王 雪，肖勁洲，王永杰,2*

(1.上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海 201306; 2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品質(zhì)量安全貯藏保鮮風險評估實驗室(上海)，上海 201306)

真菌在生態(tài)系統(tǒng)中占據(jù)著重要的地位，其通過參與食物鏈和食物網(wǎng)中營養(yǎng)物質(zhì)的生產(chǎn)與運輸，深刻地影響并塑造著全球的生態(tài)系統(tǒng)[1]。有關(guān)真菌的研究相對起步較晚，尤其是水生真菌。隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，很多研究揭示了真菌大量存在于多種水生環(huán)境中，包括各種海洋棲息地[2]。Taylor等[3]對英國普利茅斯近海區(qū)域六年以來的真菌分布特征進行了研究，Gutiérrez等[4]在智利中部通過設(shè)立近岸遠岸梯度研究了鹽度對真菌造成的影響。Xu等[5]則研究了太平洋底部沉積物的真菌群落組成和多樣性。還有一些研究將重點放在海洋浮木上腐生的真菌[6]以及與藻類共生的真菌[7]上。目前，對真菌的群落組成和多樣性的相關(guān)研究逐步增加，但有關(guān)真菌在生態(tài)系統(tǒng)中的重要作用和功能的研究依舊很少[8]。已發(fā)現(xiàn)的真菌基本都是異養(yǎng)生物，不過這些真菌有很多不同的生活方式，包括腐生、互利共生、寄生[9]。有研究表明，真菌可能通過與其他生物和有機物質(zhì)的共生-腐生作用，在很大程度上影響水生環(huán)境食物網(wǎng)的結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性和功能性[10]。然而，大多數(shù)水生生態(tài)系統(tǒng)中，對于真菌與其他物質(zhì)間的相互作用是如何影響生態(tài)系統(tǒng)的重要功能，如海洋生物碳泵的效率和生態(tài)系統(tǒng)的健康，仍然知之甚少[11]。枸杞島位于長江口東南側(cè)外海、浙江省嵊泗縣馬鞍列島東部海域[12]。枸杞島貽貝養(yǎng)殖場屬于省級萬畝貽貝養(yǎng)殖示范區(qū)，大量的貽貝養(yǎng)殖架為周圍海洋環(huán)境中的藻類生長提供了依附基質(zhì)，使得枸杞島周邊海域適合藻類生長[13]。目前對于枸杞島的研究主要集中在對周圍海域藻類群落的結(jié)構(gòu)分布[14]、生長特性的相關(guān)研究[15]以及貽貝養(yǎng)殖對水體環(huán)境造成的影響[16]，對于真菌群落分布組成的研究還處于未知狀態(tài)。本研究應(yīng)用高通量測序方法對枸杞島環(huán)島表層海水真菌多樣性進行了研究，分析了真菌群落組成和多樣性特征，并探討了真菌潛在功能群分析。相關(guān)結(jié)果豐富了枸杞島水域微生物生態(tài)學(xué)研究，并為海水微生物資源的開發(fā)與利用，海洋環(huán)境保護提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 采樣設(shè)計與樣品采集 在浙江省舟山市枸杞島(122°46′1.64″E, 30°43′3.25″N)海域設(shè)計8個采樣站點，于水溫約30 ℃時采集距離表層8 m以內(nèi)海水水樣用于真菌群落組成多樣性的后續(xù)研究。將采集的表層水體放入500 mL的聚丙烯塑料瓶中，立刻裝入盛有冰袋的保溫箱中，迅速轉(zhuǎn)移至實驗室。上述水樣通過0.45 μm聚碳酸酯濾膜(Millipore，美國)過濾，在濾膜上富集微生物，-80 ℃保存濾膜，備用。

