蔣建東，紀(jì)彥晗，王保戰(zhàn)

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物學(xué)系 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)業(yè)環(huán)境微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210095)

候選門級(jí)輻射類群(candidate phyla radiation，CPR)細(xì)菌是指一類由候選門細(xì)菌組成的細(xì)菌類群，該概念于2015年由Brown等人提出[1]。CPR細(xì)菌不僅細(xì)胞體積比普通細(xì)菌小(大多數(shù)CPR能夠通過(guò)0.2 μm的微孔濾膜)，與之對(duì)應(yīng)的其基因組也普遍較小(平均基因組≤1.25 Mbp，且缺少很多核心代謝途徑的編碼基因)。因此，推測(cè)絕大多數(shù)CPR以共生或者寄生的方式存在于各類生態(tài)環(huán)境中[2]。CPR細(xì)菌的16S rRNA基因結(jié)構(gòu)特殊，常常包含大量插入序列，目前常規(guī)細(xì)菌通用PCR引物無(wú)法有效擴(kuò)增大多數(shù)的CPR細(xì)菌，因此CPR細(xì)菌長(zhǎng)期以來(lái)一直被忽視[3]。CPR細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育地位特殊，在生命進(jìn)化樹上能夠形成龐大且“獨(dú)立”的分支[4-5]，與細(xì)菌域的其他類群顯著性地分開(圖1)。2016年Hug等從JGI數(shù)據(jù)庫(kù)中搜集了30 437個(gè)微生物基因組，并從中挑選出屬水平的3 083個(gè)高質(zhì)量草圖基因組/基因組完成圖作為代表基因組，然后分別使用16S rRNA基因序列、16個(gè)保守的核糖體蛋白串聯(lián)序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，同樣證明CPR細(xì)菌的獨(dú)特進(jìn)化地位[4]。此外，2019年Zhu等搜集了10 575個(gè)基因組，分別用381個(gè)標(biāo)記基因、30個(gè)保守核糖體蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，同樣也得到了類似的結(jié)果[5]。

圖1 CPR細(xì)菌在生命進(jìn)化樹上的進(jìn)化地位

CPR細(xì)菌在地球上分布非常廣泛，存在于地下水[1，6-8]、鹽湖[9-10]、口腔[11-14]、海洋[15-17]等各種生境中，在地球生物化學(xué)循環(huán)中也扮演著重要角色。隨著基因組學(xué)與生物信息學(xué)的快速興起與發(fā)展，截止2018年科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)CPR細(xì)菌包含了70多個(gè)門級(jí)水平的分支[2]，2019年科學(xué)家們預(yù)測(cè)CPR細(xì)菌可能占據(jù)細(xì)菌多樣性的四分之一[18]。盡管如此，人們對(duì)CPR這樣一個(gè)特殊的細(xì)菌類群的了解仍處于初步階段。人們一直推測(cè)CPR細(xì)菌以共生或寄生的方式存在于環(huán)境中，極難獲得純培養(yǎng)菌株。因此，人們對(duì)CPR生理特性、代謝功能與機(jī)制等知之甚少。到目前為止，僅有一類CPR細(xì)菌(稱為TM7)在實(shí)驗(yàn)室條件下得到了純的二元培養(yǎng)物，TM7這類微生物能且僅能依附于宿主進(jìn)行生長(zhǎng)[11，13-14，19]。

基于CPR細(xì)菌的重要性以及獨(dú)特性，本文重點(diǎn)針對(duì)CPR細(xì)菌的發(fā)現(xiàn)歷程，細(xì)胞形態(tài)、基因組學(xué)特征和遺傳進(jìn)化，生理代謝潛能，生物地球化學(xué)元素循環(huán)和實(shí)驗(yàn)室純培養(yǎng)等方面進(jìn)行綜述，為未來(lái)CPR細(xì)菌的進(jìn)一步研究提供參考。

