李 晶 ， 孫海通 ， 劉 暢 ， 龐 茉 ， 金藝鵬

(1.北京中農(nóng)大動(dòng)物醫(yī)院有限公司 ， 北京 海淀 100193 ； 2. 中國牧工商集團(tuán)有限公司 ， 北京 豐臺(tái) 100070 ；3.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 ， 北京 海淀 100193)

糖尿病是犬常發(fā)的內(nèi)科病之一，糖尿病誘發(fā)眼部的病變包括白內(nèi)障、角膜內(nèi)皮細(xì)胞的缺失、角膜內(nèi)皮的多形性、角膜敏感性降低、視網(wǎng)膜血管損傷如小血管瘤等，其中最常見的眼部病變是白內(nèi)障。文獻(xiàn)表明，75%糖尿病患犬在發(fā)病后12個(gè)月內(nèi)出現(xiàn)白內(nèi)障，80%糖尿病患犬在患病后16個(gè)月內(nèi)出現(xiàn)白內(nèi)障[1]。有報(bào)道顯示，糖尿病患犬白內(nèi)障術(shù)后潰瘍性角膜炎的發(fā)病率高于非糖尿病性白內(nèi)障患犬，且糖尿病患犬的角膜敏感性低于正常犬[2]。白內(nèi)障相關(guān)研究推斷，角膜創(chuàng)傷的愈合會(huì)造成角膜敏感神經(jīng)及淚液產(chǎn)生減少，進(jìn)行白內(nèi)障超聲乳化術(shù)后，出現(xiàn)干眼癥并發(fā)癥的概率會(huì)增加[3]。也有人提出，糖尿病等內(nèi)分泌疾病誘發(fā)了自身免疫機(jī)制導(dǎo)致淚腺功能降低，從而影響淚液的分泌。有研究指出，在糖尿病患者體內(nèi)檢測(cè)出淚腺自身抗體，而對(duì)照組無淚腺自身抗體[4]。當(dāng)淚膜的質(zhì)量出現(xiàn)問題，就會(huì)誘發(fā)角膜結(jié)膜炎(又稱干眼癥)。淚膜覆蓋眼球表面，其本身又分為3層結(jié)構(gòu)，最外層是薄薄的一層油脂，是由Zeis氏腺和瞼板腺分泌；淚膜的第2層為水溶液層，主要由淚腺和第3眼瞼腺分泌；淚膜的第3層是黏液層，其主要成分是黏蛋白、免疫球蛋白、尿素、糖蛋白、鹽、葡萄糖、白細(xì)胞、細(xì)胞碎屑和酶[5]。對(duì)淚膜的評(píng)估分為量和質(zhì)兩部分，其中淚液分泌試驗(yàn)可以檢測(cè)淚液的數(shù)量，而淚膜破裂時(shí)間間接反映淚膜的質(zhì)量。本試驗(yàn)通過探討糖尿病性白內(nèi)障犬的淚膜變化，為臨床中客戶教育及積極地預(yù)防或治療性用藥提供指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 自2016年2月—2017年12月，從在中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)院就診的犬中隨機(jī)選取30例糖尿病性白內(nèi)障犬、30例非糖尿病性白內(nèi)障犬、30例非糖尿病非白內(nèi)障犬。所有犬都進(jìn)行詳細(xì)的病史調(diào)查、血常規(guī)、生化、尿檢等檢查。在篩選的糖尿病患犬中，僅選擇雙側(cè)眼均白內(nèi)障的病例作為研究對(duì)象。對(duì)于非糖尿病犬的選擇，要求其未見糖尿病臨床癥狀、血糖正常(3.5～5.5 mmol/L)、無尿糖且在體格檢查中未見其他系統(tǒng)性疾病。對(duì)于最近或反復(fù)發(fā)生眼部癥狀、有干燥性角膜結(jié)膜炎病史、具有其他系統(tǒng)性疾病或正在使用局部眼部用藥的犬均不在選擇范圍內(nèi)。

1.2 淚液測(cè)試(Schirmer tear test,STT) 使用同一批號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)淚液試紙條放于下結(jié)膜囊的同一位置，即靠近外眥近1/3處進(jìn)行測(cè)試，記錄每只眼的淚液數(shù)量，單位是mm/min。

1.3 淚糖濃度測(cè)試 淚糖測(cè)試使用尿液試紙條進(jìn)行半定量檢測(cè)，將葡萄糖試紙條接觸每只眼的內(nèi)眥淚液半月板部位后，立即拿開且靜候30 s，通過比色卡進(jìn)行判讀。

