龔振華，金國(guó)棟，王麗萍，欒慶東，路 平，劉 坤，張?jiān)葡悖鯐苑f，牟瑞營(yíng)

(1.中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032；2.甘肅臨夏豐源奶牛養(yǎng)殖有限公司，甘肅臨夏 731100；3.青島易邦生物工程有限公司，山東青島 266111；4.青島博隆基因工程有限公司，山東青島 266021；5.臨朐縣職業(yè)教育中心，山東臨朐 262600；6.臨朐縣畜牧局，山東臨朐 262600)

雞傳染性支氣管炎(Infectious bronchitis，IB)由γ屬冠狀病毒雞傳染性支氣管炎病毒(Infectious bronchitis virus，IBV)引起，該病嚴(yán)重危害養(yǎng)雞業(yè)。IBV基因組容易發(fā)生變異，導(dǎo)致出現(xiàn)新的IBV毒株，而新出現(xiàn)的IBV毒株的血清型、基因型和所引起的臨床癥狀多種多樣[1]。大多數(shù)情況下，新出現(xiàn)的IBV毒株間不存在相互交叉保護(hù)現(xiàn)象，增加了IBV的診斷和防控難度[1]。自發(fā)現(xiàn)IBV以來(lái)，全球養(yǎng)雞業(yè)一直受IBV的困擾，一些致病性極強(qiáng)的IBV新毒株不斷出現(xiàn)，個(gè)別毒株甚至出現(xiàn)地區(qū)暴發(fā)、大范圍流行，嚴(yán)重危害養(yǎng)雞業(yè)[2]。雖然疫苗免疫是國(guó)內(nèi)外防控IBV的主要手段，但是IBV變異株的不斷出現(xiàn)，使其防控面臨嚴(yán)重挑戰(zhàn)。就目前國(guó)內(nèi)IBV的流行狀況而言，應(yīng)當(dāng)多方面關(guān)注，加強(qiáng)IBV的防控。

1 IBV的危害性

IBV感染對(duì)于養(yǎng)雞業(yè)的影響較大。據(jù)報(bào)道，在巴西暴發(fā)IBV的地區(qū)，養(yǎng)雞場(chǎng)平均每飼養(yǎng)1 000只種雞的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)4 210美元，平均每飼養(yǎng)1 000只肉雞的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)266美元[3]。IBV在我國(guó)被列為二類(lèi)動(dòng)物疫病，對(duì)于國(guó)內(nèi)養(yǎng)雞業(yè)的影響也較大。目前我國(guó)對(duì)于IBV的防控主要依靠免疫防治措施，估計(jì)我國(guó)因IBV流行所致的具體經(jīng)濟(jì)損失情況與巴西相差無(wú)幾。

IBV對(duì)于雞群具有高度易感性，任何日齡的雞都容易感染IBV，雛雞和產(chǎn)蛋雞最為易感，幼齡雞的感染率通常為25%～30%，高者可達(dá)75%。當(dāng)雞群出現(xiàn)過(guò)熱、寒冷、擁擠、通風(fēng)不良、營(yíng)養(yǎng)不均衡以及疫苗接種應(yīng)激反應(yīng)時(shí)，更容易促進(jìn)本病的發(fā)生[4]。

IBV對(duì)于雞群具有高度致病性，感染IBV的病雞表現(xiàn)嚴(yán)重的呼吸道、消化道、生殖道和腎臟疾病，發(fā)病雞群普遍出現(xiàn)死亡、生長(zhǎng)緩慢和產(chǎn)蛋量下降，病死率很高[4-5]。

IBV具有極強(qiáng)的傳播性，感染IBV的雞通過(guò)呼吸道、泄殖腔等向外排毒，空氣、飛沫、塵埃、飲水、飼料、墊料等是IBV最常見(jiàn)的傳播媒介，暴露在外的IBV在35 d內(nèi)仍具有傳染性，病雞康復(fù)后體內(nèi)帶毒時(shí)間長(zhǎng)達(dá)49 d[4]。

