鄭欣欣，趙雨婷，潘彪,2*，王新洲,2

(1.南京林業(yè)大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，南京 210037；2.南京林業(yè)大學(xué)林業(yè)資源高效加工利用協(xié)同創(chuàng)新中心，南京 210037)

植物單寧是一類高分子量水溶性多酚類化合物的總稱，又稱植物鞣質(zhì)、植物多酚，廣泛分布于樹木的皮、根、葉、殼、木材和果肉中[1]。目前關(guān)于植物單寧的提取方法主要為有機溶劑萃取法、超聲波輔助提取法、微波輔助提取法和酶轉(zhuǎn)化提取法等，其中有機溶劑萃取法最為常用。木材內(nèi)植物單寧的分布不僅與樹種有關(guān)，還與樹木的部位有關(guān)，如木材的心材和邊材、樹干的不同高度、主干和枝椏之間單寧含量均存在較大差異[2]，目前木材酚類物質(zhì)的株內(nèi)變異規(guī)律尚無定論。近年來，對植物單寧化學(xué)結(jié)構(gòu)的研究已成為國內(nèi)外相關(guān)研究的熱點，根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)的不同，植物單寧通常分為水解單寧(棓酸酯類多酚)和縮合單寧(聚黃烷醇類多酚或原花色素)兩大類。由于水解單寧分布較窄且難以純化，故關(guān)于植物單寧組分構(gòu)成的解析主要在縮合單寧[3]。Callemien等[4]通過高效液相色譜-電噴霧電離(-)串聯(lián)質(zhì)譜[NP-HPLC-ESI(-)-MS/MS]分析發(fā)現(xiàn)，在啤酒花的丙酮/水提取物縮合單寧的成分中存在(+)兒茶素、(-)表兒茶素、原花青素二聚體和原翠雀定。曠慧等[5]采用高效液相色譜測試發(fā)現(xiàn)，紅樹莓提取物中含有原花青素B2。據(jù)統(tǒng)計，在木材加工工業(yè)中，單寧引起變色約占木材變色的70%[6]。高建民等[7]發(fā)現(xiàn)三角楓木材中多元酚類物質(zhì)以及無色花色素和單寧等在干燥時高溫氧化產(chǎn)生變色。曹惠敏等[8]研究麻櫟板材變色發(fā)現(xiàn)，木材中的多酚類物質(zhì)的酚羥基和芳香環(huán)取代基與鐵離子絡(luò)合反應(yīng)是其變色的主要原因。在樺木、櫟木、櫻桃木等單寧含量較高的木材加工過程中，經(jīng)常會產(chǎn)生藍黑色鞣酸鐵沉淀使木材變色。

西加云杉(Piceasitchensis)為松科云杉屬常綠喬木，是世界上優(yōu)質(zhì)的樂器共鳴板用材，其材質(zhì)潔白細膩，紋理通直，但在加工過程中木材中的單寧極易與金屬離子發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)致使木材變色，嚴(yán)重影響其作為樂器共鳴板用材的產(chǎn)品等級和商業(yè)價值。通過對西加云杉木材內(nèi)植物單寧的提取，及在樹干縱向和徑向的分布規(guī)律以及組分構(gòu)成進行研究，以期在加工過程中有針對性地對木材進行變色防治處理，提高用材等級及產(chǎn)品質(zhì)量。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

西加云杉試材于2018年3月取自江蘇鎮(zhèn)江中林新民洲港川雅木業(yè)有限公司，購自美國阿拉斯加。隨機選取2株，在樹干距地面高4和8 m處截取厚度為5 cm的2個圓盤，共計4個圓盤，分別編號A-上、A-下、B-上和B-下。取過髓心徑向5 cm木條，按年輪取樣，共7個取樣點。具體取樣年輪數(shù)如表1所示。

表1 圓盤取樣年輪數(shù)Table 1 Numbers of annual rings

香草醛(純度99%)，購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；D101大孔樹脂，購自安徽三星樹脂科技有限公司；沒食子酸(純度≥98%，高效液相色譜級，下同。CAS號：149-91-7)、兒茶素(CAS號：154-23-4)、表兒茶素(CAS號：490-46-0)、原花青素B2(CAS號：29106-49-8)、表兒茶素沒食子酸酯(CAS號：1257-08-5)，購自天津尖峰天然產(chǎn)物研究開發(fā)有限公司。

Buchi R-200型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國Buchi)、3-30KS型高速離心機(德國Sigma)、Lambda 950型紫外/可見/近紅外分光光度計(美國Perkinelmer)、SHZ-D(Ⅲ)型循環(huán)水式多用真空泵(上海亞榮生化儀器廠)、Alliance E2695 高效液相色譜儀(美國Waters)。

