李 冬,程 文,秦 璐,任杰輝,鄭 興（西安理工大學(xué),西北旱區(qū)生態(tài)水利國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,陜西 西安 710048）

飲用水消毒是飲用水安全的重要保障,避免了霍亂、痢疾和傷寒等常見(jiàn)疾病的擴(kuò)散傳播[1].然而,隨著消毒工藝的進(jìn)步與發(fā)展,消毒后產(chǎn)生了許多種類的消毒副產(chǎn)物（DBPs）,研究發(fā)現(xiàn)多種癌癥（如結(jié)直腸癌、膀胱癌等）的發(fā)生與通過(guò)飲用水接觸DBPs直接相關(guān)[2].因此,深入研究并控制飲用水消毒后產(chǎn)生的DBPs,對(duì)居民飲水健康具有重要價(jià)值.

消毒副產(chǎn)物主要包括三鹵甲烷、鹵乙酸、鹵乙腈、亞硝胺等類物質(zhì),這些物質(zhì)常常存在于消毒后的飲用水中.相關(guān)研究[3-4]指出飲用水中檢出 700余種DBPs,對(duì)人體健康存在潛在危害,但僅有一少部分DBPs受到監(jiān)管或規(guī)范,如三鹵甲烷及鹵乙酸.因而,掌握各類DBPs的危害及毒性作用,對(duì)DBPs的管控具有重要價(jià)值.近年來(lái)由于含氮廢水排放及氯胺消毒使用的增加,含氮消毒副產(chǎn)物（N-DBPs）逐漸在飲用水中被檢出.已有研究[5-6]表明 N-DBPs比含碳消毒副產(chǎn)物（C-DBPs）具有更強(qiáng)的三致效應(yīng),因而促使N-DBPs備受關(guān)注[7-9].鹵乙腈類消毒副產(chǎn)物（HANs）是最常檢測(cè)到的 N-DBPs[10],也是供水中已知的 10種DBPs中最有害的,占總毒性的45-83%[11].二氯乙腈（DCAN）作為一種典型的 HANs,與大多數(shù)N-DBPs相比,因其具有在水處理廠中檢出率高[12]、含量高[13]、致癌致畸性強(qiáng)等特點(diǎn),逐漸受到廣泛關(guān)注.目前的研究中發(fā)現(xiàn) DCAN會(huì)誘導(dǎo)小鼠皮膚產(chǎn)生腫瘤,甚至導(dǎo)致小鼠 DNA 損傷加劇細(xì)胞凋亡[14-15];使中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞密度降低及 DNA損傷[16].然而,關(guān)于 DCAN暴露的毒理學(xué)特性研究較少,導(dǎo)致對(duì)DCAN管控的研究受到限制.

目前的毒性檢測(cè)一般是以誘導(dǎo)損傷檢測(cè)為主,包括Ames試驗(yàn)、染色體畸變?cè)囼?yàn)、體外彗星試驗(yàn)、內(nèi)源基因突變,以及嚙齒動(dòng)物和水生生物體內(nèi)致癌性生物實(shí)驗(yàn)[17-22].而大多數(shù)體外檢測(cè)只檢測(cè)單一類型的損傷,提供細(xì)菌或其他生物體經(jīng)歷的整體性生理變化信息非常有限;體內(nèi)檢測(cè)方法操作繁瑣、檢測(cè)周期長(zhǎng)、有違 3R（減量化、再利用、再循環(huán)）原則,所以利用高通量和耗時(shí)短的分析方法來(lái)評(píng)估大量環(huán)境污染物的毒性更加迫切.近年來(lái)以高通量技術(shù)為研究手段的毒理基因組學(xué)不斷發(fā)展為環(huán)境污染物的毒性評(píng)估提供了新的研究工具[23],使研究人員能夠在特定條件下,對(duì)環(huán)境污染物在基因水平上的毒性作用進(jìn)行較為全面的分析.因其可對(duì)環(huán)境應(yīng)激源暴露作出應(yīng)答,具有速度快、高通量等優(yōu)勢(shì)被廣泛應(yīng)用[24].

本研究采用以毒理基因組學(xué)為基礎(chǔ)的實(shí)時(shí)基因表達(dá)譜方法,將 DCAN作用于特定 E.coli,對(duì)其所誘導(dǎo)的應(yīng)激反應(yīng)進(jìn)行分析,探究其毒理作用的基因機(jī)制,為研究其對(duì)人類健康可能產(chǎn)生的直接或間接毒性作用提供新思路.