1 CPR細(xì)菌的研究歷程

1996年Rheims等[20]、1998年P(guān)hilip等[21]在通過(guò)16S rRNA基因?qū)Νh(huán)境樣品進(jìn)行細(xì)菌檢測(cè)時(shí)，發(fā)現(xiàn) TM7和OP11(以采樣地點(diǎn)的縮寫命名)分支能在進(jìn)化樹上形成獨(dú)立的分支(無(wú)法定位到已知菌屬中)，這是第一次發(fā)現(xiàn)CPR細(xì)菌的存在(圖2)，但當(dāng)時(shí)并未引起科研界的足夠重視。2012年Wrighton等[6]首次使用宏基因組技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)地下水中存在特殊的未培養(yǎng)微生物(BD1-5、OP11、OD1)，然而此類微生物的分類地位在當(dāng)時(shí)并未明確。2015年Brown等[1]通過(guò)宏基因組測(cè)序技術(shù)分析了美國(guó)科羅拉多河地下水樣品，共獲得了797個(gè)CPR細(xì)菌的基因組(metagenome-assembled genomes, MAGs)，這些基因組分屬于35個(gè)細(xì)菌門。進(jìn)一步從這些MAGs中提取16S rRNA基因序列并剔除其中的插入序列后構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)這些新的CPR細(xì)菌門與之前發(fā)現(xiàn)的一些候選門(OD1、OP11)聚類在一起，且在系統(tǒng)發(fā)育樹上形成獨(dú)立分支。由于這些特殊的細(xì)菌在當(dāng)時(shí)都無(wú)法在實(shí)驗(yàn)室條件下獲得純培養(yǎng)物，Brown等將這類由候選門細(xì)菌組成的單系分支命名為候選門級(jí)輻射類群(candidate phyla radiation，CPR)。因缺乏對(duì)CPR生理代謝等多方面的了解，最初發(fā)現(xiàn)的CPR細(xì)菌均以微生物學(xué)終身成就獎(jiǎng)獲得者的姓名來(lái)命名CPR門(比如以美國(guó)著名的微生物學(xué)家Carl Woese 命名了Woesebacteria門)。自2015年后，越來(lái)越多的CPR細(xì)菌類群被發(fā)現(xiàn)，截至2018年已發(fā)現(xiàn)至少70多個(gè)門級(jí)水平的CPR分支[2]。然而，目前在實(shí)驗(yàn)室條件下能獲得純培養(yǎng)的CPR細(xì)菌僅有TM7一個(gè)門級(jí)分支(已從人體口腔與廢水中分離出5株TM7[11，13-14，19])。2013年Rinke等[22]對(duì)來(lái)自不同環(huán)境樣品中的未(難)培養(yǎng)微生物進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序時(shí)發(fā)現(xiàn)，OD1、OP11、GN-02三個(gè)門的CPR細(xì)菌在系統(tǒng)發(fā)育樹上形成單系分支，為直觀認(rèn)識(shí)此3個(gè)門之間的關(guān)系，Rinke等便提議將由這3個(gè)門組成的“超系”命名為佩特斯細(xì)菌(Patescibacteria)。2018年P(guān)arks等在構(gòu)建微生物標(biāo)準(zhǔn)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)時(shí)發(fā)現(xiàn)Patescibacteria與CPR代表著同一類細(xì)菌，于是便提議將CPR細(xì)菌重新命名為Patescibacteria，當(dāng)時(shí)包含了至少65個(gè)門的CPR細(xì)菌分類[23]。截至2021年8月，CPR細(xì)菌一共包含了超過(guò)75個(gè)門級(jí)水平的分支(表1)。

圖2 CPR細(xì)菌的發(fā)現(xiàn)與研究歷程

表1 現(xiàn)已知CPR細(xì)菌在門水平的成員信息

近年來(lái)，針對(duì)CPR細(xì)菌在自然環(huán)境中的分布被廣泛報(bào)道。相比較于其他生境，目前對(duì)CPR細(xì)菌的研究主要以水體環(huán)境為主，CPR細(xì)菌分布在淡水湖[30]、海水[15]、廢水處理廠[31]、地下水[1，6-7]等水生態(tài)系統(tǒng)中似乎更廣泛，且豐度較高。此外，CPR細(xì)菌在沉積物[32]、植物根系[33]、土壤[34]中也有分布的報(bào)道。有趣的是，在動(dòng)物[35]與人體[11-13，36]中也檢測(cè)到了CPR細(xì)菌的存在，并被認(rèn)為可能與人類健康有關(guān)。由此可見，CPR細(xì)菌在不同的生態(tài)系統(tǒng)中廣泛分布，其扮演著重要的生理與生態(tài)角色。

