闞婷婷 汪沖 鄭志仁 張輝

摘 ?要： 相較傳統(tǒng)育種，基因編輯育種能夠更精準(zhǔn)、高效地改變植物的性狀，獲得優(yōu)良的品種. 目前應(yīng)用基因編輯技術(shù)于花卉育種研究的報(bào)道相對(duì)較少. 該文綜述了基因編輯技術(shù)，特別是規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)/CRISPR-關(guān)聯(lián)核酸內(nèi)切酶9（CRISPR/Cas 9）在花卉中的研究進(jìn)展及其局限性，同時(shí)還就花卉基因編輯育種的發(fā)展方向進(jìn)行了討論，希望為將基因編輯更好地應(yīng)用于花卉育種提供參考.

關(guān)鍵詞： 花卉; 基因編輯; 規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)/CRISPR-關(guān)聯(lián)核酸內(nèi)切酶9（CRISPR/Cas 9）; 育種

中圖分類號(hào)： ?Q 812 ??????文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ????文章編號(hào)： 1000-5137（2021）01-0050-07

Abstract： Gene editing breeding technology can change the plant traits and obtain excellent varieties more accurately and efficiently than the traditional breeding. There are few reported researches on ornamental plant breeding by using gene editing technology.In this review，we mainly summarize the progress on gene editing technology and its limitations，especially clustered regularly interspersed short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9 （CRISPR/Cas 9） in ornamental plant breeding.The future research directions of gene editing in breeding of ornamental plants were discussed as well，which can provide some reference for its further application.

Key words： ornamental plant; gene editing; clustered regularly interspersed short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9 （CRISPR/Cas 9）; breeding

0 ?引言

隨著人們生活水平的提高，花卉作為裝扮環(huán)境的主要因素之一，也越來越受到人們的喜愛.為了滿足花卉市場(chǎng)需求，培育更多優(yōu)質(zhì)花卉品種是花卉育種工作者的共同目標(biāo).傳統(tǒng)的花卉育種方法主要有雜交育種和突變育種[1]，雖然目前已經(jīng)培育出了大量花卉品種，但是它們可變化的性狀數(shù)量有限，且培育過程耗時(shí)費(fèi)力.

轉(zhuǎn)基因技術(shù)是將影響重要性狀的功能基因轉(zhuǎn)入目標(biāo)花卉品種中，可以快速獲得新性狀的花卉品種.目前通過該技術(shù)已經(jīng)獲得了很多優(yōu)良的花卉新品種，如藍(lán)色玫瑰和微小型菊花等[2].然而，由于各國(guó)對(duì)于轉(zhuǎn)基因植物政策的限制，目前只有少數(shù)轉(zhuǎn)基因花卉品種獲得監(jiān)管部門的批準(zhǔn)并進(jìn)入市場(chǎng).

以規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)/CRISPR-關(guān)聯(lián)核酸內(nèi)切酶9（CRISPR/Cas 9）為代表的新一代基因編輯技術(shù)，是近年來生命科學(xué)領(lǐng)域中發(fā)展起來的革命性技術(shù)，可以通過對(duì)植物自身基因的快速、定點(diǎn)改變，實(shí)現(xiàn)對(duì)植物性狀的精準(zhǔn)改良，為農(nóng)業(yè)技術(shù)革命提供了新契機(jī).

自2013年首次應(yīng)用于植物的基因組編輯以來，CRISPR/Cas 9系統(tǒng)已在許多物種中得到應(yīng)用：?jiǎn)巫尤~植物，如水稻、小麥、高粱、玉米等;雙子葉植物，如擬南芥、煙草、大豆、番茄等.并獲得了許多性狀優(yōu)良的新種質(zhì)，如抗白粉病的小麥[3]及抗氧化的馬鈴薯[4]等.基因編輯技術(shù)同樣可以提高花卉育種的效率，縮短育種的周期，改良更多花卉的性狀等，彌補(bǔ)傳統(tǒng)花卉育種的不足.目前已經(jīng)有一些關(guān)于花卉基因編輯的研究報(bào)道，但涉及的品種還較少，技術(shù)也不夠成熟.本文作者對(duì)目前已有的花卉基因編輯技術(shù)研究進(jìn)行了綜述，并對(duì)其應(yīng)用在花卉育種中的局限性及今后的發(fā)展趨勢(shì)進(jìn)行了討論.