1.4 角膜熒光素染色(Fluorescein stain,FL) 將熒光素鈉均勻分布至角膜上皮，在裂隙燈下使用低亮度鈷藍(lán)光仔細(xì)觀察角膜上皮著色情況。對(duì)角膜進(jìn)行0～9分的評(píng)分，其中0分表示每個(gè)象限均沒有點(diǎn)狀著色，1分為染色少于15個(gè)點(diǎn)，2分為中等數(shù)量且大于15個(gè)著色點(diǎn)，3分表示重度角膜熒光素染色即角膜表面出現(xiàn)塊狀染色或絲狀染色。

1.5 淚膜破裂試驗(yàn)(Tear film break up times,TFBUTs) 使用洗眼液濕潤熒光素染色試紙條，然后點(diǎn)觸每只眼球背側(cè)球結(jié)膜1次并閉合眼瞼。當(dāng)眼瞼打開后開始計(jì)時(shí)，使用裂隙燈放大16倍在鈷藍(lán)光下觀察背外側(cè)角膜，當(dāng)出現(xiàn)第1個(gè)淚膜破裂點(diǎn)(干燥點(diǎn))時(shí)計(jì)時(shí)結(jié)束。

1.6 結(jié)膜細(xì)胞學(xué) 使用0.5%丙美卡因點(diǎn)眼局部麻醉，無菌棉簽于下結(jié)膜囊內(nèi)數(shù)次旋轉(zhuǎn)，然后將采樣拭子進(jìn)行4個(gè)載玻片涂片，通過過碘酸希夫(Periodic acid-schiff,PAS)染色進(jìn)行細(xì)胞學(xué)判讀。

1.7 結(jié)膜病理學(xué) 由于結(jié)膜活檢采樣需征得寵物主人的同意，且不配合的病例需要麻醉采樣，故無法對(duì)每個(gè)臨床病例都進(jìn)行結(jié)膜病理采樣。對(duì)7例糖尿病性白內(nèi)障犬進(jìn)行下結(jié)膜囊內(nèi)結(jié)膜活檢采樣，使用PAS染色評(píng)估杯狀細(xì)胞(Goblet cell,GC)，計(jì)數(shù)50個(gè)上皮細(xì)胞(Epithelial cell,EC)，在這50個(gè)上皮細(xì)胞中，計(jì)數(shù)其中杯狀細(xì)胞的數(shù)量(即GC∶50 EC)，重復(fù)計(jì)數(shù)2次，取GC∶ 50 EC的平均值。對(duì)4只非糖尿病性白內(nèi)障犬進(jìn)行結(jié)膜活組織采樣。選取非糖尿病非白內(nèi)障犬中無眼部疾病的安樂病例進(jìn)行結(jié)膜采樣，作為對(duì)照組。

1.8 數(shù)據(jù)處理 應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 20.0對(duì)測(cè)定的連續(xù)變量進(jìn)行平均數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差和組間方差分析，試驗(yàn)結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，對(duì)分類變量進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，P<0.05具顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 淚液測(cè)試 糖尿病性白內(nèi)障犬的平均STT值為(16.3±4.5) mm/min右眼(Oculus dexter,OD)、(14.5±5.8) mm/min左眼(Oculus sinister,OS)；非糖尿病非白內(nèi)障犬的平均STT值為(22.4±6.6) mm/min OD、(20.6±4.9) mm/min OS。糖尿病性白內(nèi)障犬的STT值明顯低于非糖尿病非白內(nèi)障犬的STT值(P<0.05)。非糖尿病性白內(nèi)障犬的STT值為(17.2±3.4) mm/min OD、(19.3±2.1)mm/min OS，與其他2個(gè)組無明顯差異(P>0.05)。

2.2 淚糖濃度測(cè)試 糖尿病性白內(nèi)障犬與非糖尿病犬的淚糖濃度未見明顯差異(P>0.05)，非糖尿病非白內(nèi)障犬和非糖尿病性白內(nèi)障犬淚糖濃度無明顯差異(P>0.05)。

2.3 犬角膜FL評(píng)分 角膜熒光素染色反映角膜受損的程度，本試驗(yàn)結(jié)果顯示，糖尿病性白內(nèi)障犬FL評(píng)分(4.2±2.6) s OD、(3.9±2.9) s OS，平均值明顯高于非糖尿病非白內(nèi)障犬(1.3±0.7) s OD、(2.2±0.9) s OS和非糖尿病性白內(nèi)障犬(3.3±1.2) s OD、(4.2±1.5) s OS。

