蟲混合株(A1)和單卵囊分離的田間柔嫩艾美耳球蟲鹽霉素耐藥株的mRNA轉(zhuǎn)錄水平，分別提取這些蟲株的總RNA，利用去除基因組DNA試劑盒去除基因組DNA后，用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒將蟲體總RNA反轉(zhuǎn)錄成單鏈cDNA，再利用DNA純化試劑盒純化cDNA作為模板.利用Primer6.0設(shè)計特異性引物，上游引物為5’-GCACTGGTGGAGGGAAACTA-3’，下游引物為：5’-GGAAGTCTCTGCACCCTCAG-3’.并用18S RNA作為內(nèi)參[22-23]，其上游引物為：5’-TGTAGTGGAGTCTTGGTGATTC-3’，下游引物為：5’-CCTGCTGCCTTCCTTAGATG-3’，采用實時熒光定量PCR(qPCR)技術(shù)，對EtCHP40在柔嫩艾美耳球蟲敏感株4個不同階段，不同耐藥株和田間株的mRNA轉(zhuǎn)錄水平進行分析.每個反應(yīng)進行3次重復(fù)，用2-ΔΔCt的統(tǒng)計學(xué)方法計算相對mRNA的轉(zhuǎn)錄水平.

1.9 間接免疫熒光定位

將收集純化的子孢子和裂殖子重懸于1% PBS中，稀釋為6×104個/mL，將子孢子和裂殖子均勻鋪在細胞爬片上，置于6孔板中風(fēng)干.按每孔接種2.5×105個DF-1細胞將其均勻加入到細胞培養(yǎng)6孔板中，培養(yǎng)12h.按每孔7.5×105個新鮮的子孢子加入到含DF-1細胞的6孔板中，在37℃、5%CO2下繼續(xù)培養(yǎng).分別在子孢子入侵細胞后2、24、48和72h各取出一個細胞板，用4%細胞固定液固定0.5h，將固定液洗去后加入0.1% Triton X-100通透30min；用PBST洗滌5次，每次5min，用2%牛血清白蛋白(BSA)在37℃下封閉2h，PBST洗滌5次；加入稀釋在1% PBS中的兔抗rEtCHP40抗體(1∶100稀釋)，37℃孵育1h后洗去一抗，加入FITC標記的抗兔IgG(1∶500稀釋)，37℃孵育1h，PBST洗滌5次；用10μg/mL DAPI室溫下避光染色30min，PBST洗滌5次；用抗熒光猝滅劑封閉，熒光顯微鏡(德國Zeiss，LSM880)下觀察結(jié)果.

2 結(jié) 果

2.1 EtCHP40基因的克隆和生物信息學(xué)分析

以柔嫩艾美耳球蟲敏感株孢子化卵囊cDNA第一鏈為模板，對EtCHP40基因的ORF序列進行擴增，瓊脂糖凝膠電泳顯示得到與目標序列大小(519bp)一致的PCR擴增條帶.將目的條帶純化后連接到克隆載體pGEM-T Easy載體構(gòu)建重組克隆質(zhì)粒pGEM-T-EtCHP40，經(jīng)PCR鑒定后測序，BLAST分析結(jié)果顯示該序列與已知的柔嫩艾美耳球蟲EtCHP40基因(GenBank：XM_013373672.1)序列100%同源.生物信息學(xué)分析顯示該基因序列編碼172個氨基酸，預(yù)測分子量為18.8kDa，理論等電點為4.77.對預(yù)測的氨基酸序列分析表明，該基因編碼的蛋白無信號肽和跨膜結(jié)構(gòu).蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果(圖1)表明，EtCHP40含4個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(位置為：45～48，74～77，94～97，121～124)；2個N-豆蔻?；稽c(位置為：102～107，125～130)；1個蛋白激酶C磷酸化位點(位置為：94～96)；1個真核生物和病毒天冬氨酸蛋白酶活性位點(位置為：125～136)；1個逆轉(zhuǎn)錄病毒型家族天冬氨酸蛋白酶活位點(位置為：123～137).

