金遠(yuǎn)銘 崔蓮花，2 嚴(yán)昌國(guó)，2*

(1.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)系，延吉 133002；2.東北寒區(qū)肉?？萍紕?chuàng)新教育部工程研究中心，延吉 133002)

犢牛腹瀉嚴(yán)重影響著犢牛的成活率，給養(yǎng)牛業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。如何治療犢牛腹瀉已成為當(dāng)今世界性的難題。為了控制胃腸道感染疾病發(fā)生率，許多治療方法都集中在使用抗生素上，然而，抗生素的不規(guī)范使用，造成抗生素耐藥菌的出現(xiàn)，產(chǎn)生環(huán)境以及動(dòng)物源性食品污染[1]。我國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布194號(hào)公告，為維護(hù)我國(guó)動(dòng)物源性食品安全和公共衛(wèi)生安全，決定停止生產(chǎn)、進(jìn)口、經(jīng)營(yíng)、使用部分藥物飼料添加劑[2]。因此，尋找新的治療犢牛腹瀉的方法來替代抗生素的使用，成為犢牛疾病預(yù)防與治療的研究重點(diǎn)。

益生菌(probiotics)和多糖納米粒子(polysaccharide nanoparticles)在抑制病原菌方面都具有良好的作用效果。益生菌作為最常用的微生態(tài)制劑，其產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)(如乳酸和抗菌肽)和酶能夠抑制病原菌的生存，調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，并增強(qiáng)營(yíng)養(yǎng)吸收[3-4]。同樣，幾類具有抗菌活性的多糖納米粒子已被證明在體外模型和動(dòng)物模型中治療感染性疾病(包括抗生素耐藥性疾病)的有效性[5]。研究表明，菊粉、淀粉等多糖自組裝納米粒子(polysaccharide self-assembled nanoparticles)可以內(nèi)化到益生菌體內(nèi)，使其釋放大量的抗菌肽，并在小鼠腹瀉模型中起到了益生元的作用[6-10]。由于該研究仍處于早期階段，將其作為新型益生元應(yīng)用于犢牛腹瀉的治療中需要更進(jìn)一步研究與驗(yàn)證。本文對(duì)犢牛腹瀉的原因、多糖自組裝納米粒子及其與益生菌協(xié)同作用進(jìn)行了綜述，分析了其在防治犢牛腹瀉的實(shí)際應(yīng)用中的可行性。

1 犢牛腹瀉的原因

犢牛的腸道微生物菌群是一個(gè)復(fù)雜的微生物群落，在機(jī)體營(yíng)養(yǎng)和健康方面發(fā)揮著重要作用。胃腸道健康可以定義為在不斷變化的胃腸道生態(tài)系統(tǒng)中保持平衡的能力[11]。犢牛腹瀉主要分為功能性腹瀉、滲透性腹瀉和細(xì)菌病毒性腹瀉。功能性腹瀉是由于初生犢牛腦部神經(jīng)發(fā)育尚未完全，生物訊號(hào)傳遞體系不完整，胃腸道處于發(fā)育初期，菌群結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單不健全引起的。滲透性腹瀉是由于初生犢牛的消化機(jī)能尚未成熟，對(duì)一些滲透性的食物消化不完全，增加了腸道黏膜的滲透壓，導(dǎo)致腸道壁的通透性增加，使得蛋白質(zhì)和血液滲出而引起的。細(xì)菌病毒性腹瀉是由于初生犢牛機(jī)體抵抗力較弱，受到致病菌的侵襲，定植在腸道并大量繁殖，其產(chǎn)生的毒素致使大腸無法吸收小腸的多余的水分，從而導(dǎo)致腹瀉[12]。