2 CPR特點(diǎn)介紹

2.1 CPR細(xì)胞形態(tài)、基因組學(xué)特征和系統(tǒng)進(jìn)化地位

細(xì)胞體積小、基因組精簡(jiǎn)是CPR細(xì)菌相比較于普通細(xì)菌的一個(gè)最顯著特征。2015年Brown分別使用1.2、0.2、0.1 μm系列濾膜串聯(lián)過(guò)濾地下水時(shí)，通過(guò)結(jié)合利用16S rRNA基因與宏基因組測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)在0.2 μm與0.1 μm濾膜上存在大量CPR細(xì)菌；使用冷凍透射電鏡觀測(cè)到部分CPR細(xì)菌能穿過(guò)0.2 μm的濾膜，而在0.1 μm濾膜上被富集[1]。2015年He等[11]從人體口腔中分離培養(yǎng)出一株寄生于放線菌的CPR細(xì)菌TM7，在電鏡下觀察到TM7細(xì)胞大小在0.2～0.3 μm之間。2021年Batinovic等[19]從廢水中分離培養(yǎng)出一株能烈性裂解起泡細(xì)菌(Gordoniaamarae)的TM7，電鏡觀測(cè)到的細(xì)胞大小在0.3～0.4 μm之間。通過(guò)電鏡觀察，CPR細(xì)菌形態(tài)主要呈現(xiàn)桿狀或者球狀[7，19]。

目前獲得的CPR細(xì)菌的基因組大小約為1 Mbp，與普通細(xì)菌、古菌、專性昆蟲共生體相比，CPR細(xì)菌的基因組更接近于專性昆蟲共生體的基因組，顯著小于普通細(xì)菌和古菌[2]。CPR細(xì)菌基因組中存在約50%左右功能未知的基因，同時(shí)保守基因也少于我們熟知的普通細(xì)菌。Castelle等對(duì)1 000多個(gè)CPR細(xì)菌基因組進(jìn)行分析比較時(shí)發(fā)現(xiàn)，大部分CPR細(xì)菌的基因組中都存在與同源重組、堿基切除修復(fù)和錯(cuò)配修復(fù)等相關(guān)的基因。因此，Castelle等認(rèn)為CPR細(xì)菌的精簡(jiǎn)基因組是遺傳自祖先的特征，并非是基因組進(jìn)化過(guò)程中發(fā)生了縮減[2]。Moreira等比對(duì)3個(gè)CPR細(xì)菌候選門Absconditabacteria(SR1)的基因組后，發(fā)現(xiàn)此類CPR細(xì)菌只有390個(gè)保守基因。同時(shí)，Moreira等將SR1門與其他CPR細(xì)菌候選門Gracilibacteria和 Peregrinibacteria(PER)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，這3個(gè)CPR門可能最近丟失了共同祖先所具有的30%～50%的基因，進(jìn)而推測(cè)這些CPR細(xì)菌的基因組內(nèi)容有活躍的動(dòng)態(tài)進(jìn)化[10]。CPR精簡(jiǎn)型基因組特征是源于祖先遺傳還是縮減進(jìn)化存在一定的爭(zhēng)論，仍然有待于進(jìn)一步研究。

Brown等對(duì)地下水樣品進(jìn)行宏基因組測(cè)序并拼接后，將≥800 bp的16S rRNA基因進(jìn)行聚類分析，發(fā)現(xiàn)31%的CPR細(xì)菌的16S rRNA基因中都含有≥10 bp的插入片段，插入位點(diǎn)聚集在16S rRNA基因的可變區(qū)和保守區(qū)的幾個(gè)不同的位置。大多數(shù)≥500 bp的插入序列編碼起催化作用的RNA內(nèi)含子或者開放閱讀框(ORF)[1]。Castelle等[2]發(fā)現(xiàn)插入片段現(xiàn)象在一些CPR細(xì)菌的23S rRNA基因與tRNA基因中也存在。2016年Eloe-Fadrosh等通過(guò)宏基因組學(xué)技術(shù)，發(fā)現(xiàn)使用16S rRNA基因通用引物擴(kuò)增子檢測(cè)微生物多樣性時(shí)會(huì)遺漏掉約70%的CPR細(xì)菌[3]。由于通用引物的低覆蓋率以及CPR細(xì)菌16S rRNA基因的特殊性(含插入序列)，導(dǎo)致CPR細(xì)菌在宏基因組學(xué)技術(shù)出現(xiàn)前一直被人們所忽略。此外，CPR細(xì)菌基因組過(guò)度精簡(jiǎn)，缺少重要的能量代謝基因，推測(cè)其普遍通過(guò)寄生或共生生長(zhǎng)。因此，使用傳統(tǒng)的細(xì)菌分離培養(yǎng)方法很難獲得CPR細(xì)菌的純培養(yǎng)物。2018年Castelle等[2]搜集了1 000多個(gè)CPR細(xì)菌與DPANN古菌的基因組，用以調(diào)查CPR細(xì)菌的生物學(xué)特性，發(fā)現(xiàn)CPR細(xì)菌基因組中通常含有很多轉(zhuǎn)氨酶基因，用于轉(zhuǎn)化從環(huán)境中獲取的氨基酸，并用于自身合成蛋白質(zhì)，同時(shí)將其作為潛在的碳源和能源。CPR細(xì)菌基因組中也具有核酸酶基因，能將獲得的核苷酸重新轉(zhuǎn)化為DNA 或RNA。CPR細(xì)菌基因組中還有許多編碼基因參與了IV型菌毛的產(chǎn)生，IV型菌毛可能在DNA吸收[37]、化合物分泌以及與周圍細(xì)胞的互作中發(fā)揮作用[7]。此外，CPR細(xì)菌基因組中包含了大量編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的基因[38]，用來(lái)生產(chǎn)重組參與細(xì)胞表面與胞外環(huán)境附著和調(diào)節(jié)的糖和糖蛋白。更重要的是，與普通細(xì)菌通過(guò)CRISPR-Cas 來(lái)適應(yīng)性免疫系統(tǒng)防御病毒入侵不同，大多數(shù)CPR細(xì)菌都通過(guò)限制性修飾與頓挫感染(abortive infection)來(lái)防御病毒[39]。