1.2 試驗方法

1.2.1 提取方法

取質(zhì)量恒定后的西加云杉試材，粉碎；稱取一定質(zhì)量的西加云杉試材粉末過60～80目(孔徑0.178～0.250 mm)篩后置于三口燒瓶中；加入提取溶劑，在一定溫度水浴下回流一定時間；提取液抽濾后40 ℃減壓蒸發(fā)，4 000 r/min離心10 min，取上清液。另取木粉按照國標(biāo)GB/T 1931—2009《木材含水率測定方法》測定木材含水率。

提取溶劑的選擇：分別選用水、50%甲醇(體積分?jǐn)?shù))、50%乙醇(體積分?jǐn)?shù))和50%丙酮(體積分?jǐn)?shù))對試樣進行抽提。溶劑體積分?jǐn)?shù)的選擇：分別選用30%，50%，70%和90%(體積分?jǐn)?shù))的乙醇溶液對試樣進行抽提。提取時間的選擇：分別選取1，2，4和8 h對試樣進行抽提。提取溫度的選擇：分別選取30，50，70和90 ℃對試樣進行抽提。料液比(g∶mL)的影響：分別選取1∶10，1∶15，1∶20和1∶25共4種料液比對試樣進行抽提。提取次數(shù)的影響：在抽濾所得濾渣中按相同料液比再次加入同種溶劑進行多次提取，保存所得濾液，共重復(fù)4次，對試樣進行抽提。在以上單因素試驗的基礎(chǔ)上，選擇試劑體積分?jǐn)?shù)(A)、提取時間(B)、提取溫度(C)和料液比(D)4個考察因素，每個因素設(shè)定3個水平，進行L9(34)正交試驗，以確定最佳的提取條件。

1.2.2 單寧含量測定方法

采用香草醛-鹽酸紫外分光光度法[9-10]進行單寧含量測定。

1.2.3 定性鑒定試驗

用鐵礬、溴水、醋酸鉛-醋酸和香草醛-鹽酸試劑對西加云杉木材內(nèi)單寧進行類別鑒定。

1.2.4 單寧組分分析

將西加云杉抽提液采用柱層析法分離純化，洗脫液待測，采用外標(biāo)法測定各成分含量。將沒食子酸、原花青素B2、兒茶素、表兒茶素和表兒茶素沒食子酸酯標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇分別稀釋至0.025，0.050，0.100，0.200和0.400 mg/mL，作標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定線性范圍，并做精密度和回收率試驗。色譜條件[11]：色譜柱Hypersil Green PAH (孔徑和長度分別為4.6 和250 mm，填料孔徑5 μm)，波長278 nm，柱溫40 ℃，進樣量10 μL，運行時間29 min，流速1.2 mL/min。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳提取條件的確定

2.1.1 提取溶劑的選擇

不同溶劑對西加云杉中單寧的提取量差異較大，50%(體積分?jǐn)?shù))乙醇溶液為溶劑的提取效果最好，50%丙酮次之，水的提取效果最差(圖1a)。一般情況下以棓酸酯多酚(即水解單寧)為主體的酚類可采用丙酮-水體系，以縮合單寧為主體的樣品可采用弱酸性醇-水體系，使以共價鍵與植物組織分子相的單寧降解，能夠更好地溶出[12]?？紤]到提取效果、成本及對環(huán)境的影響，確定乙醇溶液為最佳溶劑。

2.1.2 溶劑體積分?jǐn)?shù)的影響

隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，單寧提取量先呈上升趨勢，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時達最高，此時提取量為5.696 5 mg/g，之后呈下降趨勢(圖1b)。由于有機溶劑是多酚-蛋白質(zhì)結(jié)合反應(yīng)有效的抑制劑，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，單寧-蛋白質(zhì)的連接鍵逐步被打開，單寧游離出來，使得單寧的溶解度增大，并在70%時達到最高。但隨后溶劑中的水分開始減少，溶液的通透性變差，造成了單寧提取率的降低[13]。故乙醇體積分?jǐn)?shù)選取為70%為宜。

2.1.3 提取時間的影響

隨著提取時間的延長，單寧的提取量先呈上升趨勢，在4 h時達到最高，此時單寧提取量為7.182 0 mg/g，在此之后反而呈下降趨勢(圖1c)。隨著時間的延長，單寧的酚羥基經(jīng)氧化反應(yīng)變成酮基，導(dǎo)致在含量測定時部分單寧物質(zhì)無法顯色，從而測得的提取量降低[14]?？紤]時間成本，提取時間選取2 h為宜。

2.1.4 提取溫度的影響

單寧的提取量隨提取溫度的升高不斷增大(圖1d)，說明在一定范圍內(nèi)增加提取溫度有利于酚類物質(zhì)的溶出，但溫度過高，單寧易發(fā)生氧化反應(yīng)，造成單寧化學(xué)結(jié)構(gòu)的變化。故提取溫度選擇為70 ℃。