1.1.2 試劑與儀器 FastDNA? SPIN Kit for Soil試劑盒(MP Biomedicals，美國)；500 mL 無菌采樣瓶(辛森化學(xué)科技有限公司，上海)；保溫箱(Esky，澳大利亞)，冰袋(生工生物，上海)；便攜式 pH 計(SX-620,上海三信儀表廠)；電導(dǎo)率儀(SX-763,上海三信儀表廠)；手持式 GPS(Magellan，美國)及定深采水器；-80 ℃超低溫保存箱(DW-86L626，青島海爾)；小型臺式離心機(S430，德國Eppendorf)；PCR 儀(Mastercyscler?nexus gradient, 德國Eppendorf)；微量紫外分光光度計(NanoDrop ND-1000,美國Thermo Fisher Scientific)；核酸電泳系統(tǒng)(包括電泳儀及電泳槽(Sub-Cell GT,美國Bio-Rad))；DocTMXR+Molecular imager?凝膠成像分析系統(tǒng)(Bio-Rad，美國)；渦旋振蕩儀(Thermo Mixer?, 德國Eppendorf)；電子天平;一次性滅菌注射器；0.45 μm聚碳酸酯濾膜(Millipore，美國)；RNA-DNA free EP 管(AXYGEN，美國)；無 RNA 及 DNA 酶的移液槍頭(生工生物，上海)；紙質(zhì)凍存盒；稱量紙。

1.2 方法

1.2.1 水體DNA提取 濾膜上海水總微生物DNA的提取：濾膜經(jīng)-80 ℃冷凍后，使用無菌手術(shù)剪破碎并使用FastDNA?SPIN Kit for Soil提取，按說明書加入相應(yīng)試劑，最后采用100 μL DES溶液洗脫微生物總DNA并于-20 ℃保存。海水微生物總DNA的濃度及質(zhì)量分別通過微量紫外分光光度計及瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.2 ITS序列的擴增測序 正向引物ITS1F(5′-CTTGGTCATTAGAGGAGATAA-3′)和反向引物ITS2R(5′-GCTGCGTCTTCGATGC-3′)[17]對真菌ITS1區(qū)域進行PCR擴增。PCR擴增結(jié)束后，用2%瓊脂糖凝膠電泳進行產(chǎn)物驗證。將上述 PCR擴增產(chǎn)物進行產(chǎn)物純化和均一化，利用雙末端測序(Paired-End)的方法，構(gòu)建成小片段測序文庫，建好的文庫先進行文庫質(zhì)檢，質(zhì)檢合格的文庫于 Illumina Miseq平臺進行測序。高通量測序由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

1.2.3 測序數(shù)據(jù)處理 真菌ITS序列分析在QIIME[18]中進行。去除barcode、引物和低質(zhì)量序列(<200 bp)后，使用UCHIME算法檢測并去除嵌合體序列[19]。操作分類單元(OTU)使用UPARSE[20]在97%的相似性水平下通過聚類生成。通過在UNITE數(shù)據(jù)庫中進行BLAST比較，確定OTU物種信息。

1.2.4 生物信息學(xué)分析 使用QIIME軟件計算真菌稀釋曲線，并分別對每個樣本計算Sobs指數(shù)、Chao指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、Simpsoneven指數(shù)、Shannoneven指數(shù)等α多樣性指數(shù)。根據(jù) OTU 劃分和分類地位鑒定結(jié)果，使用 QIIME 軟件獲得每個樣本在各分類水平的群落組成。R(版本3.6.1)中vegan程輯包用來進行主坐標成分分析(PCoA)，以30 ℃下采集的8個環(huán)洋山港樣品作為對照評價枸杞島真菌群落的穩(wěn)定性。利用 FUNGuild v1.0將枸杞島表層水體真菌劃分為不同的營養(yǎng)型和功能群，結(jié)果數(shù)據(jù)保留置信度為“很可能”(Probable)和“極可能”(Highly probable)的OTUs及其類別。所有鑒定為復(fù)合營養(yǎng)型的群落均歸入“其他真菌”(Other fungi)，鑒定為復(fù)合多功能的群落分別統(tǒng)一為“其他腐生/病理真菌”(Other saprotrophic/pathogenic fungi)[21]。

1.2.5 系統(tǒng)發(fā)育分析 根據(jù)OTU序列在NCBI nr 數(shù)據(jù)庫比對結(jié)果獲得相似度在97%～100%的序列并去除冗余序列，加入同一屬其他種的代表序列，且用其他屬序列作為外群。利用最大似然法(Maximum Likely-hood，ML)以JC(JUkes-Cantor)模式構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(Bootstrap=1 000)。