2.2 生理代謝特征與潛能

精簡(jiǎn)的基因組是CPR細(xì)菌擁有有限但極為罕見的代謝潛能的重要原因之一。目前的研究表明，大部分的CPR細(xì)菌缺乏完整的氨基酸、核苷酸以及脂質(zhì)合成途徑[2]，大多數(shù)CPR細(xì)菌不具備完整的呼吸鏈，缺失包括NADH脫氫酶和氧化磷酸化復(fù)合物Ⅱ-Ⅳ在內(nèi)的相關(guān)基因，完全缺失與三羧酸(TCA)循環(huán)有關(guān)的基因[2]。然而，在對(duì)CPR細(xì)菌代謝潛能分析時(shí)也有發(fā)現(xiàn)在其基因組中存在罕見的代謝相關(guān)基因，此代謝通路的上下游基因卻不完整，很可能與CPR細(xì)菌基因組中存在諸多功能未知基因有關(guān)[2]。CPR細(xì)菌基因組中常常含有編碼大量糖苷水解酶(GHs)基因，能將復(fù)雜的含碳化合物降解形成小分子化合物進(jìn)入糖酵解途徑[26]。大多數(shù)CPR細(xì)菌不具備完整的糖酵解(EMP)途徑，缺少催化EMP途徑關(guān)鍵酶基因(如磷酸果糖激酶PFK基因等)。CPR細(xì)菌基因組中通常含有磷酸戊糖途徑(Pentose Phosphate Pathway，PPP)的相關(guān)基因[2]，因此，推測(cè)CPR細(xì)菌能通過(guò)PPP途徑將6-磷酸果糖轉(zhuǎn)化為3-磷酸甘油醛。通常，丙酮酸或者乙酰CoA是CPR細(xì)菌中心碳代謝的終產(chǎn)物，CPR細(xì)菌一般會(huì)先將丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙酰CoA，然后進(jìn)一步將其利用生產(chǎn)短鏈脂肪酸來(lái)平衡碳和電子流[2]。如許多CPR細(xì)菌Parcubacteria(OD1)、Dojkabacteria、Microgenomates(OP11)被預(yù)測(cè)可以利用古菌中常見的ADP-acetyl-CoA合成酶(ADP-Acs)來(lái)生成乙酸鹽[40]。一些Peregrinibacteria(PER)也可以通過(guò)細(xì)菌中常見的乙酸激酶(Ack)和磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶(Pta)來(lái)產(chǎn)生乙酸。除了乙酸鹽外，許多CPR細(xì)菌還能通過(guò)發(fā)酵產(chǎn)生乳酸、甲酸或乙醇等產(chǎn)物。在含乙酸鹽的地下水中經(jīng)常發(fā)現(xiàn)某些CPR細(xì)菌被富集，其中有些CPR細(xì)菌基因組編碼AMP-乙酰CoA合成酶，表明某些CPR細(xì)菌可能具有乙酸鹽利用能力[1]。