1 ?基因編輯原理及在作物育種中的應(yīng)用

基因編輯的原理是通過特異的引導(dǎo)序列對(duì)目標(biāo)基因DNA雙鏈進(jìn)行切割，形成DNA雙鏈斷裂（DSB），機(jī)體通過自身的修復(fù)機(jī)制對(duì)DSB進(jìn)行不精準(zhǔn)修復(fù)時(shí)，會(huì)造成修復(fù)位點(diǎn)堿基的缺失或插入，從而導(dǎo)致基因功能的缺失[5].目前基因編輯系統(tǒng)主要有鋅指核酸酶（ZFN）[6]、轉(zhuǎn)錄激活物樣效應(yīng)器核酸酶（TALEN）[7]和CRISPR/Cas 9系統(tǒng)[8].CRISPR/Cas 9系統(tǒng)有3個(gè)主要組成部分：Cas 9蛋白、CRISPR RNA（crRNA）和反式激活crRNA（tracrRNA）.Cas9是一個(gè)核酸內(nèi)切酶，負(fù)責(zé)切割DNA序列.在工程化的CRISPR/Cas 9系統(tǒng)中，tracrRNA與crRNA連接在一起，變成一條單鏈向?qū)NA（sgRNA）.sgRNA指導(dǎo)Cas 9實(shí)現(xiàn)DNA序列特異性的切割.自2012年CRISPR/Cas 9系統(tǒng)被用于體外DNA序列的切割，特別是2013年被用于哺乳動(dòng)物體內(nèi)特定DNA序列的編輯后，由于其操作簡(jiǎn)便、成本低和用途廣泛等特點(diǎn)，在短短幾年內(nèi)被廣泛應(yīng)用，并被認(rèn)為是生命科學(xué)研究領(lǐng)域的顛覆性技術(shù)之一，也是目前應(yīng)用最為廣泛的基因編輯工具[9].

近年來，利用基因編輯技術(shù)改良作物性狀的研究已經(jīng)取得了一系列的成果.如在水稻中，對(duì)香味基因OsBADH2[10]、白葉枯病感病基因OsSWEET14 [11]、直鏈淀粉含量基因OsWaxy [12]等進(jìn)行編輯，分別獲得了具有香味、抗白葉枯病及糯性等特性的新種質(zhì)，大大縮短了育種時(shí)間，提高了育種效率.在六倍體小麥中對(duì)MLO基因進(jìn)行靶向敲除，產(chǎn)生了抗白粉病的小麥[3].在玉米中敲除Waxy1基因，使籽粒中的支鏈淀粉含量顯著提高[13].在大豆中定向敲除脂肪酸去飽和酶2（FAD 2）基因，從而降低了亞油酸和α-亞麻酸的相對(duì)含量，同時(shí)增加了油酸的積累，提高了大豆油的食用品質(zhì)[14].基因編輯技術(shù)已經(jīng)在一些主要農(nóng)作物育種中展現(xiàn)了巨大的潛力，這為將該技術(shù)應(yīng)用于更多物種的性狀改良中奠定了基礎(chǔ).

2 ?花卉基因編輯研究進(jìn)展

基因編輯技術(shù)已成功用于矮牽牛、牽?；?、菊花、百合、蝴蝶蘭和夏堇等花卉基因的編輯（表1），在有些物種中成功獲得了性狀改良的株系.