2.4 淚膜破裂試驗(yàn) 糖尿病性白內(nèi)障犬TFBUTs平均值(7.2±3.8) s OD、(6.6±4.4) s OS，明顯低于非糖尿病非白內(nèi)障犬(19.0±5.2) s OD、(18.9±7.1) s OS和非糖尿病性白內(nèi)障犬(15.4±7.6) s OD、(14.2±7.3) s OS。非糖尿病非白內(nèi)障犬和非糖尿病性白內(nèi)障犬的TFBUTs之間無明顯差異(P>0.05)，每個(gè)組別中左、右眼無明顯差異(P>0.05)。

2.5 結(jié)膜細(xì)胞學(xué) 對(duì)4只非糖尿病非白內(nèi)障犬進(jìn)行結(jié)膜細(xì)胞學(xué)采樣，可見少量至中等數(shù)量的上皮細(xì)胞，包括鱗狀細(xì)胞、柱狀細(xì)胞、淺表上皮細(xì)胞，部分出現(xiàn)黑色素顆粒，而且非糖尿病非白內(nèi)障犬結(jié)膜樣本中都包含少量至中等程度的黏液。非糖尿病非白內(nèi)障犬的30份結(jié)膜細(xì)胞學(xué)樣本中的6份，均罕見中性粒細(xì)胞，僅1份樣本發(fā)現(xiàn)結(jié)膜杯狀細(xì)胞。糖尿病性白內(nèi)障犬和非糖尿病性白內(nèi)障犬的所有結(jié)膜樣本中均可見少量至大量的上皮細(xì)胞(鱗狀至柱狀細(xì)胞)，4只糖尿病性白內(nèi)障犬的6只眼睛和4只非糖尿病性白內(nèi)障的8只眼睛的結(jié)膜細(xì)胞學(xué)樣本，均可見少量中性粒細(xì)胞炎性浸潤，大部分結(jié)膜細(xì)胞學(xué)涂片樣本均有黏液，有6/30的糖尿病性白內(nèi)障犬(9只眼睛)和4/30非糖尿病性白內(nèi)障犬(6只眼睛)的結(jié)膜細(xì)胞學(xué)可見杯狀細(xì)胞。

2.6 結(jié)膜病理學(xué) 對(duì)照組犬的結(jié)膜病理學(xué)檢查可見GC∶50 EC為28∶50，可見基層至淺表均有上皮細(xì)胞的有序排列，于黏膜下層有少量單核細(xì)胞炎性浸潤。糖尿病性白內(nèi)障犬的結(jié)膜樣本可見黏膜下層有少量至中量的單核細(xì)胞或中性粒細(xì)胞浸潤，而非糖尿病性白內(nèi)障犬結(jié)膜黏膜下層的單核細(xì)胞浸潤情況與對(duì)照組類似，僅少量浸潤。5/7的糖尿病性白內(nèi)障犬結(jié)膜病理切片顯示不同程度的結(jié)膜上皮細(xì)胞發(fā)育不良，其中部分伴有鱗狀上皮化。7只糖尿病性白內(nèi)障犬的平均GC∶50 EC值是20∶50，但是GC∶50 EC比值跨度范圍較大，其中3只糖尿病性白內(nèi)障犬的GC∶50 EC平均值為27∶50，而另外4只糖尿病性白內(nèi)障犬的GC∶50 EC平均值為11.5∶50，表現(xiàn)杯狀細(xì)胞中等至重度減少。非糖尿病性白內(nèi)障犬的GC∶50 EC值(27∶50)與對(duì)照組非糖尿病非白內(nèi)障犬的GC∶50 EC值(28∶50)很接近。糖尿病性白內(nèi)障犬、非糖尿病性白內(nèi)障和非糖尿病非白內(nèi)障犬的GC∶50 EC平均值無明顯差異(P>0.05)。