2018年Castelle等[2]搜集了約1 000個(gè)CPR細(xì)菌與DPANN古菌的基因組，發(fā)現(xiàn)雖然CPR細(xì)菌似乎都存在以發(fā)酵為基礎(chǔ)的生活方式，但不同門水平CPR細(xì)菌的生物合成能力有很大差異。某些來(lái)自Peregrinibacteria(PER)門的基因組具有相對(duì)較多的核心生物代謝能力，似乎都具有合成核苷酸、某些氨基酸和輔因子的能力，但不具備合成脂肪酸的能力。與Peregrinibacteria(PER)門相比，OD1超系成員普遍都缺乏完整的核心生物代謝能力[2]。有趣的是，“CandidatusParcunitrobacternitroensis”[41]不僅具有廣泛的代謝能力，擁有基本完整的電子傳遞鏈，擁有發(fā)酵和呼吸能力以及氮和脂肪酸的代謝能力，最重要的是還含有以氮化合物進(jìn)行呼吸所涉及的所有酶(亞硝酸鹽還原酶、羥胺氧化還原酶和一氧化氮還原酶)的編碼序列。這些序列與其他生物體中發(fā)現(xiàn)的序列差異顯著，表明“CandidatusParcunitrobacternitroensis”以氮化合物進(jìn)行呼吸的基因不是通過(guò)基因水平轉(zhuǎn)移的方式從非CPR細(xì)菌中獲得的。與代謝能力相對(duì)復(fù)雜的CPR細(xì)菌相比，Katanobacteria、KAZAN和Dojkabacteria這3個(gè)門的CPR細(xì)菌生物合成與代謝能力最弱，它們?nèi)狈铣珊塑账?、氨基酸、脂質(zhì)、肽聚糖以及各種輔因子的編碼基因[2]。因此，我們?cè)陉P(guān)注CPR細(xì)菌代謝潛能與生態(tài)學(xué)功能時(shí)，不能因?yàn)槠涔灿械囊恍┥飳W(xué)特征就將整個(gè)CPR細(xì)菌一概而論，而是應(yīng)該針對(duì)不同門的CPR細(xì)菌分門別類地進(jìn)行研究。

2.3 生物地球化學(xué)元素循環(huán)

盡管CPR細(xì)菌精簡(jiǎn)的基因組限制了其代謝能力，但CPR細(xì)菌在地球生物化學(xué)循環(huán)中仍然可能發(fā)揮著重要而關(guān)鍵的作用。CPR細(xì)菌參與碳素循環(huán)，具有潛在的固定二氧化碳與降解復(fù)雜含碳化合物的能力。2013年Campbell等[42]結(jié)合流式細(xì)胞儀分選與單細(xì)胞基因組擴(kuò)增技術(shù)，從人類口腔樣品中分離并獲得一支CPR-SR1的基因組，發(fā)現(xiàn)其基因組中含有編碼1,5-二磷酸核酮糖羧化酶(RubisCO)的基因，具有固定二氧化碳的潛能，與先前研究中發(fā)現(xiàn)的Peregrinibacteria(PER)門一樣，存在古菌型RubisCO[6]。多項(xiàng)研究表明CPR細(xì)菌的RubisCO與古菌十分類似，屬于古菌II/III類型和bacterial-like III類型[6，38，42-43]。2016年Wrighton等[43]將Peregrinibacteria(PER)門中的RubisCO基因進(jìn)行了體外表達(dá)，驗(yàn)證了其具有古菌II/III類型的固定二氧化碳的活性。2017年Danczak等[25]將地下水樣品宏基因組測(cè)序獲得的71個(gè)CPR細(xì)菌基因組與2 000個(gè)其他CPR細(xì)菌基因組一并分析，確定并統(tǒng)計(jì)了135個(gè)不同糖苷水解酶(glycoside hydrolase，GH)家族的存在和數(shù)量，發(fā)現(xiàn)在所有CPR細(xì)菌門中，雖然降解底物(如直鏈淀粉、纖維素)的能力相似，但行使這些能力的糖苷水解酶GH基因不同。盡管幾乎所有的CPR細(xì)菌基因組都能編碼半纖維素側(cè)鏈降解酶，但具體的糖苷水解酶GH基因在不同的門之間存在差異。2019年Vigneron等[44]使用過(guò)濾與宏基因組測(cè)序相結(jié)合的方法對(duì)熱巖湖泊中的CPR細(xì)菌進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)每個(gè)CPR細(xì)菌基因組中平均能鑒定出(29±12)個(gè)碳水化合物活性酶(CAZy)基因，表明CPR細(xì)菌具有降解復(fù)雜含碳化合物的潛力。