2.1 矮牽牛的基因編輯研究

矮牽牛（Petunia hybrida）作為花卉研究的一種模式植物，被廣泛用于花色和花序發(fā)育研究.2016年，ZHANG等[15]在二倍體矮牽牛中，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化葉片，靶向八氫番茄紅素脫氫酶（PDS）基因，在獲得的陽性再生植株中，白化表型的株系占55.6%～87.5%.同年，SUBBURAJ等[16]通過核糖核蛋白復(fù)合物（RNPs）方法，在矮牽牛原生質(zhì)體系統(tǒng)中，直接導(dǎo)入純化的Cas9蛋白和sgRNA，成功對(duì)硝酸還原酶（NR）基因進(jìn)行了靶向編輯.

NAING等[17]通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化葉片，用CRISPR/Cas9系統(tǒng)編輯矮牽牛的乙烯生物合成酶1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸氧化酶1（ACO1）基因.在T0代株系中，檢測(cè)到31.5%的靶位點(diǎn)突變頻率，其中純合株系、雜合株系和嵌合株系分別占2.5%，15.0%和82.5%.基因編輯株系中乙烯生成量減少，花期顯著延長(zhǎng).該工作為通過基因編輯技術(shù)，利用植物乙烯生物合成基因延長(zhǎng)花卉的花期提供了實(shí)驗(yàn)參考.

野生矮牽牛（Petunia inflata）自交不親和性是由多態(tài)性S位點(diǎn)調(diào)控的，S位點(diǎn)包含多個(gè)花粉特異性S位點(diǎn)F盒（SLF）基因和一個(gè)雌蕊特異性S-RNase基因.花粉中的每一個(gè)SLF蛋白都被組裝成一個(gè)SCF（Skp1-Cullin1-F-box）E3泛素連接酶復(fù)合物.SUN等[18]通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)靶向矮牽牛SCFSLF復(fù)合物中的Skp1亞基（SSK1）基因，對(duì)矮牽牛自交不親和機(jī)制進(jìn)行研究，在獲得的3個(gè)再生植株中有1株的靶基因被成功編輯.

2.2 日本牽?；ǖ幕蚓庉嬔芯?/p>

WATANABE等[19]首次報(bào)道了在日本牽牛花（Ipomoea nil）中針對(duì)花色的基因編輯，他們以花青素生物合成酶二氫黃酮醇-4-還原酶-B（DFR-B）基因?yàn)榘袠?biāo)，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化種子胚.在32株轉(zhuǎn)基因株系中，有24株（75%）在靶位點(diǎn)產(chǎn)生突變，產(chǎn)生了花青素含量減少的白色花.這也是第一個(gè)將基因編輯技術(shù)用于改變高等植物花色的報(bào)道.

日本牽?；ㄓ卸喾N花色品系，但是缺少黃色花，說明日本牽?；ɑò曛兄挥形⒘款惡}卜素的積累.WATANABE等[20]研究類胡蘿卜素裂解雙加氧酶（CCD），調(diào)控類胡蘿卜素在花瓣中的積累.通過生物信息學(xué)分析，在牽?；ɑ蚪M中鑒定出7個(gè)CCD基因.測(cè)序和表達(dá)分析表明，CCD4可能參與花瓣類胡蘿卜素的降解.他們利用CRISPR/Cas 9系統(tǒng)敲除了白花品種I.nil cv.AK77中的CCD4基因，使得白色的花瓣變成淡黃色.

在日本牽?；ㄖ?，NAC（NAM/ATAF1，2/CUC2）類轉(zhuǎn)錄因子EPHEMERAL1（EPH1）是花瓣衰老的關(guān)鍵調(diào)控因子.SHIBUYA等[21]構(gòu)建同時(shí)靶向EPH1基因中3個(gè)不同位置的CRISPR/Cas 9載體，并轉(zhuǎn)化日本牽?；?，在獲得的8株陽性轉(zhuǎn)基因植物中都檢測(cè)到了靶位點(diǎn)的突變.在T1代獲得了靶位點(diǎn)純合突變的株系，也成功獲得一些不含T-DNA（Transfer DNA）插入的純合株系，這些突變植株表現(xiàn)出明顯的花瓣衰老延遲.