圖1 EtCHP40基因cDNA核苷酸序列及其氨基酸序列的生物信息學(xué)分析

2.2 重組蛋白的誘導(dǎo)表達與多克隆抗體的制備

將重組表達質(zhì)粒pET-28a-EtCHP40轉(zhuǎn)化至大腸桿菌E.coliBL21感受態(tài)細胞中，誘導(dǎo)重組蛋白His-EtCHP40(rEtCHP40)表達，SDS-PAGE電泳結(jié)果表明成功誘導(dǎo)了重組蛋白的表達，且該重組蛋白表達形式為包涵體，切膠純化后經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測表明，得到了比較純的、分子量約30kDa的融合蛋白(圖2(a)).Western blot分析發(fā)現(xiàn)：以稀釋后的抗His標簽單抗和抗子孢子多克隆抗體作為一抗孵育重組蛋白，均可在約30kDa處檢測到目的條帶，但是重組蛋白rEtCHP40與兔陰性血清無反應(yīng)條帶，表明不與陰性兔IgG發(fā)生反應(yīng)(圖2(b)).說明該重組蛋白rEtCHP40具有良好的反應(yīng)原性.

圖2 重組蛋白rEtCHP40的純化及反應(yīng)原性分析

2.3 EtCHP40基因在柔嫩艾美耳球蟲敏感株4個不同發(fā)育階段的mRNA轉(zhuǎn)錄水平

利用實時熒光定量PCR方法對在柔嫩艾美耳球蟲敏感株4個不同發(fā)育階段(未孢子化卵囊、孢子化卵囊、子孢子和第二代裂殖子)的mRNA轉(zhuǎn)錄水平進行分析，結(jié)果表明EtCHP40在柔嫩艾美耳球蟲敏感株不同發(fā)育階段中的轉(zhuǎn)錄水平存在差異，且該基因在第二代裂殖子轉(zhuǎn)錄水平最高，未孢子化卵囊階段次之；孢子化卵囊和子孢子兩個階段都比較低(圖3).

圖3 EtCHP40基因在蟲體不同發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄水平

2.4 EtCHP40基因在柔嫩艾美耳球蟲敏感株和不同耐藥株的轉(zhuǎn)錄水平

對柔嫩艾美耳球蟲敏感株與不同耐藥株中EtCHP40基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平進行分析，結(jié)果顯示與敏感株相比，該基因在3個耐藥株(MRR、DZR和SMR)中mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)，其中在馬杜拉霉素耐藥株轉(zhuǎn)錄最高，差異極顯著(P<0.001)(圖4(a))

通過比對敏感株與不同濃度鹽霉素耐藥株的相對轉(zhuǎn)錄水平，發(fā)現(xiàn)隨著藥物濃度的升高，EtCHP40的mRNA轉(zhuǎn)錄水平不斷升高，60ppm的鹽霉素耐藥株與敏感株相比存在顯著差異(P<0.001)(圖4(b)).田間混合株A1與單卵囊分離的4株柔嫩艾美耳球蟲鹽霉素耐藥株的EtCHP40基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平與敏感株相比，均存在顯著差異(P<0.05)(圖4(c)).

圖4 (a)EtCHP40基因在不同耐藥株的轉(zhuǎn)錄水平;(b)EtCHP40基因在不同濃度鹽霉素耐藥株的轉(zhuǎn)錄水平;(c)EtCHP40基因在田間株的轉(zhuǎn)錄水平

2.5 蛋白EtCHP40在蟲體上的定位分析

使用兔抗rEtCHP40多克隆抗體作為一抗，對柔嫩艾美耳球蟲敏感株子孢子、裂殖子和子孢子入侵DF-1細胞后蟲體不同發(fā)育階段的EtCHP40蛋白進行定位分析.熒光顯微鏡觀察EtCHP40蛋白在蟲體上的分布.結(jié)果顯示該蛋白主要位于子孢子的表面和頂部(圖5(a))；當子孢子入侵DF-1細胞前期EtCHP40仍位于蟲體的表面與頂部(圖5(c))；當蟲體發(fā)育至滋養(yǎng)體時，該蛋白主要位于細胞質(zhì)中，且熒光強度增強(圖5(d))；當蟲體發(fā)育至未成熟裂殖體和成熟裂殖體時，該保守蛋白EtCHP40較均勻的分布于整個蟲體(圖5(e、f))，熒光強度減弱；而當蟲體發(fā)育至第二代裂殖子時，蛋白EtCHP40均勻的分布在整個蟲體(圖5(b)).