不僅如此，在許多CPR細(xì)菌基因組中還發(fā)現(xiàn)參與反硝化的基因，可見CPR細(xì)菌可能還參與了氮素循環(huán)。氮素循環(huán)是生物圈內(nèi)基本的物質(zhì)循環(huán)之一，而反硝化作用是氮素循環(huán)中重要一環(huán)，它與厭氧氨氧化一起將被固定的氮元素以N2形式返還至大氣中。Danczak等[25]對(duì)地下水樣品進(jìn)行宏基因組測(cè)序獲得71個(gè)CPR細(xì)菌基因組，有4個(gè)獨(dú)立metagenome-assembled genomes(MAGs)，在其中發(fā)現(xiàn)了亞硝酸鹽還原酶基因(nirK，反硝化過(guò)程中的關(guān)鍵酶基因)分布于2個(gè)不同的CPR細(xì)菌門(Kaiserbacteria和Harrisonbacteria)，這種含銅的亞硝酸鹽還原酶能夠?qū)喯跛猁}還原為一氧化氮。同時(shí)，將獲得的CPR細(xì)菌的nirK基因序列與其他nirK基因序列比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)CPR細(xì)菌的nirK基因在進(jìn)化樹上能形成單獨(dú)的進(jìn)化支。另有研究發(fā)現(xiàn)，CPR細(xì)菌中的一個(gè)特殊的個(gè)體具有一個(gè)基本完整的電子傳遞鏈，其基因組編碼了氮呼吸過(guò)程中涉及的所有酶基因(硝酸鹽還原酶、羥胺氧化還原酶和一氧化氮還原酶)，同樣它們的序列與其他生物體內(nèi)同工酶的序列差異顯著[41]。2017年León-Zayas等[45]研究發(fā)現(xiàn)CPR細(xì)菌中的Parcubacteria也具有硝酸鹽還原的能力。綜上，多項(xiàng)研究表明CPR細(xì)菌中的某些類群可能參與地球生物化學(xué)循環(huán)中的氮素循環(huán)。

硫是生命必需元素，CPR細(xì)菌可能也參與硫的氧化還原。2012年Wrighton等[6]通過(guò)宏基因組學(xué)的方法獲得了49個(gè)MAGs，發(fā)現(xiàn)在CPR細(xì)菌OD1與OP11的基因組中含有3種鐵氫酶(Fe-hydrogenase)和23種鎳鐵氫酶(NiFe-hydrogenase)編碼基因。進(jìn)一步通過(guò)系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)其中17種鎳鐵氫化酶與古菌熱球菌目(Thermococcales)的3b型胞質(zhì)氫化酶序列高度相似，推測(cè)其可能參與多硫化物的還原。2021年He等[8]在比較研究一個(gè)農(nóng)業(yè)污染嚴(yán)重的地下水和七個(gè)干凈的地下水中微生物群落時(shí)，共獲得746個(gè)CPR細(xì)菌與DPANN古菌基因組，發(fā)現(xiàn)CPR細(xì)菌占地下水微生物群落豐度的3%～40%，并且通過(guò)檢測(cè)評(píng)估了其參與地球生物化學(xué)代謝過(guò)程中的關(guān)鍵酶基因，發(fā)現(xiàn)在3個(gè)CPR細(xì)菌基因組中含有硫雙加氧酶基因(sdo)，以及許多CPR細(xì)菌基因組中含有許多硫酸鹽還原相關(guān)的基因(sat、cysC和cysN)，推測(cè)CPR細(xì)菌在硫循環(huán)過(guò)程中可能發(fā)揮作用。

2.4 CPR的分離培養(yǎng)和生理代謝特征

隨著高通量測(cè)序技術(shù)在微生物學(xué)研究領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，越來(lái)越多的CPR細(xì)菌在各種生態(tài)環(huán)境中被檢測(cè)到，但人們目前對(duì)于CPR細(xì)菌的認(rèn)識(shí)仍大多來(lái)自于宏基因組測(cè)序拼接得到的MAGs，缺少對(duì)純培養(yǎng)物的研究。在CPR細(xì)菌70多個(gè)門級(jí)分類中，目前僅有TM7分離得到可穩(wěn)定傳代的二元培養(yǎng)物。此外，目前還缺乏可靠的標(biāo)準(zhǔn)化的獲得CPR細(xì)菌與其宿主純的二元培養(yǎng)物的方法。