2.3 菊花的基因編輯研究

菊花是一種重要的觀賞植物，但它是六倍體，基因組龐大，缺乏全基因組信息，這為菊花遺傳改良帶來了困難.KISHI-KABOSHI等[22]為了優(yōu)化菊花中CRISPR/Cas 9基因編輯系統(tǒng)，首先創(chuàng)制了表達(dá)YGFP（yellowish-green fluorescent protein）基因的轉(zhuǎn)基因菊花植株，再通過CRISPR/Cas 9系統(tǒng)對(duì)轉(zhuǎn)基因植株中的YGFP基因進(jìn)行編輯.在比較了CaMV 35S啟動(dòng)子和PcUbi啟動(dòng)子在菊花愈傷組織中的活性后發(fā)現(xiàn)，PcUbi啟動(dòng)子對(duì)菊花愈傷組織的基因編輯更有效.進(jìn)一步利用PcUbi啟動(dòng)子表達(dá)Cas 9蛋白，并針對(duì)YGFP的兩個(gè)位點(diǎn)設(shè)計(jì)了不同sgRNA，獲得了YGFP突變的菊花植株，基因編輯效率為0～33%.這是利用CRISPR/Cas 9系統(tǒng)對(duì)菊花進(jìn)行基因編輯的首次報(bào)道，為該技術(shù)用于菊花遺傳改良提供了參考.

2.4 夏堇的基因編輯研究

夏堇（Torenia fournieri L.）屬于木玄參科蝴蝶草屬植物，是花卉研究中常用的模式植物.NISHIHARA等[23]利用CRISPR/Cas 9系統(tǒng)突變夏堇中參與類黃酮生物合成的關(guān)鍵基因黃烷酮3-羥化酶（F3'H），來改造夏堇花的顏色.在獲得的基因編輯株系中，80%的植株表現(xiàn)出花色的變化，靶序列測(cè)序結(jié)果表明所有花色改變的株系，F(xiàn)3'H基因均發(fā)生了突變，突變類型包括堿基替換、插入或缺失等，這說明獲得的花色變化表型是由F3'H基因的突變導(dǎo)致的.

2.5 百合的基因編輯研究

百合是常見的鮮切花之一，分布于世界各地.YAN等[24]首先在山丹百合（Lilium pumilum DC.Fisch.）和麝香百合（Lilium longiflorum White Heaven）中，分別通過體細(xì)胞胚和再生不定芽建立了穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化體系，轉(zhuǎn)化效率分別達(dá)到29.17%和4.00%.進(jìn)一步，該工作通過CRISPR/Cas 9系統(tǒng)對(duì)2個(gè)百合屬植物的PDS基因進(jìn)行了敲除，在獲得的再生植株中觀察到完全白化、淡黃色和白綠色嵌合的表型.在此研究中，分別獲得30.0%和5.17%的具有抗性和明顯表型改變的山丹百合和麝香百合.該工作首次將CRISPR/Cas 9基因編輯系統(tǒng)成功應(yīng)用于百合中，為百合的基因功能研究和種質(zhì)改良奠定了重要的基礎(chǔ).

2.6 蝴蝶蘭的基因編輯研究

MADS基因家族編碼在花器官中高度表達(dá)的DNA結(jié)合蛋白，對(duì)花發(fā)育具有重要調(diào)控作用.研究發(fā)現(xiàn)蝴蝶蘭MADS基因家族包括50多個(gè)成員[25].TONG等[26]利用CRISPR/Cas 9技術(shù)分別通過構(gòu)建同時(shí)靶向3個(gè)位點(diǎn)的基因編輯載體，和將3個(gè)單位點(diǎn)基因編輯載體混合轉(zhuǎn)化，對(duì)蝴蝶蘭中MADS44，MADS36和MADS8 3個(gè)基因同時(shí)進(jìn)行編輯.在多基因敲除載體轉(zhuǎn)化的21個(gè)外植體中獲得了51個(gè)轉(zhuǎn)化株系，有97.9%的株系中同時(shí)有3個(gè)位點(diǎn)被編輯，60%株系中包含3個(gè)MADS基因的純合突變或者雙等位突變.從21個(gè)混合單基因敲除載體轉(zhuǎn)化的外植體中獲得了45個(gè)轉(zhuǎn)化株系，其中有多個(gè)位點(diǎn)同時(shí)被編輯的植株，說明可以通過混合多個(gè)基因編輯載體構(gòu)建的方法獲得多敲株系.