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

DCAN（純度 98%+,上海阿拉丁生化科技股份有限公司）,M9低鹽培養(yǎng)基（濃度:5×,上海瑞楚生物科技有限公司）,二甲基亞砜（DMSO,分析純,廣東省化學(xué)試劑工程技術(shù)研究開(kāi)發(fā)中心）,全自動(dòng)移液工作站（epMotion 5075t,德國(guó)Eppendorf AG）、微孔板細(xì)胞成像系統(tǒng)（Cytation5,USA Bio-Tek）.DCAN 不溶于水,用0.01% DMSO 作助溶劑.因在最大耐受濃度研究中,以DMSO為空白對(duì)照,考察了對(duì)菌株基因表達(dá)的影響,故將DMSO濃度設(shè)定為0.01%,確保對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果無(wú)影響.

1.2 實(shí)驗(yàn)受試菌株

研究中采用的菌株為綠色熒光蛋白（GFP）轉(zhuǎn)染的大腸桿菌基因文庫(kù)（菌株）,E.coli K12,MG1655（含低拷貝質(zhì)粒pUA66或pUA139、卡那霉素抗性基因及快速折疊的gfpmut2基因）包含不同的應(yīng)激反應(yīng)基因啟動(dòng)子[25].

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

以 DCAN在水中的最大溶解度為上限濃度進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn),測(cè)定其生長(zhǎng)抑制情況（OD600）,確定細(xì)胞存活率≥95%時(shí)的濃度,即最大耐受濃度（EC5）為1.429×10-3mg/L,以EC5為實(shí)驗(yàn)濃度上限依次向下稀釋10倍進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究.

菌株置于96孔板中培養(yǎng),37℃條件下靜止過(guò)夜培養(yǎng);以1×M9培養(yǎng)基將菌液按體積比1:5稀釋,轉(zhuǎn)接至 384孔板;將 384孔板中的菌液在 37℃下培養(yǎng)5～6h,使光密度 OD600[26-29]達(dá)到早期指數(shù)生長(zhǎng)階段（OD600讀數(shù)約0.2）;培養(yǎng)后的384孔板中添加不同濃度的DCAN;為了測(cè)定DCAN誘導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄水平效應(yīng),將 384孔板置于微孔板細(xì)胞成像系統(tǒng)中,同時(shí)測(cè)量光密度（OD600,細(xì)胞生長(zhǎng)）和熒光讀數(shù)（GFP水平,Ex:45nm,Em:528nm）,以 2h為暴露時(shí)間,每 5min測(cè)定讀數(shù),實(shí)驗(yàn)設(shè)置3組平行樣.

1.4 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

以5次移動(dòng)平均法處理GFP和OD數(shù)據(jù),然后采用對(duì)照組進(jìn)行校正.將GFP信號(hào)歸一化,以P=GFP/OD計(jì)算,并分別在暴露于和未暴露于DCAN的情況下對(duì)背景進(jìn)行校正（不含GFP的E.coli菌株）.基因表達(dá)的改變,也被稱為誘導(dǎo)因子 I[21],以基因在化學(xué)樣品暴露的實(shí)驗(yàn)條件下及在沒(méi)有任何化學(xué)樣品暴露的對(duì)照條件下的比率表示.采用每個(gè)時(shí)間點(diǎn)I的自然對(duì)數(shù)ln I進(jìn)行進(jìn)一步數(shù)據(jù)分析,ln I值:中性=0、上調(diào)＞0、下調(diào)＜0.同時(shí),通過(guò)整合誘導(dǎo)因子 I隨時(shí)間變化來(lái)計(jì)算轉(zhuǎn)錄效應(yīng)水平指數(shù)（TELI）,用于量化DCAN存在下基因表達(dá)水平的改變,指示給定基因在一定暴露期內(nèi)的累積轉(zhuǎn)錄效應(yīng)[30-31],通過(guò)識(shí)別和分析與特定應(yīng)激反應(yīng)途徑相關(guān)的基因變化,探究DCAN的毒性作用模式.

1.5 自組織映射（SOM）分析

SOM 常用于基因表達(dá)數(shù)據(jù)的探索性分析,目前已被有效地用于共表達(dá)基因組的發(fā)現(xiàn)或化學(xué)物質(zhì)的分類研究中[32].為從濃度-時(shí)間-基因三維數(shù)據(jù)集中發(fā)現(xiàn)具有相似表達(dá)水平的基因,識(shí)別 DCAN的毒性作用模式,采用微陣列軟件套件 MeV 4.9[33]進(jìn)行SOM分析及可視化,參數(shù)設(shè)置如表1所示.