3 討論

糖尿病對(duì)犬角膜結(jié)膜參數(shù)有很重要的影響作用，尤其是糖尿病性白內(nèi)障犬，相對(duì)于非糖尿病非白內(nèi)障犬，其淚膜成分已經(jīng)發(fā)生改變。淚膜中的水溶液層減少，糖尿病性白內(nèi)障犬的STT值明顯低于非糖尿病非白內(nèi)障犬，同理，在人醫(yī)中胰島素依賴型糖尿病患者的淚液量相對(duì)非糖尿病人降低了37%[6]。雖然本試驗(yàn)中，糖尿病性白內(nèi)障犬的STT值仍然大于10 mm/min，當(dāng)患犬經(jīng)歷過白內(nèi)障手術(shù)后，其淚液中水溶液的減少更容易表現(xiàn)出臨床癥狀。淚膜破裂試驗(yàn)可以作為評(píng)價(jià)淚膜質(zhì)量的推斷性指標(biāo)，糖尿病性白內(nèi)障犬的TFBUTs值明顯低于非糖尿病性白內(nèi)障犬和非糖尿病非白內(nèi)障犬，本試驗(yàn)中非糖尿病非白內(nèi)障組的平均TFBUTs(19.0 s OD、18.9 s OS)與前人研究報(bào)道的健康犬的TFBUTs值類似(19.7 s)[7]。在本試驗(yàn)中，糖尿病性白內(nèi)障犬的細(xì)胞學(xué)和病理學(xué)結(jié)果都顯示輕度至中等程度化膿性或淋巴漿細(xì)胞性結(jié)膜炎，同時(shí)顯示TFBUTs(7.2 s OD、6.6 s OS)，臨床表現(xiàn)僅有輕度至中等角膜結(jié)膜水腫，然而在非糖尿病性白內(nèi)障犬和非糖尿病非白內(nèi)障犬中沒有結(jié)膜炎的表現(xiàn)。

結(jié)膜上皮GC∶50 EC值的采樣部位是犬結(jié)膜囊，通過杯狀細(xì)胞數(shù)量間接反映黏蛋白的產(chǎn)生量，在人醫(yī)研究中有報(bào)道提出相對(duì)于黏蛋白數(shù)量，結(jié)膜杯狀細(xì)胞數(shù)量對(duì)早期的眼表疾病更具有指示意義，可以通過結(jié)膜細(xì)胞刷或細(xì)胞學(xué)壓片評(píng)估GC密度以及結(jié)膜的鱗狀上皮化程度[8]。根據(jù)目前的研究方法，只有結(jié)膜組織病理學(xué)可以同時(shí)反映結(jié)膜上皮細(xì)胞形態(tài)以及GCs數(shù)量。由于結(jié)膜組織樣本的采樣需要征求糖尿病性白內(nèi)障患犬或非糖尿病性白內(nèi)障患犬主人的同意，所以沒有辦法對(duì)每1個(gè)試驗(yàn)患犬進(jìn)行結(jié)膜樣本的采集。有文獻(xiàn)研究表明，糖尿病性白內(nèi)障犬結(jié)膜組織病理學(xué)表現(xiàn)出不同程度的結(jié)膜上皮發(fā)育不良，同時(shí)可能伴有上皮鱗狀化[9]。該試驗(yàn)結(jié)果與人醫(yī)對(duì)糖尿病患者的研究結(jié)果相符，人醫(yī)糖尿病性白內(nèi)障患者臨床表現(xiàn)可見明顯的結(jié)膜表面疾病，包括鱗狀上皮化等，其病因可能是因?yàn)榉瓷湫詼I液減少，導(dǎo)致淚膜營養(yǎng)功能改變或結(jié)膜上皮細(xì)胞的代謝異常[9]，該假設(shè)與本試驗(yàn)中糖尿病性白內(nèi)障犬的結(jié)膜化生病因類似。

小動(dòng)物臨床認(rèn)為糖尿病性神經(jīng)病變是公認(rèn)的糖尿病患病動(dòng)物的長期并發(fā)癥，比糖尿病性視網(wǎng)膜病變或糖尿病性腎病更常見，然而直到近幾年才將糖尿病患犬角膜敏感性降低列為糖尿病性神經(jīng)病變的表現(xiàn)，且有不同的理論闡述角膜敏感度降低的發(fā)病機(jī)理[10]。糖尿病性神經(jīng)病變理論主要包括多元醇代謝途徑發(fā)生改變?cè)斐缮窠?jīng)組織代謝失衡，血管系統(tǒng)發(fā)生變化造成神經(jīng)水腫，最終造成神經(jīng)傳導(dǎo)受損[11]。糖尿病性白內(nèi)障犬與非糖尿病性白內(nèi)障犬和非糖尿病非白內(nèi)障犬對(duì)比，其淚膜的數(shù)量和穩(wěn)定性下降，易發(fā)干眼癥。糖尿病性白內(nèi)障犬的角膜結(jié)膜形態(tài)發(fā)生改變，常規(guī)熒光素染色可以作為早期診斷手段。綜上所述，建議治療方法包括補(bǔ)充局部人工淚液、局部使用淚液刺激劑和黏蛋白類似物，例如糖尿病患犬可增加環(huán)孢素眼藥等。