3 ?基因編輯在花卉育種中的局限性及新技術(shù)應(yīng)用

3.1 遺傳轉(zhuǎn)化體系及基因組信息的限制

在植物中實(shí)現(xiàn)基因編輯，重要的一步是將基因編輯的元件，主要為sgRNA和Cas 9，導(dǎo)入到植物細(xì)胞中，這個(gè)過程被稱為遺傳轉(zhuǎn)化.目前植物遺傳轉(zhuǎn)化的方法主要有農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化、基因槍轉(zhuǎn)化和原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，它們都有各自的局限性.農(nóng)桿菌介導(dǎo)法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因株系中T-DNA插入拷貝數(shù)低，對(duì)植物基因組的損傷較小，是植物遺傳轉(zhuǎn)化及基因編輯非常理想的方式，但這種方法目前只有在少部分植物中有成熟的體系.目前花卉中遺傳轉(zhuǎn)化體系較成熟的植物有：紅掌、洋桔梗、非洲菊、蘭花、康乃馨等[27].基因槍轉(zhuǎn)化方法需要儀器基因槍，操作過程對(duì)DNA濃度等條件要求較高，該方法容易造成染色體較大的改變，對(duì)細(xì)胞基因組的損傷較大，獲得正常發(fā)育植株的概率小，目前實(shí)際應(yīng)用較少.原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化可以突破細(xì)胞壁的限制，較容易地將目的基因送到植物細(xì)胞中，但由于原生質(zhì)體再生植株困難，目前只有煙草等少數(shù)植物能利用這種方式進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化.

獲取基因組信息是利用基因編輯工具對(duì)基因進(jìn)行編輯的基礎(chǔ)，目前已有基因組信息的花卉植物（如康乃馨、蝴蝶蘭、長(zhǎng)春花、向日葵等）還較少，更廣泛地實(shí)現(xiàn)花卉中的基因編輯需要獲得更多花卉品種的基因組信息.此外，對(duì)花卉功能基因的研究也有助于獲得更多有價(jià)值的目的基因信息，從而在基因編輯時(shí)能更有針對(duì)性地選擇靶基因.

3.2 新基因編輯技術(shù)應(yīng)用于花卉育種

3.2.1 堿基編輯

堿基編輯技術(shù)是將失去催化活性的Cas蛋白（dCas）或只有切割一條DNA鏈活性的Cas蛋白（nCas）與DNA脫氨酶進(jìn)行融合，從而實(shí)現(xiàn)靶位點(diǎn)的堿基替換.根據(jù)脫氨酶的不同，分為胞嘧啶堿基編輯器（CBE）和腺嘌呤堿基編輯器（ABE），分別可以實(shí)現(xiàn)C到T（G到A）或A到G（T到C）的堿基替換.堿基編輯技術(shù)自2016年被開發(fā)以來，因其高效、不依賴DNA雙鏈斷裂產(chǎn)生、無需供體DNA參與等優(yōu)勢(shì)，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于精準(zhǔn)作物育種中[28].在花卉中，花色和香味等重要的性狀多是由酶控制，對(duì)其活性的調(diào)控可能會(huì)形成更多優(yōu)質(zhì)的花卉品種資源.通過堿基編輯技術(shù)，對(duì)花卉中重要的酶活位點(diǎn)進(jìn)行定向進(jìn)化，調(diào)整酶的活性是未來花卉基因編輯育種的重要方向.