表1 SOM分析參數(shù)設(shè)置Table 1 Parameter setting of SOM analysis

1.6 DCAN毒性終點(diǎn)確定

轉(zhuǎn)錄效應(yīng)水平指數(shù)（TELI）是最近開(kāi)發(fā)的毒理基因組學(xué)數(shù)據(jù)解釋指數(shù),且與表型毒性研究中所采用的終點(diǎn)指標(biāo)存在一定的相關(guān)性[29].TELI值分析方法考慮到化合物暴露導(dǎo)致的表達(dá)改變基因的數(shù)量、特性、程度及時(shí)間序列,可以確定單個(gè)基因或代表特定途徑或整個(gè)應(yīng)激反應(yīng)的變化,故采用TELI值為基礎(chǔ)的數(shù)據(jù)擬合劑量-反應(yīng)曲線,進(jìn)行分子毒性終點(diǎn)的推導(dǎo).在毒理基因組學(xué)中,以TELI值法表示的基因表達(dá)水平達(dá) 1.5時(shí)的濃度用 TELI1.5表示,反映了亞急性毒性中毒性作用的最低濃度,故采用graphpad Prism 5.0軟件以四參數(shù)非線性回歸模型擬合TELI劑量-效應(yīng)曲線,由此得出各應(yīng)激途徑的毒性終點(diǎn)TELI1.5.

2 結(jié)果與討論

2.1 DCAN對(duì)E.coli實(shí)時(shí)基因表達(dá)的影響

通過(guò)在6個(gè)濃度梯度的DCAN中暴露E.coli菌株120min的實(shí)驗(yàn)方法,獲得時(shí)間及濃度兩個(gè)維度下的基因表達(dá)譜,結(jié)果如圖 1所示,圖中提供了有關(guān)各種應(yīng)激反應(yīng)途徑和功能基因的詳細(xì)表達(dá)信息,根據(jù)應(yīng)激基因的主要功能和參與的不同應(yīng)激機(jī)制程度分為5個(gè)功能組,包括DNA應(yīng)激（含SOS反應(yīng)）、氧化還原應(yīng)激（含解毒和氧化還原平衡）、蛋白質(zhì)應(yīng)激、膜（脂質(zhì)應(yīng)激和膜轉(zhuǎn)運(yùn)體）和普通應(yīng)激[15].從圖譜中可以看出,DCAN的基因表達(dá)譜較為復(fù)雜具有動(dòng)態(tài)性,隨時(shí)間及濃度不同,不同基因產(chǎn)生了不同的表達(dá)結(jié)果,如otsB在1.429×10-4mg/L時(shí)表達(dá)上調(diào)趨勢(shì)明顯,為正向調(diào)控;低濃度暴露促進(jìn)了 mutS的表達(dá);uvrY在不同濃度中表達(dá)水平不斷變化;motA在所有濃度中都呈現(xiàn)出上調(diào)趨勢(shì);而 umuD僅在最高實(shí)驗(yàn)濃度中表達(dá)上調(diào)趨勢(shì)明顯;其他一些基因表達(dá)呈現(xiàn)出短時(shí)效應(yīng)及延遲效應(yīng).圖譜中還顯示大多數(shù)普通應(yīng)激基因表達(dá)呈上調(diào)趨勢(shì),說(shuō)明 DCAN暴露過(guò)程中對(duì)細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)態(tài)環(huán)境可能產(chǎn)生嚴(yán)重干擾;與其他類型應(yīng)激相比,大部分與DNA應(yīng)激相關(guān)的基因表達(dá)水平變化比較明顯,這些基因表達(dá)水平變化可能與生物體內(nèi)多個(gè)基因的激活和信號(hào)通路變化相關(guān).

圖1 DCAN暴露下E.coli菌株的實(shí)時(shí)基因表達(dá)譜Fig.1 Real-time gene expression profile of E.coli exposed to DCAN