圖5 EtCHP40在蟲體上的定位

3 討 論

實驗室前期對柔嫩艾美耳球蟲敏感株、地克珠利耐藥株和馬杜拉霉素耐藥株進行了轉(zhuǎn)錄組測序分析，獲得了耐藥株與敏感株的差異表達基因，這些差異表達基因可能參與了柔嫩艾美耳球蟲對抗球蟲藥的耐藥過程，對耐藥株與敏感株差異表達基因的特性和功能進行分析，有助于理解球蟲耐藥性產(chǎn)生機制和建立球蟲耐藥性快速檢測方法.

3.1 EtCHP40蛋白含有多個功能結(jié)構(gòu)域

本研究成功克隆了EtCHP40基因，序列分析顯示EtCHP40基因編碼的蛋白含有酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點、N-豆蔻?；稽c、蛋白激酶C磷酸化位點、真核生物和病毒天冬氨酸蛋白酶活性位點和逆轉(zhuǎn)錄病毒型家族天冬氨酸蛋白酶活位點.酪蛋白激酶Ⅱ(CKⅡ)是一種高度保守的、在各種真核生物中都廣泛存在，并且具有多種生理功能的磷酸化絲氨酸/蘇氨酸的激酶.CKⅡ主要通過T細胞受體、細胞因子受體執(zhí)行信號傳導(dǎo)功能；受體酪氨酸激酶具有跨膜結(jié)構(gòu)，可與胞外配體結(jié)合，引起結(jié)構(gòu)改變并產(chǎn)生酶催化活性，又可選擇性的與底物結(jié)合使其磷酸化，受體酪氨酸激酶及其配體很多都與腫瘤相關(guān)[17-18].蛋白激酶C是鈣離子和磷脂酰絲氨酸依賴性蛋白激酶，未受刺激的細胞中以非活化的形式存在于胞漿，活化后可介導(dǎo)跨膜信號傳導(dǎo)和增強特殊基因的轉(zhuǎn)錄，擁有廣泛的作用底物，可參與細胞分泌、肌肉收縮、細胞增殖和分化等眾多生理過程[19].天冬氨酸蛋白酶是一類在酸性pH下有活性的蛋白水解酶，廣泛分布于真核生物以及微生物中，所有哺乳動物的天冬氨酸蛋白酶都是以酶原的形式合成，然后再被激活為有功能的活性形式，主要功能是降解蛋白、抗原和促進其他酶的活化等[20].對免疫缺陷病毒蛋白酶(HIV PR，C34.2316)的研究發(fā)現(xiàn)，HIV PR的活性發(fā)生改變能夠造成HIV復(fù)制和感染其他細胞的能力發(fā)生紊亂，這使得HIV PR在藥物治療中已成為一個首選的藥物受體[21]，這提示EtCHP40基因可能是一個雞球蟲藥物的受體.該蛋白這些磷酸化位點和糖基化位點的存在，提示著該保守蛋白在細胞內(nèi)經(jīng)過了一系列的加工修飾，可能通過蛋白的磷酸化和去磷酸化，在細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮著重要作用.

3.2 EtCHP40可能參與了蟲體的生長發(fā)育及逃避宿主的免疫反應(yīng)

對重組蛋白rEtCHP40進行SDS-PAGE和反應(yīng)原性分析發(fā)現(xiàn)，原核表達獲取的重組蛋白rEtCHP40分子量比我們預(yù)期大，推測可能是由于His-tag中的堿性氨基酸的作用造成蛋白在SDS-PAGE中遷移變慢，而導(dǎo)致的偏差[22]，反應(yīng)原性的結(jié)果表明該重組蛋白可用于多克隆抗體的制備.

本研究通過qPCR的方法檢測了EtCHP40基因在柔嫩艾美耳球蟲4個不同發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄水平，發(fā)現(xiàn)EtCHP40基因在第二代裂殖子與未孢子化卵囊階段的轉(zhuǎn)錄水平較高，特別是第二代裂殖子階段遠高于其他階段，而孢子化卵囊和子孢子階段轉(zhuǎn)錄水平較低.第二代裂殖子與未孢子化卵囊是在雞腸道內(nèi)發(fā)育的，此時的蟲體需要從宿主細胞內(nèi)獲取更多的營養(yǎng)物質(zhì)來發(fā)育繁殖，同時也需要逃避宿主的免疫反應(yīng)，本文推測不同發(fā)育階段表達量的差異可能是體內(nèi)與體外不同的環(huán)境引起的.有研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)境的變化，如冷、熱、化學(xué)因素與營養(yǎng)因素等都會導(dǎo)致蛋白表達的變化[23].因此，推測EtCHP40在裂殖子階段和未孢子化卵囊的高表達可能參與了蟲體的生長發(fā)育繁殖和逃避宿主的免疫反應(yīng)，并可能參與了能量的代謝.劉桂玲等對柔嫩艾美耳球蟲表面抗原10的研究發(fā)現(xiàn)，它在裂殖子高表達與蟲體的生長發(fā)育有關(guān)[24].此外，陳婷等人在對柔嫩艾美耳球蟲3-磷酸甘油醛脫氫酶的研究中也發(fā)現(xiàn)其在裂殖子階段的高表達會為其發(fā)育提供能量支持.