2.1.5 料液比的影響

隨著料液比的增加，單寧提取量先呈上升趨勢，在1∶20時達到最高，此時提取量為7.336 5 mg/g，最后隨料液比增大呈下降趨勢(圖1e)?？赡苁且驗樵诹弦罕葹?∶20時，單寧在溶劑中的溶解已基本達到飽和，而在對提取液進行減壓蒸發(fā)濃縮時，提取液始終保持微沸狀態(tài)，會促使氧化反應(yīng)發(fā)生，且所用溶劑越多，在濃縮過程中消耗的時間也越長，加大了濃縮時的能耗，故料液比選取1∶20較為適宜。

圖1 單因素試驗結(jié)果Fig.1 The results of single test

2.1.6 提取次數(shù)的影響

第1次所提單寧的量占總量的90.89%，第2次提取的量占總量的5.62%，2次所提單寧之和占總量的96.51%，后兩次的提取操作占總量的極少部分，考慮到時間和試劑成本，提取次數(shù)以2次為宜。

2.1.7 最佳提取工藝的確定

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，正交試驗設(shè)計方案、試驗結(jié)果及極差分析見表2。由表2中的極差分析可以看出，各因素對提取效果的影響順序為提取溫度(C)>料液比(D)>提取時間(B)>乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)，單寧提取的最佳組合是乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，提取時間120 min，提取溫度70 ℃，料液比 1∶18(g∶mL)。在此條件下進行驗證試驗，提取量為8.248 4 mg/g，與正交試驗中單寧提取量相差0.1%，說明該種提取方法精密度良好。

表2 單寧提取的正交試驗結(jié)果Table 2 The design scheme,results and range analysis of orthogonal test

2.2 單寧的分布規(guī)律

以兒茶素質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、吸光度值為縱坐標(biāo)繪制兒茶素標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程y=1.107 7x-0.000 9，決定系數(shù)R2=0.999 9，標(biāo)準(zhǔn)品濃度與吸光度呈良好線性關(guān)系。所得分布規(guī)律結(jié)果如圖2。

圖2 西加云杉木材單寧分布情況Fig.2 Distribution of tannin in the wood of Picea sitchensis

2.2.1 徑向分布規(guī)律

西加云杉木材內(nèi)單寧含量在徑向上的分布情況如下：1)內(nèi)部心材(編號1～3)單寧含量范圍在5.020～5.910 mg/g，平均為5.440 mg/g，由髓心至樹皮方向略微呈上升趨勢；2)近心邊材轉(zhuǎn)換區(qū)的心材部分含量最高，為10.015 mg/g，最多可達10.970 mg/g；3)心邊材轉(zhuǎn)換區(qū)部位單寧含量范圍在5.940～6.440 mg/g，平均為6.363 mg/g，介于心材和邊材之間；4)靠近心邊材轉(zhuǎn)換區(qū)的邊材部分含量最低，為4.821 mg/g；近樹皮邊材僅次于近心邊材轉(zhuǎn)換區(qū)的心材部分，單寧含量在6.997 mg/g左右，最高可達7.440 mg/g。自髓心至樹皮方向，單寧含量呈現(xiàn)先增后減再增的分布規(guī)律，心材含量(6.590 mg/g)總體高于邊材(5.910 mg/g),在靠近轉(zhuǎn)換區(qū)的心材部位單寧含量達到最高，在靠近轉(zhuǎn)換區(qū)的邊材單寧含量最低。在樹木生長過程中，薄壁細胞死亡變?yōu)樾牟牡耐瑫r分泌單寧等多酚類物質(zhì)，水分輸導(dǎo)系統(tǒng)阻塞，心材細胞內(nèi)分泌物不斷沉積，從而形成越來越多的內(nèi)含物[15]。內(nèi)部心材部分單寧含量由髓心至樹皮方向呈逐漸上升趨勢，是由于靠近髓心部位的木材形成時間早，單寧較易在氧氣和酶等催化條件下分解，因此隨著時間的延長，單寧也逐漸減少。近樹皮邊材單寧含量較高，可能是由于樹皮部分單寧含量較高，木材養(yǎng)分橫向輸導(dǎo)過程中，部分物質(zhì)通過射線細胞由樹皮向內(nèi)滲透造成的。