由于集約化飼養(yǎng)模式，初生犢牛母子分離、代乳粉喂養(yǎng)、初乳攝入不足、環(huán)境應(yīng)激以及使用抗生素等，這些因素改變了腸道生態(tài)系統(tǒng)的平衡[13]。因此，早期斷奶的犢牛獲得天然益生微生物的可能性大大降低，致病菌更容易定植腸道，沙門氏菌(Salmonella)和大腸桿菌(Escherichiacoli)是初生犢牛最易感染的致病菌[14-15]。牧場(chǎng)存在的環(huán)境衛(wèi)生問題，導(dǎo)致沙門氏菌等致病菌的分離頻率不斷增加，更有利于致病菌的擴(kuò)散[16]。沙門氏菌通過入侵腸道并附著在腸黏膜淋巴結(jié)中，使機(jī)體免疫系統(tǒng)無法識(shí)別，導(dǎo)致犢牛腹瀉[17]。研究人員在動(dòng)物機(jī)體的巨噬細(xì)胞、扁桃體等組織內(nèi)均發(fā)現(xiàn)了沙門氏菌，并且沙門氏菌會(huì)跟隨免疫系統(tǒng)到達(dá)全身各處，引發(fā)疾病[18]。沙門氏菌的致病性主要與染色體上成簇分布的編碼致病相關(guān)基因的特定區(qū)域——致病島(Salmonellapathogenicity island，SPI)相關(guān)，SPI-1和SPI-5是誘發(fā)犢牛腹瀉的重要因素，感染沙門氏菌的犢牛腹瀉呈水樣，并且具有傳染性[19]。大腸桿菌根據(jù)不同的致病機(jī)理，分為6個(gè)不同的致病群，腸毒性大腸桿菌(enterotoxigenicEscherichiacoli，ETEC)菌株是犢牛腹瀉的重要的致病因素[20]。研究表明，4日齡的初生犢牛對(duì)ETEC致病菌高度敏感，其通過定植在犢牛腸絨毛上皮內(nèi)，釋放毒素，造成進(jìn)入腸黏膜細(xì)胞的氯化鈉含量上調(diào)，使得滲透壓升高，導(dǎo)致犢牛發(fā)生腹瀉[21]。

許多種類的抗菌劑被應(yīng)用于犢牛腹瀉治療中。目前，大多數(shù)抗菌劑是化學(xué)修飾的抗生素類藥物，這些藥物可以分為殺菌(殺死致病菌)或抑菌(抑制致病菌生長(zhǎng))2種。隨著其廣泛使用和濫用，細(xì)菌對(duì)抗生素類藥物產(chǎn)生耐藥性已成為一種普遍現(xiàn)象。耐藥性通?；谶M(jìn)化過程，例如長(zhǎng)時(shí)間使用抗生素治療，導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生可遺傳的耐藥性[22-23]。因此，研發(fā)出新型的防治犢牛腹瀉疾病的抗生素替代品成為了重要研究課題。

2 作為活性抗菌劑的多糖自組裝納米粒子

2.1 多糖自組裝納米粒子

納米技術(shù)為提高抗菌效率提供了新的手段[24]。尤其是納米材料和納米粒子，已經(jīng)證明具有廣譜抗革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌、分枝桿菌、病毒、真菌、噬菌體、原生動(dòng)物和藻類的抗菌活性[25-27]。多糖是一類由多個(gè)單糖單元組成的天然聚合碳水化合物，它通過糖苷鍵結(jié)合在一起并形成大的聚合物，是一種純天然可再生資源，具備無毒、無抗原性、生物相容性、生物適應(yīng)性和生物可降解性[28-30]。自組裝是利用疏水效應(yīng)驅(qū)動(dòng)分子自發(fā)進(jìn)行無序到有序的轉(zhuǎn)變，多糖自組裝納米粒子是在相應(yīng)的溶劑中發(fā)生自組裝反應(yīng)形成的納米粒子，其含有疏水性內(nèi)核，同時(shí)包有親水性外殼。親水性嵌段和疏水性嵌段的比例決定自組裝納米粒子的形態(tài)和大小[31]。Cui等[6]和Kim等[7]研究表明，鄰苯二甲酸酐的疏水基團(tuán)可以結(jié)合到水溶性聚合物(菊粉)中，通過鄰苯二甲酸酐的疏水相互作用形成菊粉納米粒子。Kim等[8]通過葡聚糖中的羥基和鄰苯二甲酸酸酐的羧基進(jìn)行酯鍵反應(yīng)，制成葡聚糖納米粒子。同樣，Hong等[9]研究表明，淀粉中的羥基與鄰苯二甲酸酐的羧基結(jié)合后，通過透析過程中的疏水相互作用，制備了淀粉納米粒子，并且疏水相互作用越強(qiáng)，納米粒子中的鄰苯二甲酸基團(tuán)越多，形成的納米粒子尺寸越小。由疏水性內(nèi)核和親水性外殼組成的納米粒子是被廣泛應(yīng)用于抗菌的納米結(jié)構(gòu)類型之一，因?yàn)樗鼈兛梢员徊溉閯?dòng)物細(xì)胞快速吸收[32]。近年來，基于多糖的生物功能性和識(shí)別作用，許多研究者已經(jīng)開始合成和應(yīng)用基于天然多糖自組裝納米粒子的藥物傳遞系統(tǒng)[33-34]，可以說，通過多糖自組裝形成的納米粒子已經(jīng)被探索用作新型抗菌劑的可能性。