通過間接免疫熒光定位研究發(fā)現(xiàn)該保守蛋白主要位于子孢子的表面和頂部，這可能與蟲體入侵宿主細胞有關(guān).研究報道柔嫩艾美耳球蟲頂膜抗原1(AMA1)蛋白位于子孢子的表面和頂端，針對AMA1的抗體可有效抑制子孢子對宿主細胞的入侵[25].翟頎等對分布在子孢子頂端的柔嫩艾美耳球蟲保守蛋白EtCHP39研究發(fā)現(xiàn)，其抗體在體外也能有效抑制子孢子入侵DF-1細胞[26].同樣，本文也進行了抗體體外抑制實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)用兔抗rEtCHP40預(yù)處理子孢子并不影響入侵DF-1細胞，因此推測該蛋白可能并不直接參與子孢子入侵宿主細胞，可能參與了蟲體與宿主的相互作用以及蟲體逃避宿主的免疫反應(yīng).

3.3 EtCHP40與柔嫩艾美耳球蟲耐藥的關(guān)系

通過熒光定量PCR方法檢測了EtCHP40基因在柔嫩艾美耳球蟲敏感株與不同耐藥株和田間株的mRNA轉(zhuǎn)錄水平，發(fā)現(xiàn)該基因在耐藥株中表達顯著上調(diào)，且與鹽霉素藥物濃度呈正相關(guān)，推測其表達水平的高低可能受到藥物濃度的影響.同樣，分析野生混合種耐藥株和單卵囊分離的鹽霉素耐藥株的EtCHP40基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平，發(fā)現(xiàn)與敏感株相比，不管是混合種還是分離的柔嫩艾美耳球蟲鹽霉素耐藥株，其表達水平都是顯著上升的，盡管與實驗室誘導(dǎo)的對鹽霉素完全耐藥的蟲株相比存在一定的差異，這可能是因為田間分離的耐藥株對藥物的敏感性不同，導(dǎo)致了其表達水平的不一致.已有研究發(fā)現(xiàn)，在耐藥的寄生蟲體內(nèi)有些蛋白出現(xiàn)高表達.如對杜氏利什曼原蟲耐藥性的研究發(fā)現(xiàn)對葡萄糖酸銻耐受的杜氏利什曼原蟲蟲體中富含半胱氨酸的蛋白高表達[27].Doliwa等利用差異凝膠電泳分析弓形蟲磺胺嘧啶耐藥株和敏感株的蛋白差異，發(fā)現(xiàn)耐藥株中蛋白磷酸酶的表達量顯著升高[28].

造成某一特定基因表達水平出現(xiàn)差異的原因有很多，可能是基因自身位點突變引起的，也有可能是其上游基因或其他相關(guān)基因發(fā)生突變或者自然選擇下發(fā)生連鎖效應(yīng)使其表達水平發(fā)生變化.如在對瘧原蟲耐藥性的研究中發(fā)現(xiàn)惡性瘧原蟲氯喹抗性基因(Pfcrt)中某些單核苷酸突變與氯喹耐藥相關(guān).對惡性瘧原蟲中耐青蒿素的蟲株分析發(fā)現(xiàn)pfkelch13基因某些位點的突變導(dǎo)致其構(gòu)象改變，使其下游基因磷脂酰肌醇-3激酶(PfPI3K)的表達量增加，導(dǎo)致PfPI3K效應(yīng)分子磷脂酰肌醇-3-磷酸(PI3P)的水平升高，從而誘導(dǎo)其對青蒿素產(chǎn)生耐藥性[29].EtCHP40基因在柔嫩艾美耳球蟲耐藥株中表達上調(diào)是因其自身出現(xiàn)突變引起還是由于上游基因突變引起的還需要進一步研究.