3.2.2 多基因敲除

在植物生長(zhǎng)和發(fā)育過程中，一個(gè)性狀往往是由多個(gè)基因共同控制的，或者存在多個(gè)基因功能冗余現(xiàn)象，因此需要同時(shí)突變多個(gè)基因以達(dá)到改變性狀的目的.多基因逐個(gè)敲除效率低且耗時(shí)長(zhǎng)，使用多基因敲除系統(tǒng)可同時(shí)敲除多個(gè)基因，大大縮短育種的周期.目前已有多個(gè)多基因敲除的策略，包括多轉(zhuǎn)錄元件（MCTU）系統(tǒng)、雙轉(zhuǎn)錄元件（TCTU）系統(tǒng)、單轉(zhuǎn)錄元件（STU）系統(tǒng)和簡(jiǎn)化單轉(zhuǎn)錄元件（SSTU）系統(tǒng)，通過不同的組合方式將多個(gè)sgRNA和Cas 9組合表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)多個(gè)基因被同時(shí)敲除的目的[29].將多基因編輯系統(tǒng)應(yīng)用于花卉育種中也將是花卉基因編輯育種的趨勢(shì).

3.2.3 CRISPR/Cas核糖核蛋白復(fù)合物（RNPs）

迄今為止，大多數(shù)CRISPR系統(tǒng)都是通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的T-DNA轉(zhuǎn)移，或基因槍法將CRISPR/Cas 9質(zhì)粒導(dǎo)入植物細(xì)胞中，CRISPR/Cas 9元件會(huì)整合到未知的基因組位點(diǎn)上.RNP復(fù)合體介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)是在體外將純化的Cas蛋白和sgRNA預(yù)先組裝成具有活性的CRISPR/Cas RNP復(fù)合物，再將其通過物理或者化學(xué)的方法直接導(dǎo)入到植物細(xì)胞中，因?yàn)閷?dǎo)入的RNPs是具有完整活性的，當(dāng)它進(jìn)入細(xì)胞后能夠立即發(fā)揮功能，快速切割靶位點(diǎn)的DNA，從而產(chǎn)生無外源DNA整合在植物基因組上的基因編輯[30].將RNPs的方法運(yùn)用于花卉基因編輯中也是未來發(fā)展的趨勢(shì).

3.2.4 體外分生組織誘導(dǎo)

MAHER等[31]利用植物細(xì)胞具有全能性、可經(jīng)過脫分化及再分化后轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌愋图?xì)胞的特點(diǎn)，在葉片細(xì)胞中異源表達(dá)特異的發(fā)育調(diào)控因子（DRs），從而改變細(xì)胞發(fā)育命運(yùn)，重新誘導(dǎo)分生組織產(chǎn)生，并進(jìn)一步誘導(dǎo)成再生苗.通過這種方式同時(shí)表達(dá)DRs和基因編輯元件，獲得了可穩(wěn)定遺傳的基因編輯植株[31].這一方法打破了傳統(tǒng)需要通過組織培養(yǎng)進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的限制，為難以進(jìn)行組織培養(yǎng)的植物進(jìn)行基因編輯提供了可能，也為花卉基因編輯提供了新的思路.

4 ?結(jié)語

與傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因育種不同，基因編輯育種可以定向、高效地改變植物自身的基因，從而獲得性狀改良的新種質(zhì).通過穩(wěn)定轉(zhuǎn)化后遺傳分離或者其他一些轉(zhuǎn)化技術(shù)，可以使基因編輯載體分離或不整合到植物基因組中，從而獲得不含任何外源轉(zhuǎn)基因元件的材料，因而基因編輯材料與轉(zhuǎn)基因材料有本質(zhì)的差異，而與傳統(tǒng)育種得到材料實(shí)質(zhì)等同.花卉作為觀賞植物，是基因編輯育種的重要應(yīng)用領(lǐng)域，但目前大多數(shù)花卉都不能夠進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，這極大地制約了基因編輯系統(tǒng)在花卉中的應(yīng)用.隨著基因編輯技術(shù)的不斷完善，更多遺傳轉(zhuǎn)化方法的應(yīng)用和優(yōu)化及花卉功能基因組研究的深入，基因編輯技術(shù)未來必將成為花卉育種的重要手段，在花卉育種中發(fā)揮越來越重要的作用.