2015年He等[11]通過(guò)針對(duì)CPR細(xì)菌具有鏈霉素抗性特性，不斷提高鏈霉素濃度獲得了一個(gè)穩(wěn)定的TM7與其宿主共培養(yǎng)的富集液，首次在實(shí)驗(yàn)室條件下培養(yǎng)出CPR細(xì)菌與宿主共存的二元培養(yǎng)物。He等最初也嘗試采用傳統(tǒng)的平板涂布方法分離CPR細(xì)菌TM7x，但一直未能成功，轉(zhuǎn)而經(jīng)由多個(gè)共現(xiàn)性分析發(fā)現(xiàn)口腔中的TM7x與放線菌宿主XH001具有一定的相關(guān)性，進(jìn)而不斷嘗試更換分離培養(yǎng)方法，發(fā)現(xiàn)盡管XH001能在平板上形成單菌落，但卻無(wú)法獲得TM7x的單菌落。此外，無(wú)論是添加共培養(yǎng)的廢液，還是加熱殺死XH001都無(wú)法讓TM7x單獨(dú)生長(zhǎng)，可見CPR細(xì)菌TM7x嚴(yán)重依賴宿主XH001菌株。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在營(yíng)養(yǎng)豐富條件下TM7x與XH001能共存；但當(dāng)處于饑餓條件下時(shí)，單獨(dú)培養(yǎng)的XH001能保留活性，而與TM7x一同培養(yǎng)時(shí)XH001大部分失活，而TM7x卻保留活力。通過(guò)透射電鏡(TEM)觀測(cè)，發(fā)現(xiàn)XH001表面附著有TM7x(圖3a)，并且XH001細(xì)胞膜出現(xiàn)破損，因此推斷TM7x主要寄生于XH001表面，而非共生關(guān)系。

2020年Murugkar等[13]總結(jié)出前人研究的四點(diǎn)經(jīng)驗(yàn)：①TM7是一種專性寄生微生物，需要與宿主共存才能生長(zhǎng)；②TM7細(xì)胞體積小，能夠通過(guò)0.22 μm濾膜而與其他細(xì)菌分開；③TM7與宿主的共培養(yǎng)物在肉湯培養(yǎng)基中能夠穩(wěn)定傳代，但在平板上無(wú)法形成TM7的單菌落；④推測(cè)TM7的宿主來(lái)自于放線菌門、厚壁菌門或梭桿菌門。Murugkar等[13]通過(guò)過(guò)濾收集TM7后，從推測(cè)的宿主潛在門中選取潛在宿主，將二者在肉湯培養(yǎng)基中進(jìn)行共培養(yǎng)，最終成功分離出4株TM7(包含TM7x)。

Gordoniaamarae是最常見的起泡細(xì)菌之一，尚未分離出裂解G.amarae的噬菌體，其基因組內(nèi)存在多種抗病毒機(jī)制來(lái)抵抗噬菌體感染。2021年Batinovic等[19]在篩選廢水處理廠中一株起泡細(xì)菌(G.amarae)的噬菌體時(shí)，將原位廢水通過(guò)0.45 μm濾膜過(guò)濾后，直接把濾液滴在含起泡細(xì)菌單菌落的平板上，意外篩選到一株能烈性裂解起泡細(xì)菌的CPR細(xì)菌TM7-JR1。TM7-JR1卻能夠?qū).amarae裂解，為將來(lái)通過(guò)生物方法防治廢水處理中的起泡細(xì)菌(產(chǎn)生泡沫)提供了一種新的策略。

2021年Moreira等[10]將西歐一個(gè)永久咸水湖底采集的微生物墊置于過(guò)濾后的原位水體中進(jìn)行培養(yǎng)，幾個(gè)星期后觀測(cè)到大量的光合細(xì)菌，同時(shí)在光合細(xì)菌的表面發(fā)現(xiàn)有一個(gè)或多個(gè)深色的無(wú)鞭毛小細(xì)胞附著(圖3b、c)。研究人員通過(guò)顯微操作(用毛細(xì)管捕捉)搜集附著了小細(xì)胞的光合細(xì)菌，進(jìn)行全基因組擴(kuò)增測(cè)序(whole genome amplification，WGA)，獲得兩個(gè)基因組，分別屬于伽馬變形菌門光合細(xì)菌與CPR細(xì)菌候選門Absconditabacteria(SR1)，其中SR1的基因組比較完整，而光合細(xì)菌的基因組完整度只有15%左右，推測(cè)可能是SR1吸收消耗了光合細(xì)菌的DNA。雖然文中并未獲得CPR細(xì)菌與光合細(xì)菌宿主的二元純培養(yǎng)物，但基本確定了CPR細(xì)菌與宿主之間一對(duì)一的寄生或者捕食關(guān)系。