2.2 多糖自組裝納米粒子與益生菌的內(nèi)化效應(yīng)

益生菌作為抗生素替代品的研究不斷加深，益生菌通常被認(rèn)為是安全無毒的，可以給宿主帶來健康益處[35-36]。這些益生菌產(chǎn)生抗菌分子(如乳酸和抗菌肽)和酶，使它們能夠抑制致病菌在腸道的定植，調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，并增強(qiáng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收[3-4]。因此，包括生物、物理和化學(xué)方法在內(nèi)的多種方案被用來增強(qiáng)益生菌的生物活性，特別是通過產(chǎn)生具有抗菌作用的抗菌肽來增強(qiáng)抗菌活性[37-38]。

近年來，研究人員通過自組裝的方法合成了多糖自組裝納米粒子，并將其作為新型益生元與益生菌組成合生元，在二者共培養(yǎng)的過程中發(fā)生了納米粒子內(nèi)化到益生菌體內(nèi)的現(xiàn)象[6-10]。早前已有研究表明，金屬納米粒子可通過靜電相互作用內(nèi)化到致病菌體內(nèi)，與細(xì)菌膜的離子相互作用來抑制致病菌生長(zhǎng)[39]。然而，金屬納米粒子會(huì)在宿主體內(nèi)造成嚴(yán)重的副作用，并能抑制機(jī)體的有益微生物生長(zhǎng)[40]。研究人員針對(duì)多糖自組裝納米粒子這一內(nèi)化現(xiàn)象進(jìn)行了研究，Kim等[8]使用異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)標(biāo)記葡聚糖納米粒子，觀察其在不同條件下的內(nèi)化現(xiàn)象，研究發(fā)現(xiàn)，納米粒子在益生菌體內(nèi)的內(nèi)化程度與納米粒子的粒徑大小有關(guān)，并隨著共培養(yǎng)時(shí)間增長(zhǎng)和溫度的升高而增加。同時(shí)，通過使用葡萄糖、半乳糖和果糖來驗(yàn)證多糖自組裝納米粒子的內(nèi)化過程是否需要轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的參與，結(jié)果顯示任何一種處理都不影響益生菌對(duì)葡聚糖納米粒子的攝取，說明葡聚糖納米粒子是通過被動(dòng)擴(kuò)散進(jìn)入益生菌體內(nèi)。Hong等[9-10]分別對(duì)淀粉納米粒子和普魯蘭多糖納米粒子進(jìn)行了內(nèi)化機(jī)制研究，研究發(fā)現(xiàn)淀粉納米粒子根據(jù)尺寸大小、能量以及反應(yīng)時(shí)間，通過葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白內(nèi)化到益生菌體內(nèi)，并顯著增強(qiáng)了益生菌對(duì)革蘭氏陰性大腸桿菌和革蘭氏陽性單核細(xì)胞增生李斯特菌的抑制作用，說明納米粒子的內(nèi)化提高了益生菌的抗菌性能，并對(duì)益生菌沒有抑制作用。同時(shí)，普魯蘭多糖納米粒子依賴能量和半乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)體內(nèi)化到植物乳桿菌體內(nèi)。由于多糖自組裝納米粒子內(nèi)化現(xiàn)象尚處于早期階段，更多的內(nèi)化機(jī)制還需要進(jìn)一步探索。