IBV的危害不僅在于發(fā)病期間疾病對(duì)于感染雞所造成的危害，還在于病期過(guò)后患過(guò)此病的雞群會(huì)推遲開(kāi)產(chǎn)，部分雞群出現(xiàn)輸卵管囊腫、變形，雞只表面看上去健康，采食正常，卵巢剖檢看似發(fā)育較好，但因?yàn)檩斅压苡胁∽?，失去了造蛋功能，發(fā)病雞康復(fù)后，變成假母雞，導(dǎo)致雞群達(dá)不到產(chǎn)蛋高峰，增加成本，造成生產(chǎn)虧損[4]。

2 IBV的多樣性

2.1 IBV具有變異的特性

IBV作為冠狀病毒，也是一種單股正鏈RNA病毒。IBV的RNA長(zhǎng)約27.6 kb，明顯大于其他病毒RNA的長(zhǎng)度[6]。IBV在復(fù)制過(guò)程中，病毒依賴(lài)性的RNA聚合酶缺乏校對(duì)功能，不能識(shí)別病毒RNA所產(chǎn)生的點(diǎn)突變和基因重組[7]。此外，病毒RNA在機(jī)體的復(fù)制頻率很高[2]。因此，IBV基因組在復(fù)制過(guò)程中容易發(fā)生變異，從而使病毒能夠適應(yīng)環(huán)境的選擇壓力和逃避宿主的免疫清除。加上IBV流行廣泛，進(jìn)一步增加病毒重組變異的概率，導(dǎo)致IBV流行株多種多樣。

IBV的S基因變異是引起IBV多樣性的主要原因。S蛋白是位于IBV顆粒表面的一種棘突蛋白，由S1和S2蛋白組成，其中S1蛋白不僅通過(guò)介導(dǎo)病毒與易感細(xì)胞發(fā)生融合，決定病毒的毒力，還通過(guò)誘導(dǎo)產(chǎn)生血凝抑制和病毒中和抗體，決定病毒的抗原性，不同IBV毒株的S1蛋白因其氨基酸序列變異，IBV的致病性和抗原性也因此表現(xiàn)不同差異[8]。

2.2 血清型多樣性

IBV的血清型可以根據(jù)中和試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)和血凝抑制試驗(yàn)等方法進(jìn)行區(qū)分。目前主要根據(jù)中和試驗(yàn)區(qū)分IBV的血清型，這樣可以獲知IBV的抗原免疫交叉保護(hù)特性，對(duì)于指導(dǎo)IBV免疫具有重要作用，用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)和血凝抑制試驗(yàn)區(qū)分IBV血清型有利于免疫抗體監(jiān)測(cè)[5]。國(guó)內(nèi)外報(bào)道的IBV血清型已有30多種，不同血清型IBV間缺乏交叉保護(hù)[9]。

國(guó)內(nèi)流行的IBV毒株血清型多種多樣，與疫苗株存在差異[10-12]。張麗華等[10]采用中和試驗(yàn)對(duì)2012年-2013年的15個(gè)廣西IBV分離株進(jìn)行血清分型，結(jié)果表明15個(gè)IBV分離株分屬7個(gè)血清型，與生產(chǎn)上廣泛使用的疫苗株H120血清型一致的僅有1株，重組毒株GX-NN130048的血清型不同于其親代血清型。胡北俠等[11]采用中和試驗(yàn)對(duì)4/91、H120和Ma5等3個(gè)IBV疫苗株和18個(gè)IBV山東分離株進(jìn)行分型，共區(qū)分5個(gè)血清型，其中，4/91屬于1個(gè)單獨(dú)血清型，H120、Ma5與2個(gè)分離株(SDWF0608和SDLY0701)屬于同一血清型，SDZB0808等14個(gè)分離株為同一血清型，分離株CK/CH/SD09/006和CK/CH/SD10/001分別與其他IBV組成2個(gè)血清型。該研究表明，18個(gè)IBV流行株與3個(gè)疫苗株之間抗原性存在差異，IBV毒株之間表現(xiàn)單向中和反應(yīng)性，即使屬于同一血清型的IBV毒株之間，其抗原相關(guān)性也可能存在明顯差異。