圖3 CPR細(xì)菌與宿主細(xì)胞共存的顯微照片(圖片已獲再版許可)

綜合考慮CPR細(xì)菌精簡(jiǎn)的細(xì)菌基因缺少關(guān)鍵核心生物合成與代謝關(guān)鍵基因的特征，以及目前CPR細(xì)菌分離培養(yǎng)的經(jīng)驗(yàn)，可以初步判斷絕大多數(shù)CPR細(xì)菌無(wú)法單獨(dú)生長(zhǎng)，需要以其他生物作為宿主營(yíng)寄生或者共生生長(zhǎng)。

3 展 望

近年來(lái)急速興起的組學(xué)技術(shù)為自然環(huán)境以及人工環(huán)境中未培養(yǎng)微生物的生態(tài)學(xué)分布、潛在生理代謝特征、遺傳進(jìn)化等研究提供了強(qiáng)有力的工具，使得CPR細(xì)菌等未培養(yǎng)微生物進(jìn)入我們的研究視野，成為微生物學(xué)界關(guān)注的焦點(diǎn)?？紤]到CPR細(xì)菌獨(dú)特的生命進(jìn)化地位、生理代謝特征、重要生態(tài)學(xué)功能、高度的物種多樣性和廣泛分布的特點(diǎn)，及其與人類健康存在潛在的重要關(guān)系，認(rèn)為未來(lái)要在以下幾個(gè)方向加強(qiáng)對(duì)CPR細(xì)菌的研究。①CPR細(xì)菌物種多樣性與生態(tài)學(xué)分布規(guī)律：基于宏基因組和宏轉(zhuǎn)錄組等多組學(xué)技術(shù)手段，在群落和單細(xì)胞水平研究CPR細(xì)菌在各種自然和人工生態(tài)系統(tǒng)以及人體腸道等生境中物種多樣性和生態(tài)學(xué)分布特征，尤其關(guān)注CPR細(xì)菌與不同潛在宿主間的共現(xiàn)性關(guān)系和對(duì)生境微生物整體群落的塑造效應(yīng)。②CPR細(xì)菌純培養(yǎng)和生理代謝特征：在獲得CPR細(xì)菌基因組學(xué)信息的基礎(chǔ)上，有目的地優(yōu)化CPR細(xì)菌與宿主共培養(yǎng)條件，并開發(fā)相應(yīng)的高通量培養(yǎng)等技術(shù)，實(shí)現(xiàn)CPR細(xì)菌與宿主的二元純培養(yǎng)，從而深入探索CPR細(xì)菌這一類獨(dú)特生命體的生理代謝特征。③CPR細(xì)菌在地球生物化學(xué)循環(huán)中的貢獻(xiàn)：目前研究發(fā)現(xiàn)CPR細(xì)菌參與了地球碳、氮、硫、磷等多種元素的生物地球化學(xué)循環(huán)，未來(lái)需要加強(qiáng)多學(xué)科交叉，結(jié)合生物學(xué)、化學(xué)、生態(tài)學(xué)以及地質(zhì)學(xué)等，系統(tǒng)探究CPR細(xì)菌在生物地球化學(xué)循環(huán)中的作用及機(jī)制，定量化CPR細(xì)菌對(duì)地球化學(xué)元素循環(huán)的貢獻(xiàn)。④CPR細(xì)菌與人類健康的關(guān)系：目前發(fā)現(xiàn)CPR細(xì)菌對(duì)人體健康存在重要影響，然而其作用機(jī)理仍然很不清楚。未來(lái)需要針對(duì)人體口腔和腸道等重要生境CPR細(xì)菌的生境溯源、物種多樣性和生理代謝機(jī)制進(jìn)行系統(tǒng)研究，解析CPR細(xì)菌對(duì)人體健康的影響及其作用機(jī)制。⑤CPR細(xì)菌在生命進(jìn)化研究中的意義：CPR細(xì)菌處于生命進(jìn)化樹的最根部，可能是現(xiàn)存的最古老和最簡(jiǎn)單的細(xì)胞生命體之一，研究其諸多生命形式和進(jìn)化特征，將對(duì)生命起源和細(xì)胞結(jié)構(gòu)復(fù)雜性演化等重大科學(xué)問(wèn)題產(chǎn)生重要影響。