2.3 多糖自組裝納米粒子提高抗菌肽的產(chǎn)量

抗菌肽在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域以及其他科學(xué)領(lǐng)域具有潛在的用途。益生菌分泌的抗菌肽對(duì)革蘭氏陽性菌(包括致病性食物細(xì)菌如單核細(xì)胞增生李斯特菌、金黃色葡萄球菌和一些芽孢桿菌)具有良好的抗菌活性，但是其生產(chǎn)工藝和成本仍然是許多研究人員關(guān)注的問題[41]。

為了增加抗菌肽的產(chǎn)量，以下2種方法的使用較為廣泛。一種是工業(yè)發(fā)酵系統(tǒng)，利用全脂牛奶或脫脂奶培養(yǎng)益生菌用于工業(yè)生產(chǎn)抗菌肽。然而，這種方法在摸索最佳生產(chǎn)條件方面存在困難，包括酸堿度、溫度、底物、通氣、壓力和培養(yǎng)期等。另一種方法是構(gòu)建生產(chǎn)菌株，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)產(chǎn)生更高產(chǎn)量的抗菌肽[42]。然而，人們對(duì)監(jiān)管問題和消費(fèi)者對(duì)轉(zhuǎn)基因生物的接受程度感到擔(dān)憂，盡管目前正在開發(fā)非轉(zhuǎn)基因替代方法來提高本地菌株的適應(yīng)能力[43]。

近年來，研究發(fā)現(xiàn)了一種通過益生菌生產(chǎn)抗菌肽的新方法[6-10]。Cui等[6]和Kim等[7]把菊粉納米粒子作為益生元內(nèi)化入乳酸片球菌體內(nèi)，并將內(nèi)載菊粉納米的乳酸片球菌與致病菌共培養(yǎng)，相比乳酸片球菌-菊粉合生元，內(nèi)載菊粉納米粒子的乳酸片球菌具有更好的抑菌效果。通過對(duì)共培養(yǎng)上清液的分離純化，驗(yàn)證了其分泌了大量的抗菌肽，并且遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于乳酸片球菌-菊粉合生元的分泌量。Hong等[10]對(duì)這一現(xiàn)象進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，淀粉納米粒子在內(nèi)化反應(yīng)過程中導(dǎo)致益生菌的輕度應(yīng)激，致使熱休克蛋白如DnaK、DnaJ和GroES表達(dá)量顯著提高，通過防御機(jī)制刺激益生菌分泌抗菌肽，使得抗菌肽的產(chǎn)量增加。因此，多糖自組裝納米粒子內(nèi)化到益生菌體內(nèi)不僅為生產(chǎn)抗菌肽提供了新的途徑，也為開發(fā)新型的抗生素替代品提供了良好思路。

3 多糖自組裝納米粒子在治療犢牛腹瀉中的可行性

在集約化牛生產(chǎn)系統(tǒng)中，微生態(tài)制劑以其良好的抑菌特性已廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè)生產(chǎn)中。有許多研究表明益生菌和益生元制劑對(duì)犢牛免疫力有顯著改善作用。Mokhber-Dezfouli等[44]研究表明，犢牛被飼喂由乳桿菌、雙歧桿菌、屎腸球菌、嗜熱鏈球菌組成的益生菌飼料添加劑后，表現(xiàn)出更好的抗菌能力，腹瀉發(fā)生率明顯減少。Heinrichs等[45]對(duì)益生元在犢牛飼糧中的應(yīng)用進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，在飼喂含有益生元飼糧的犢牛糞便中檢測(cè)出了最佳的菌群結(jié)構(gòu)。同樣，Roodposhti等[46]研究了益生菌和益生元對(duì)犢牛生長(zhǎng)性能、糞便中大腸桿菌和血液中免疫球蛋白含量的影響，結(jié)果表明，在牛奶中添加合生元促進(jìn)了犢牛平均日增重的提高，糞便中致病性大腸桿菌數(shù)量減少了5%。目前，將多糖自組裝納米粒子內(nèi)化到益生菌體內(nèi)已成為一種新的、有發(fā)展?jié)摿Φ目咕纳a(chǎn)方法，但是否可將其作為新型益生元應(yīng)用于犢牛實(shí)際疾病預(yù)防與治療中成為亟待解決的研究課題。