IBV的血清學(xué)分型在實(shí)際應(yīng)用中受到局限，主要是缺乏公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)化陽(yáng)性血清，且試驗(yàn)操作復(fù)雜[13]。通過(guò)單一的實(shí)驗(yàn)室研究[10-12]就已經(jīng)證明國(guó)內(nèi)流行的IBV毒株血清型多種多樣，如果條件許可，能夠采用統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)國(guó)內(nèi)所有IBV分離株進(jìn)行統(tǒng)一的血清分型，則IBV抗原相關(guān)性可能會(huì)表現(xiàn)得比現(xiàn)在已知的更復(fù)雜，血清型可能更多。

2.3 臨床癥狀和病理變化多樣性

由于IBV感染，引起發(fā)病雞的臨床癥狀和病理變化等表觀特征多種多樣，包括典型的呼吸道癥狀、腎臟病變和產(chǎn)蛋量下降等，IBV的這些表觀癥狀在國(guó)內(nèi)外普遍存在[1]。

早在1931年，Schalk等報(bào)道了呼吸道型IBV毒株，其臨床表現(xiàn)主要以張口呼吸、咳嗽、氣管啰音等呼吸道癥狀為特征[5]。1962年，Wintefield等發(fā)現(xiàn)了腎型IBV毒株，典型癥狀是腎腫大、蒼白、腎小管和輸尿管充滿尿酸鹽，病死率高[5]。1986年Elhouadfi等分離到嗜腸型IBV毒株[5]，該毒株臨床上易造成腸道損傷。1991年英國(guó)發(fā)現(xiàn)4/91株IBV毒株[14]，該毒株引起深層肌肉壞死，導(dǎo)致蛋用種雞死亡率升高，剖檢表現(xiàn)為氣管炎癥、腎腫脹、胸肌蒼白，嚴(yán)重的出血、水腫等病變。1995年杜元釗等[15]在我國(guó)膠東地區(qū)發(fā)現(xiàn)輸卵管型IBV毒株，該毒株主要侵害后備母雞的輸卵管，導(dǎo)致產(chǎn)蛋障礙綜合征。1995年以來(lái)，我國(guó)江蘇、山東等地發(fā)現(xiàn)了腺胃型IBV毒株，臨床表現(xiàn)為雞群生長(zhǎng)緩慢、消瘦和腹瀉，主要病變?yōu)橄傥副跇O度增厚、腺胃腫脹、腺胃乳頭出血、潰瘍并伴有膿性分泌物[16]。

由于IBV的臨床癥狀和病理變化等表觀特征多種多樣，給IBV的臨床診斷增加了難度，因此，當(dāng)雞群表現(xiàn)精神不振、食欲下降，出現(xiàn)呼吸道、消化道或者是產(chǎn)蛋下降等臨床表現(xiàn)時(shí)，均可以懷疑雞群感染IBV，需要采集病料，進(jìn)一步進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室診斷，確診雞群是否感染IBV[17]。

2.4 基因型多樣性

由于IBV變異，采用基因分型對(duì)于IBV進(jìn)行監(jiān)測(cè)和歸類(lèi)極為重要，可以在短時(shí)間內(nèi)分出大量IBV分離株，并比較這些分離株彼此之間以及與其他IBV之間的相關(guān)性，分析變異規(guī)律。

基于IBV的S基因序列，Keeler等[18]和Jackwood等[19]用基因型表示IBV毒株之間的相關(guān)性和差異性，鑒定了Massachusetts(Mass)、Connecticut、Arkansas、DE/072/92和California等基因型毒株。

通過(guò)基因型研究，證明IBV毒株具有地域性特點(diǎn)[20-21]。比如McFarlane[20]通過(guò)S1基因分析發(fā)現(xiàn)，新西蘭4種新的IBV分離株(T6、K32、K43和K87)與25年前流行的4種IBV毒株(A、B、C和D)具有大于82.8%的核苷酸和79%的氨基酸同源性。其中T6、K43和K87與C和D同源性超過(guò)99%，與歐洲或北美株相比，新西蘭株與澳大利亞株的關(guān)系更緊密，新西蘭A株與澳大利亞Vic S株具有99.5%的核苷酸同源性和98.7%的氨基酸同源性。