2.2 DCAN對(duì)E.coli毒性作用分析

采用SOM聚類方法,根據(jù)基因的時(shí)間表達(dá)模式識(shí)別出9類基因簇（圖2a）.第I類包含基因數(shù)目達(dá)35個(gè),約占總基因數(shù)的32%,且多與DNA損傷及氧化還原應(yīng)激相關(guān),基因表達(dá)呈下調(diào)趨勢(shì);而第Ⅳ類基因則在 40min后從中性狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橄抡{(diào)狀態(tài);DCAN暴露下,第Ⅴ與Ⅵ類中的基因并未產(chǎn)生表達(dá)改變.與其他基因簇相比,第Ⅸ類有 28個(gè)與普通應(yīng)激、膜及DNA損傷應(yīng)激相關(guān)的基因均處于上調(diào)狀態(tài).與對(duì)照組相比,參與DNA修復(fù)的SOS系統(tǒng)中uvrA、ybfE、nfo和sbmC等基因表達(dá)水平較高,屬于上調(diào)基因,其中 uvrA是檢測(cè)損傷并啟動(dòng)下游內(nèi)質(zhì)網(wǎng)級(jí)聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵蛋白,優(yōu)先與受損DNA結(jié)合[34],修復(fù)多種DNA病變過(guò)程,與核苷酸切除修復(fù)（NER）途徑相關(guān),它的過(guò)度表達(dá)表明它在修復(fù)各種各樣的損傷中起著積極的作用;核酸內(nèi)切酶nfo在雙脫氧核糖核酸中催化單鏈斷裂,參與堿基切除修復(fù)（BER）,它的上調(diào)表明DCAN暴露使DNA鏈發(fā)生斷裂,同時(shí)nfo基因?qū)^(guò)氧化氫和其他活性氧（ROS）等氧化劑有反應(yīng),說(shuō)明DCAN通過(guò)氧化應(yīng)激進(jìn)而誘導(dǎo) DNA損傷的發(fā)生.RecE是E.coli經(jīng)典RecET重組系統(tǒng)的一部分,與游離的雙鏈DNA（dsDNA）末端結(jié)合,采用與I型外切酶類似的機(jī)制,過(guò)程性消化 dsDNA,從而使受損DNA鏈的核苷酸重新定位在活性位點(diǎn)內(nèi)的50′末端鏈上[35],對(duì)DNA進(jìn)行修復(fù),RecE表達(dá)上調(diào)同樣說(shuō)明DCAN會(huì)促進(jìn)E.coli DNA損傷.SOM分析中存在多個(gè) DNA修復(fù)相關(guān)基因的啟動(dòng)子活性改變表明DCAN引起DNA損傷,該結(jié)果與之前的研究結(jié)果一致[15,36-37].Lipscomb等[38]和 Ahmed 等[39]的研究也指出DCAN會(huì)誘導(dǎo)DNA鏈斷裂,進(jìn)而造成了DNA損傷.在DCAN暴露下SOS應(yīng)急系統(tǒng)中的基因也存在表達(dá)抑制的情況,但并不是所有的 SOS基因都參與生理性 DNA 修復(fù)途徑[40].因此,其對(duì)不同基因毒性的參與和活性有待進(jìn)一步研究.

圖2 DCAN的SOM圖Fig.2 The SOM diagram of DCAN

除SOS應(yīng)急基因外,22個(gè)與其他應(yīng)激相關(guān)的基因包括耐藥/敏感基因、普通應(yīng)激基因和解毒機(jī)制基因在 DCAN暴露條件下呈上調(diào)趨勢(shì),其中耐藥基因cmr（又稱 mdfA）,是轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族（MFS）的成員,其產(chǎn)物是一種多藥外排蛋白,其過(guò)度表達(dá)可導(dǎo)致廣泛化合物的耐藥性;motA與鞭毛合成和運(yùn)動(dòng)功能有關(guān),其表達(dá)改變會(huì)影響 E.coli代謝功能;emrA、sbmA、sanA、pbpG與膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及排泄有關(guān),cls涉及細(xì)胞膜及磷脂的合成.上調(diào)基因中還包括氧化還原應(yīng)激中的inaA、yeaE、trxC、trxA基因,yeaE、trxC、trxA與解毒機(jī)制相關(guān),DCAN暴露觸發(fā)了解毒機(jī)制,表明氧化還原應(yīng)激是重要的毒性作用模式,Esmat等[15]的研究發(fā)現(xiàn) DCAN存在條件下通過(guò)氧化應(yīng)激及神經(jīng)退行性病變進(jìn)而對(duì)胎鼠腦組織產(chǎn)生不良影響.與細(xì)胞死亡有關(guān)的 slyA表達(dá)也表現(xiàn)出上調(diào)趨勢(shì),基因cyoA在40min后表達(dá)呈下調(diào)趨勢(shì),說(shuō)明DCAN的存在干擾了電子傳遞可能影響細(xì)胞內(nèi) ATP水平,對(duì)能量代謝產(chǎn)生影響.許多與普通應(yīng)激相關(guān)的基因在DCAN暴露中存在過(guò)表達(dá)的情況,表明細(xì)胞生物化學(xué)和物理穩(wěn)態(tài)可能受到干擾,但在現(xiàn)有研究中未發(fā)現(xiàn)相關(guān)報(bào)道,表明普通應(yīng)激可能是 DCAN潛在的毒性作用模式.其他功能基因暴露在 DCAN中表達(dá)水平發(fā)生了改變,說(shuō)明 DCAN對(duì)其他類型的應(yīng)激反應(yīng)也存在一定影響.