2 結(jié)果與分析

2.1 枸杞島環(huán)島樣品真菌多樣性

對枸杞島8個環(huán)島表層水樣品ITS1區(qū)域測序，經(jīng)過優(yōu)化過濾低質(zhì)量序列，8個樣品共獲得242 024條序列。所有樣本的稀釋曲線(圖1)趨于平緩，表明測序深度合理，序列信息可以代表枸杞島真菌群落信息。Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)用以衡量真菌多樣性，Sobs指數(shù)和Chao指數(shù)用來評估真菌豐度，Simpsoneven指數(shù)、Shannoneven指數(shù)用以反映真菌均勻度。從α多樣性指數(shù)(表1)來看，枸杞島環(huán)島樣品的多樣性、豐度、均勻度基本一致。

表1 枸杞島真菌α多樣性指數(shù)

圖1 枸杞島真菌群落稀釋曲線

為了進一步確認枸杞島周圍水域的真菌組成是否穩(wěn)定，將洋山港在同一溫度下采集的樣品作為參照與枸杞島樣品進行主坐標成分分析(PCoA)(圖2)。樣品根據(jù)地點的不同完全分開，且同一地點的樣品聚集在一起，說明在枸杞島周邊水域的真菌群落組成基本相似，且與洋山港真菌組成差別很大。

圖2 枸杞島真菌群落稀釋曲線

2.2 枸杞島真菌群落組成與優(yōu)勢OTU系統(tǒng)發(fā)育分析

枸杞島8個樣品在97%的相似度下聚類，共獲得475個OTUs。所有樣品的OTUs序列鑒定屬于7門、22綱、51目、95科、158屬的真菌物種。在門水平下(圖3)，枸杞島表層水體真菌中，子囊菌門(Ascomycota)(56.9%的序列)和擔子菌門(Basidiomycota)(11.3%的序列)占據(jù)主要地位，約0.3%的真菌序列屬于接合菌門(Zygomycota)、聚合菌門(Glomeromycota)、Rozellomycota與壺菌門(Chytridiomycota)只占據(jù)非常少的序列(低于0.1%)。座囊菌綱(Dothideomycetes)、散囊菌綱(Eurotiomycetes)、糞殼菌綱(Sordariomycetes)、微球黑粉菌綱(Microbotryomycetes)在枸杞島真菌群落中占據(jù)優(yōu)勢地位(圖3)。這些優(yōu)勢菌綱的相對豐度分別為27.2%、17.8%、7.2%和4.9%。在屬水平下(圖3)，豐度前10的優(yōu)勢屬包括Hortaea、青霉菌屬(Penicillium)、曲霉菌屬(Aspergillus)、隱球菌屬(Cryptococcus)、鏈格孢屬(Alternaria)、紅酵母菌屬(Rhodotorula)、紅冬孢酵母屬(Rhodosporidium)與枝頂孢屬(Acremonium)。豐度最高的Hortaea屬相對豐度達到16.6%，其次的青霉菌屬、曲霉菌屬和隱球菌屬相對豐度分別為11.4%、6.2%和3.7%。

圖3 枸杞島真菌群落在門、優(yōu)勢菌綱、優(yōu)勢菌屬、豐度水平前10的OTUs水平下的群落豐度組成

為了進一步了解枸杞島優(yōu)勢真菌的親緣關(guān)系特點，對占據(jù)16.6%序列豐度的OTU1765進行系統(tǒng)發(fā)育分析(圖4)。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果，OTU1765基本可以認為屬于威尼克外瓶霉。

圖4 OTU1765基于序列相似度的 ML系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 枸杞島真菌群落生態(tài)功能群

真菌功能預(yù)測將真菌主要劃分為14個不同的功能群(圖5)，屬于三種營養(yǎng)類型，病理營養(yǎng)性(Pathotroph)、腐生營養(yǎng)性(Saprotroph)與共生營養(yǎng)性(Symbiotroph)。在枸杞島樣品中，大部分可預(yù)測的真菌都屬于植物病原菌(Plant Pathogen)和未定義腐生真菌(Undefined Saprotroph Fungi)，以及部分屬于寄生真菌(Fungal Parasite)和動物病原菌(Animal Pathogen)。

圖5 枸杞島真菌功能預(yù)測熱圖

3 討 論

枸杞島環(huán)島表層水8個樣品的真菌群落組成和多樣性都趨于穩(wěn)定，且與洋山港樣品有明顯差異，造成這種差異的主要影響因素可能在于兩地水環(huán)境的鹽度差異(枸杞島：21‰，洋山港：15‰)。在很多研究中都曾說明鹽度是影響真菌組成的重要影響因子之一[22-23]。