國(guó)內(nèi)IBV基因型眾多[22-24]。周海生等報(bào)道[22]2002年-2016年間我國(guó)流行的92株IBV可以分為13個(gè)基因型，包括QX、4/91、Mass、tl/CH/LDT3/03、CK/CH/LSC/99I、TW-I、TW-II、TC07-2、Ck/CH/LDL/97I、N1/62-associated、Arkansas、New-I及一個(gè)新鑒定的基因分支New-II。其中，屬于美國(guó)相關(guān)基因分支的ck/CH/LSD/110712已在我國(guó)出現(xiàn)，新出現(xiàn)的基因分支New-II病毒S1基因來(lái)源于tl/CH/LDT3/03型與QX型毒株重組。此外，有52株IBV基因組存在重組。

3 我國(guó)IBV防控的主要問(wèn)題

3.1 IBV流行嚴(yán)重

國(guó)內(nèi)IBV最早于1972年見(jiàn)于廣東省[25]，隨后在我國(guó)廣泛存在和流行，并造成巨大經(jīng)濟(jì)損失[22-24]。我國(guó)流行的IBV不同于其他洲、國(guó)家或地區(qū)，毒株復(fù)雜多樣，我國(guó)各種血清型IBV分離株眾多，外來(lái)血清型IBV不斷傳入，還有病毒變異所致的IBV共同存在和流行，導(dǎo)致IBV血清型多種多樣，難以控制；我國(guó)流行的IBV為多種致病型毒株，主要以“腎型”毒株為主；因此，針對(duì)我國(guó)流行的IBV復(fù)雜情況，開(kāi)展相關(guān)弱毒疫苗的研究非常迫切[26]。

3.2 國(guó)內(nèi)現(xiàn)有的商品疫苗不能對(duì)IBV流行株提供足夠的保護(hù)

國(guó)內(nèi)現(xiàn)有的商品化IBV疫苗主要為M41株、Ma5株、H120株、H52株、W93株、LDT3株等疫苗株，這些疫苗株均為Mass血清型，偏重于針對(duì)呼吸道型IBV，其中，M41株、Ma5株由美國(guó)研制，H120株和H52株由荷蘭研制，W93株和LDT3株由我國(guó)自主研制[27]。國(guó)內(nèi)現(xiàn)有的商品化IBV疫苗還包括QX株、44/91株、28/86株等非Mass血清型疫苗，其中，QX株疫苗由我國(guó)自主研制，44/91株疫苗源于英國(guó)發(fā)生雞深層肌肉病變、產(chǎn)蛋力下降、有呼吸道癥狀、腹瀉的變異性傳染性支氣管炎毒株，一些地區(qū)也使用44/91株預(yù)防腎型傳染性支氣管炎的感染，28/86株疫苗源于1986年意大利暴發(fā)腎型傳染性支氣管炎選育[27]。

分析國(guó)內(nèi)現(xiàn)有的商品化IBV疫苗株種類(lèi)，可以看出這些疫苗株至少顯示出兩方面結(jié)構(gòu)性不足，不能對(duì)國(guó)內(nèi)流行的IBV提供完全保護(hù)，必須尋求技術(shù)突破。一是過(guò)分依靠國(guó)外源疫苗株，缺乏本地源疫苗的針對(duì)性，始終不能解決我國(guó)IBV流行株的地域性差異問(wèn)題；二是疫苗主要為Mass血清型，不能滿足防控變異IBV的需求。已經(jīng)證明[10-11]，4/91株、H120株和Ma5株等IBV疫苗株并不能夠?qū)τ诙鄶?shù)IBV分離株產(chǎn)生中和保護(hù)。張麗華等[10]報(bào)道，僅15株廣西分離株即分出7種血清型，其中6個(gè)血清型已經(jīng)超出H120株的保護(hù)，而國(guó)內(nèi)流行的IBV血清型應(yīng)遠(yuǎn)不止7種血清型。因此，現(xiàn)有IBV疫苗已經(jīng)不能對(duì)當(dāng)前國(guó)內(nèi)流行的大部分基因型毒株產(chǎn)生良好的免疫保護(hù)，IBV防控形勢(shì)嚴(yán)峻[28]。