由于小鼠具有正常的腸道菌群結(jié)構(gòu)，小鼠模型被用來模擬人類腸道微環(huán)境。Kim等[8]將葡聚糖納米粒子內(nèi)化入乳酸片球菌體內(nèi)后，將其應(yīng)用于動(dòng)物模型中，研究其是否可以對(duì)動(dòng)物腸道致病菌產(chǎn)生抗菌活性，并調(diào)節(jié)動(dòng)物腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)；在使用致病菌攻毒之前，對(duì)小鼠進(jìn)行為期7 d的含有或不含有葡聚糖納米粒子的乳酸片球菌預(yù)給藥，結(jié)果顯示，給小鼠喂食含有葡聚糖納米粒子的乳酸片球菌相對(duì)單獨(dú)飼喂乳酸片球菌具有更明顯的抑菌效果，并對(duì)小鼠腸道菌群產(chǎn)生了有益影響。由于致病性大腸桿菌會(huì)引發(fā)腸道炎癥并破壞正常的腸道菌群結(jié)構(gòu)，通過對(duì)小鼠糞便組成的分析，發(fā)現(xiàn)飼喂內(nèi)載葡聚糖納米粒子乳酸片球菌的操作分類單元(operational taxonomic units，OTUs)數(shù)量在所有組中是最高的，這表明使用葡聚糖納米粒子提升了益生菌抗菌活性并且可以防止腸道微生物菌群多樣性的減少。許多研究人員認(rèn)為腸道微生物群多樣性的豐富程度代表著腸道的健康狀況[47-49]。內(nèi)載葡聚糖納米粒子乳酸片球菌抗菌活性的增強(qiáng)有助于降低小鼠體內(nèi)的致病菌負(fù)荷。同時(shí)，試驗(yàn)結(jié)束后乳酸片球菌和乳酸桿菌的菌落數(shù)沒有減少，并且增加了雙歧桿菌的數(shù)量?；谝嫔獙?duì)雙歧桿菌生長(zhǎng)的影響，說明葡聚糖納米粒子在腸道中起到益生元的作用。

通過小鼠模型的構(gòu)建，證實(shí)了多糖自組裝納米粒子可以以益生元的形式與益生菌協(xié)同作用，抑制致病菌，改善小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)，并且不會(huì)對(duì)益生菌菌群產(chǎn)生不良影響。如果將多糖自組裝納米粒子作為新型益生元應(yīng)用于犢牛體內(nèi)試驗(yàn)，并對(duì)預(yù)防和治療犢牛腹瀉有改善作用，將有利于犢牛的疾病防治與動(dòng)物生產(chǎn)性能的提升。

4 小結(jié)與展望

犢牛腹瀉己成為制約我國(guó)養(yǎng)牛業(yè)發(fā)展的主要疾病，隨著集約化養(yǎng)殖的不斷發(fā)展，給我國(guó)畜牧養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的挑戰(zhàn)。微生態(tài)制劑的應(yīng)用有效避免了抗生素長(zhǎng)期使用產(chǎn)生的細(xì)菌耐藥性和抗藥性等毒副作用。隨著學(xué)科交叉融合的科研理念日益加深，多學(xué)科相互融合將帶動(dòng)科學(xué)發(fā)展與進(jìn)步，將材料學(xué)、醫(yī)藥學(xué)等學(xué)科領(lǐng)域最前沿技術(shù)應(yīng)用于畜牧學(xué)科，用最前沿的科學(xué)技術(shù)解決畜牧業(yè)亟需解決的重點(diǎn)與難點(diǎn)，是非常高效的科學(xué)方案。多糖自組裝納米粒子已經(jīng)廣泛應(yīng)用生物學(xué)醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域，但在畜牧學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用尚屬初步研究階段，若將多糖自組裝納米粒子作為益生元與益生菌相結(jié)合，研制成新型合生元，并應(yīng)用于畜牧業(yè)的實(shí)際生產(chǎn)實(shí)踐中，解決犢牛腹瀉的實(shí)際問題，將是一項(xiàng)可喜的研究成果。