2.3 DCAN毒性終點(diǎn)確定

劑量是決定外源化學(xué)物對(duì)機(jī)體造成損害作用的主要因素之一[41],劑量的多少?zèng)Q定了毒性的強(qiáng)弱.因此,為了獲取DCAN定量分子毒性終點(diǎn),采用TELI值法對(duì)不同功能基因的表達(dá)水平進(jìn)行計(jì)算,獲得了不同濃度下不同途徑應(yīng)激反應(yīng)的毒性變化,結(jié)果如表2所示,發(fā)現(xiàn)DNA應(yīng)激及普通應(yīng)激的TELI值隨濃度增大呈增加趨勢(shì),表明毒性隨濃度增加而增加,但在其他應(yīng)激反應(yīng)中沒(méi)有呈現(xiàn)較好相關(guān)變化趨勢(shì).為進(jìn)一步探究濃度與毒性作用的關(guān)系,采用四參數(shù)非線性回歸模型擬合了DCAN 6個(gè)濃度梯度的劑量-效應(yīng)關(guān)系曲線,擬合結(jié)果如圖3所示.不同應(yīng)激反應(yīng)表現(xiàn)出特征性的“S形”曲線或“S形”曲線的一部分.該研究結(jié)果與以劑量的對(duì)數(shù)對(duì)藥效作圖,多呈 S型曲線的理論[42]相一致.從劑量效應(yīng)曲線中可以觀察到 DNA損傷是 DCAN誘導(dǎo)的主要毒性作用模式,該結(jié)果與SOM分析結(jié)果一致.在DCAN最低濃度暴露下,DNA損傷非常明顯,其他各類型應(yīng)激反應(yīng)變化水平呈現(xiàn)氧化還原應(yīng)激＞普通應(yīng)激＞膜應(yīng)激＞蛋白質(zhì)應(yīng)激的趨勢(shì),說(shuō)明普通應(yīng)激和氧化應(yīng)激損傷也是DCAN誘導(dǎo)的重要毒性作用模式.這些結(jié)果均表明DCAN對(duì)重組基因的大腸桿菌存在潛在毒性作用.

表2 DCAN暴露下不同應(yīng)激反應(yīng)毒性變化Table 2 Toxicity changes of different stress responses to DCAN

圖3 基于TELI值的DCAN劑量-效應(yīng)曲線Fig.3 Dose-response curves of DCAN based on TELI values

通過(guò)實(shí)驗(yàn)分析及模型計(jì)算得到DCAN的不同應(yīng)激反應(yīng)類型毒性終點(diǎn),結(jié)果如圖4所示（因普通應(yīng)激擬合后數(shù)據(jù)范圍較為寬泛,無(wú)法得出TELI1.5具體數(shù)據(jù)值）.從圖中可以看出,DNA 應(yīng)激的 TELI1.5為6.54×10-9mg/L,與其他應(yīng)激反應(yīng)的 TELI1.5相比數(shù)量級(jí)最小,濃度小而產(chǎn)生的基因表達(dá)水平與其他應(yīng)激基因表達(dá)一致,說(shuō)明 DNA損傷是主要的毒性作用模式.

圖4 DCAN的毒性終點(diǎn)Fig.4 The toxicity endpoint of DCAN

3 結(jié)論

3.1 E.coli暴露于DCAN中,獲得的實(shí)時(shí)基因表達(dá)譜復(fù)雜又具有動(dòng)態(tài)性,不同基因隨時(shí)間及濃度改變產(chǎn)生了不同的表達(dá)結(jié)果.

3.2 在高實(shí)驗(yàn)濃度 DCAN 暴露條件下,多個(gè)參與SOS調(diào)節(jié)的基因啟動(dòng)子活性發(fā)生改變,從而引起DNA損傷,并通過(guò)正向調(diào)控inaA、yeaE、trxC、trxA基因加劇氧化還原應(yīng)激,同時(shí)與普通應(yīng)激相關(guān)的基因的過(guò)表達(dá)也說(shuō)明E.coli細(xì)胞生物化學(xué)和物理穩(wěn)態(tài)可能受到干擾.

3.3 DCAN劑量-效應(yīng)關(guān)系曲線表現(xiàn)出特征性的“S形”曲線或“S形”曲線的一部分,且與其他應(yīng)激反應(yīng)的毒性終點(diǎn)相比,DNA應(yīng)激的 TELI1.5數(shù)量級(jí)最小,因而DNA損傷是主要的毒性作用模式.