3.3 血清型不匹配的IBV弱毒疫苗免疫催生副作用

由于IBV的血清型眾多，不同IBV毒株間的交叉保護(hù)性很弱甚至沒(méi)有保護(hù)性，接種疫苗雞群產(chǎn)生的IBV抗體水平雖然較高，但不能保護(hù)流行IBV毒株的攻擊，導(dǎo)致傳統(tǒng)的疫苗有時(shí)候并不能控制IBV的發(fā)生，當(dāng)傳統(tǒng)的疫苗不能有效控制IBV流行株時(shí)，可能更惡化IBV疫情的流行。周海生等報(bào)道[22]，25個(gè)IBV分離株基因組中發(fā)現(xiàn)有疫苗型(Mass、tl/CH/LDT3/03及4/91型等)病毒基因組片段的重組，證明疫苗毒株基因頻繁參與了IBV基因重組，導(dǎo)致IBV新的基因型或變異株出現(xiàn)。陳彤等報(bào)道[23]，廣西分離的CK/CH/GX/LC17-1毒株是由于疫苗株Ark型ArkDPI毒株與Mass型Ma5毒株S1基因發(fā)生重組所致，因?yàn)閭鹘y(tǒng)弱毒疫苗在免疫雞群中持續(xù)存在，從而成為IBV重組變異的供體。Liu報(bào)道[29]，我國(guó)IBV變異的主要原因可能是由于雞群使用IBV多價(jià)活苗免疫，加上雞群中其他IBV野毒株混合感染，這為IBV基因重組提供了便利條件，最終導(dǎo)致了雞群中流行的IBV毒株的血清型和基因型改變。

4 建議

4.1 加強(qiáng)IBV的流行病學(xué)監(jiān)測(cè)

由于IBV嚴(yán)重危害我國(guó)養(yǎng)雞業(yè)，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，行業(yè)主管機(jī)構(gòu)必須高度重視。鑒于國(guó)內(nèi)IBV流行毒株的多樣性、廣泛性和地區(qū)差異性，尤其是病毒變異對(duì)于IBV防控造成極大的困難，必須準(zhǔn)確掌握每個(gè)地區(qū)的IBV流行規(guī)律，采取有針對(duì)性的防控措施。僅僅依靠少數(shù)研究機(jī)構(gòu)和防疫部門(mén)解決IBV防控的技術(shù)性問(wèn)題是不現(xiàn)實(shí)的。國(guó)內(nèi)不同地區(qū)均要有研究機(jī)構(gòu)參與IBV防控，才能形成防控IBV的合力。

4.2 提高疫苗免疫的針對(duì)性

針對(duì)國(guó)內(nèi)流行的IBV多種多樣的特點(diǎn)，開(kāi)展IBV的流行病學(xué)監(jiān)測(cè)，采用RT-PCR檢測(cè)IBV，結(jié)合S基因序列分析，與GenBank公布的IBV分離株基因序列進(jìn)行比對(duì)，確定流行毒株的基因型，搞清地區(qū)流行的IBV流行株的分子流行病學(xué)特征及基因重組規(guī)律，其技術(shù)條件已經(jīng)比較完備。通過(guò)IBV流行株的分子流行病學(xué)分析，進(jìn)一步追蹤病毒來(lái)源，分析致病特性，尋找參考疫苗，為IBV疫苗免疫提供支持?？紤]到IBV的基因型與血清型并不是完全一一對(duì)應(yīng)，對(duì)于基因型相近但抗原性卻相差甚遠(yuǎn)的IBV毒株，在開(kāi)展IBV流行株的分子流行病學(xué)分析的同時(shí)，可以通過(guò)病毒中和試驗(yàn)或免疫交叉保護(hù)試驗(yàn)，尋找IBV免疫參考疫苗。

4.3 篩選適合特定地區(qū)的IBV疫苗

IBV的防控主要依靠疫苗免疫接種。鑒于IBV的地區(qū)差異性，最好培育與本地區(qū)流行毒株基因型一致的弱毒疫苗株，不僅可以提高保護(hù)效果，還可以減少本地區(qū)IBV發(fā)生重組變異的概率。國(guó)外已有成功案例[30-31]，美國(guó)的Ark99、GA98疫苗株，澳大利亞的VicS、N1/88疫苗株以及韓國(guó)的KM91疫苗株等，均為雞胚連續(xù)傳代致弱毒株，具有地區(qū)特色，也具有良好的免疫原性，有效控制了當(dāng)?shù)豂BV毒株的傳播。