8個樣本中共聚類出475個OTUs，注釋到7門中，其中子囊菌門(Ascomycota)占據(jù)最優(yōu)勢地位，擔子菌門(Basidiomycota)次之。迄今為止，從海洋環(huán)境中鑒定出的絕大多數(shù)真菌都屬于子囊菌門和擔子菌門[24]。無論是在中國近海[25]還是在英國西海峽[3]附近，子囊菌都是近海區(qū)域的優(yōu)勢真菌，這也與Jones[26]從海洋生境中分離出的真菌主要隸屬于子囊菌綱的研究相一致。擔子菌很可能在海洋沉積物深處占據(jù)主要地位[27]，本研究中擔子菌占據(jù)第二優(yōu)勢地位的原因很可能是采集的枸杞島表層水體樣品，在樣品中只檢測到少量的序列屬于接合菌門(Zygomycota)這與前人在中國渤海和黃海[28]的研究是一致的。在一些研究中，接合菌門被檢測存在于地下水環(huán)境中[2]。枸杞島作為貽貝養(yǎng)殖基地同時也是旅游景點，可能由于生活用水排放到附近海域中，造成了少量接合菌門的存在。在屬水平下，一些占據(jù)優(yōu)勢地位的真菌屬于子囊菌門霉菌(青霉菌屬、曲霉菌屬)和擔子菌門酵母(隱球菌屬、紅酵母菌屬等)，這些屬的真菌同時也在歐洲附近海域[29]和深海海洋沉積物[27]中被檢測到。豐度最高的屬Hortaea在海南?？跍厝婢郝渲幸舱紦?jù)優(yōu)勢地位[30]。

在系統(tǒng)發(fā)育分析中，豐度最高的OTU1765屬于威尼克外瓶霉真菌。威尼克外瓶霉真菌被認為是一種會導(dǎo)致人患黑癬的病原體。黑癬是一種慢性淺表真菌疾病，一般出現(xiàn)在熱帶并主要感染年輕人包括兒童，感染途徑主要通過病原真菌直接與傷口接觸并常常與土壤媒介息息相關(guān)[31]。同時，這種真菌所在的屬也包含很多植物致病真菌并被廣泛認為屬于嗜鹽菌[32]。此外，很多未鑒定真菌與OTU1765的序列相似度均高于97%。這些未鑒定真菌的來源非常廣泛，從環(huán)境樣品印度洋中部海底沉積物[33]、中國南海附近海域[34]中以及從可可葉[35]和臺灣海岸附近的圓葉牡荊[36]等植物上均有檢出。說明威尼克外瓶霉真菌可能廣泛存在于很多水生環(huán)境以及海底沉積物中，同時也可能與很多植物之間存在腐生關(guān)系。枸杞島周圍水域為海水環(huán)境，適宜威尼克外瓶霉真菌生長，附近的養(yǎng)殖架可能提供了威尼克外瓶霉真菌生長的良好條件。同時，作為旅游景點的枸杞島居住著很多漁民，生活污水排放可能是這種潛在的人類致病真菌占據(jù)主要地位的原因之一。

經(jīng)過FUNGuild劃分的真菌功能特征，大部分真菌被劃分為植物病原菌、腐生真菌、真菌寄生蟲和動物病原菌。很多真菌被認為是海洋中花粉管、葉子和樹木的分解者[37]或感染海洋藻類和動物的病原體[38]。枸杞島附近海域的貽貝養(yǎng)殖架為藻類生長繁殖提供了良好的條件[13]，很多感染藻類和動物的病原真菌可能會因此在附近聚集。

本研究通過擴增高通量測序分析枸杞島附近海域表層海水的真菌群落組成多樣性，發(fā)現(xiàn)枸杞島環(huán)島真菌群落組成及多樣性基本保持穩(wěn)定，與洋山港真菌群落的差異可能主要是由于鹽度差異造成的。其中的優(yōu)勢種群是子囊菌門。優(yōu)勢菌綱為座囊菌綱。最大的優(yōu)勢真菌屬包括Hortaea、青霉菌屬、曲霉菌屬。其中豐度最高的OTU1765屬于威尼克外瓶霉真菌，其與人類及植物病原真菌息息相關(guān)。枸杞島真菌群落的生態(tài)功能組成比較豐富，主要屬于植物病原菌(Plant Pathogen)以及未定義腐生真菌(Undefined Saprotroph)。本研究為了解枸杞島附近海域表層水真菌群落組成與潛在功能提供了參考。