2.2.2 縱向分布規(guī)律

西加云杉木材單寧含量分布在縱向上呈下部各部位單寧含量略高于上部各對應(yīng)部位含量的規(guī)律，相差0.19～0.71 mg/g，但無顯著差異。不同樹木的單寧含量在縱向上呈現(xiàn)出不同的規(guī)律。Caron等[16]在研究英國北部西加云杉丙酮抽提物的分布規(guī)律時，在縱向上并未發(fā)現(xiàn)顯著差異；范國榮等[17]研究發(fā)現(xiàn)隨著樹高的增加，陳山紅心杉的抽提物含量均呈現(xiàn)下降趨勢。目前木材內(nèi)酚類物質(zhì)的株內(nèi)縱向變異規(guī)律的尚無定論，除樹高外，樹齡也有一定影響，且抽提物的成因比較復(fù)雜，有的是樹木正常生理活動和新陳代謝的產(chǎn)物，有的是受到外界條件的刺激引起的應(yīng)激物，存在一定的不確定性。

2.3 單寧組分分析

2.3.1 單寧類型的確定

通過西加云杉木材內(nèi)植物單寧的定性鑒定，單寧分子中的鄰苯三酚基與鐵鹽反應(yīng)呈藍色，而水解單寧和縮合單寧中都可能含有鄰苯三酚基，故判定西加云杉木材內(nèi)含有單寧；在溴水反應(yīng)中，縮合單寧的A環(huán)6位及8位為親核性位置，容易與缺電子試劑發(fā)生取代反應(yīng)生成6,8,2-三取代產(chǎn)物，產(chǎn)生橙黃色沉淀；縮合類單寧和水解類單寧與醋酸鉛反應(yīng)均能生成沉淀，但縮合類單寧可在稀醋酸中溶解，溶液無沉淀生成，說明不含水解單寧；縮合單寧A苯環(huán)化學(xué)活性較高，其上的間苯二酚或間苯三酚可與香草醛發(fā)生酚醛縮合反應(yīng)，溶液由無色變?yōu)榉奂t色，證明其含縮合單寧。綜上所述，西加云杉木材中單寧類型為縮合單寧。

2.3.2 組分分析結(jié)果

對試驗方法進行精密度和回收率測試，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均在5%以內(nèi)，表明該試驗方法具有良好的精密度和回收率。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和待測樣品所得色譜圖如圖3。采用外標(biāo)法，以峰面積為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，得到 5 種原花青素成分的回歸方程和相關(guān)系數(shù)，在0.1～1.0 mg/mL范圍內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系。將測試所得峰面積值代入回歸方程計算，所得各成分含量見表3。

圖3 各標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)色譜圖Fig.3 Standard sample chromatogram

表3 5種原花青素含量檢測結(jié)果Table 3 The test results of five procyanidins in samples

通過對西加云杉木材中的5種原花青素成分進行組分分析，確定了一種簡單、快速準(zhǔn)確測定西加云杉提取物中5種原花青素的高效液相色譜方法。西加云杉木材內(nèi)5種原花青素成分含量存在明顯差異，其中兒茶素含量最高，占5種原花青素總量的83.21%，原花青素B2次之，表兒茶素含量較低，沒食子酸和表兒茶素沒食子酸酯幾乎沒有。兒茶素為西加云杉木材植物單寧中的主要成分，約占總單寧含量的59.68%，原青花素B2次之，占比為10.25%。兒茶素類化合物具有2-苯基苯并二氫吡喃結(jié)構(gòu)，屬于黃烷醇類化合物，進一步佐證西加云杉中單寧類型為縮合單寧。兒茶素中含有酚羥基，遇金屬離子如鐵離子會發(fā)生螯合反應(yīng)，生成不溶于水的藍黑色螯合物鞣酸鐵，可尋找與鐵離子結(jié)合能力更強的試劑作為除色劑，將鐵離子從鞣酸鐵中置換出來，從而達到消除西加云杉木材鐵變色的目的。

3 結(jié) 論

1)有機溶劑抽提法適用于西加云杉木材中植物單寧的抽提，最佳提取條件為：70%(體積分?jǐn)?shù))乙醇作為提取溶劑，提取溫度70 ℃，提取時間2 h，料液比1∶18(g∶mL)，提取次數(shù)為2次。

2)西加云杉木材中單寧含量在徑向(由髓心向樹皮方向)上分布依次為：由髓心至樹皮先增加后減少再增加的趨勢，近心邊材轉(zhuǎn)換區(qū)的心材部分單寧含量最高，近心邊材轉(zhuǎn)換區(qū)的邊材部分含量最低，心材單寧含量總體高于邊材。在縱向上表現(xiàn)為下部各部位單寧含量略高于上部各對應(yīng)部位含量，但無顯著差異。

3)通過對西加云杉木材中的5種原花青素成分進行組分分析，確定了一種簡單、快速準(zhǔn)確測定西加云杉提取物中5種原花青素的高效液相色譜方法。西加云杉木材植物單寧類型為縮合單寧，5種原花青素成分含量存在明顯差異，其中兒茶素為西加云杉木材植物單寧中的主要成分，占單寧總含量的59.68%。