朱偉豪，鄭哲，孫凱，楊夢姿，錢茂升，莫耀南

1.河南科技大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，河南 洛陽471003；2.重慶醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)系，重慶400016

死亡時間（postmortem interval，PMI）研究已有幾百年的歷史，但PMI 推斷的準(zhǔn)確性并沒有顯著提高，實踐中仍缺乏一種簡便、客觀、準(zhǔn)確的推斷方法[1-2]。此外，隨著晚期PMI 區(qū)間的增大，推斷誤差也隨之增大，造成晚期PMI 推斷更加困難[3]。近年來，利用動物或人體尸體腐敗過程中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物含量變化來推斷PMI 成為法醫(yī)學(xué)中的新興領(lǐng)域，這種死后生物化學(xué)變化具有明顯時序性規(guī)律[3-4]。

機體生前通過腺苷酸［三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP），二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP），一磷酸腺苷（adenosine monophosphate，AMP）］激酶反應(yīng)（2ADP?ATP+AMP），保持著細胞內(nèi)總腺苷酸（total adenine nucleotide，TAN）（由ATP、ADP、AMP組成）處于相對穩(wěn)定平衡的狀態(tài)。死后組織間供氧停止，伴隨糖原酵解的停止及磷酸肌酸的耗盡，TAN 的相對穩(wěn)定平衡狀態(tài)也被打破。同一時間內(nèi)，ATP 在三磷酸腺苷酶的作用下逐漸降解為ADP，在肌激酶的作用下，進一步分解成AMP。AMP 又在腺苷酸脫氨酶、磷酸單酯酶及核苷水解酶等酶的作用下逐漸降解為肌苷、次黃嘌呤及核糖等物質(zhì)[5-6]，該過程中各代謝物含量呈現(xiàn)出明顯的時序性變化規(guī)律[7-10]。同時，前期研究結(jié)果[7-8，11-12]也證明，死后血液組織內(nèi)ATP、ADP 或AMP 含量變化規(guī)律可用于PMI 推斷，但這些研究僅單一闡述不同時間內(nèi)（多局限于72 h 內(nèi)）各嘌呤腺苷酸的含量變化，并未對整體嘌呤腺苷酸系統(tǒng)的含量和能量狀態(tài)進行探究。腺苷酸能荷（adenylic-acid energy charge，AEC）是細胞中能量合成反應(yīng)和利用反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因素，代表腺苷酸系統(tǒng)的能量狀態(tài)，在死后一段時間內(nèi)，呈現(xiàn)出規(guī)律性變化[13]。因此，本研究旨在進一步探究大鼠死亡晚期后腿肌肉TAN 和AEC 的時序性變化，從而為法醫(yī)學(xué)PMI推斷提供一定的研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

Agilent 1100 高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；ZORBAX SB-Aq 色譜柱（美國Agilent 公司）；紫外檢測器（美國Agilent 公司）；TDZ5-WS 臺式低速自動平衡離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）；JJ-2 組織搗碎機（江蘇省金壇市宏華儀器廠）；FE28-Bio pH 計［梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司］；GE2005-5 電子天平（上海佑科儀器儀表有限公司）；Milli-Q 超純水機（美國Millipore 公司）；5-腺苷三磷酸二鈉鹽標(biāo)準(zhǔn)品（5’-ATP-Na2）、5-腺苷二磷酸二鈉鹽標(biāo)準(zhǔn)品（5’-ADP-Na2）、5-腺苷一磷酸二鈉鹽標(biāo)準(zhǔn)品（5’-AMP-Na2）（高效液相色譜級≥98%，上海源葉生物科技有限公司）；甲醇（色譜純）；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、高氯酸、氫氧化鈉（國產(chǎn)分析純）。

1.2 動物分組、處理與保存

健康SD 雄性大鼠40 只（由河南科技大學(xué)動物實驗中心提供并通過動物倫理委員會批準(zhǔn)），體質(zhì)量（250±20）g，隨機分成8 組，每組5 只，在同一時間采用頸椎脫臼處死，保存在20 ℃恒溫環(huán)境中。分別于死后0、24、48、72、96、120、144、168 h 提取1 組大鼠雙后肢肌肉用于制備上樣液。

1.3 加標(biāo)回收率的驗證

取死后48 h 大鼠骨骼肌上樣液4 份，每份50 μL，分別加入超純水，ATP、ADP 和AMP 標(biāo)準(zhǔn)液（3 種物質(zhì)質(zhì)量濃度均為100 μg/mL）各50 μL。對溶液進行液相色譜分析，每份樣品平行測定5 次。以加超純水組內(nèi)3 種物質(zhì)濃度為加標(biāo)前的濃度，依據(jù)加標(biāo)前后3 種物質(zhì)濃度變化與加標(biāo)量的百分比，計算加標(biāo)回收率。

1.4 雙后肢肌肉上樣液制備與測定

參照王述柏[14]的ATP 相關(guān)代謝產(chǎn)物的測定方法。準(zhǔn)確稱量大鼠雙后肢肌肉5 g 移入組織勻漿機內(nèi)，加入預(yù)冷的5%高氯酸溶液25 mL，高速（10 000 r/min）勻漿3 min，pH 值調(diào)為7.0 左右，加預(yù)冷的去離子水定容至50 mL 后，經(jīng)3 層紗布過濾，濾液以離心半徑6 cm，4 500 r/min，離心10 min，上清液再經(jīng)孔徑為0.22 μm的針式濾膜濾過后，完成上樣液的制備，待高效液相色譜儀（high performance liquid chromatography，HPLC）測定。

色譜條件：ZORBAX SB-Aq 色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），柱溫35 ℃，流速0.8 mL/min，進樣體積8 μL。紫外檢測器，波長為254 nm，流動相為0.05 mol/L 磷酸緩沖液（V磷酸氫二鈉∶V磷酸二氫鈉=49∶51）和甲醇以95∶5（體積比）混合，等度洗脫。

1.5 數(shù)據(jù)處理及分析

TAN 和AEC 的計算遵循以下公式[13]：

數(shù)據(jù)經(jīng)OriginPro 2019b 軟件（美國OriginLab 公司）整理分析，結(jié)果以表示。以PMI 為自變量，分別以ATP、ADP、AMP、TAN 和AEC 為因變量進行單因素ANOVA 分析和重復(fù)測量方差分析，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。再以PMI 為因變量（y），ATP、ADP、AMP、TAN和AEC 為自變量（x），分別建立一次、二次、三次回歸方程，以決定系數(shù)R2值最高者為最佳擬合方程，擬合關(guān)系評價標(biāo)準(zhǔn)以R2≥0.8 為佳，R2＜0.8 為不佳。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠雙后肢肌肉的加標(biāo)回收率

大鼠雙后肢肌肉中ATP、ADP 和AMP 的加標(biāo)回收率分別為92.596%、96.872%、91.661%。

2.2 大鼠死后雙后肢肌肉中ATP、ADP、AMP、TAN、AEC與PMI的關(guān)系

大鼠死后雙后肢肌肉中ATP、ADP、AMP、TAN 和AEC 的變化結(jié)果如表1 所示，大鼠死后168 h 內(nèi)，雙后肢肌肉內(nèi)ATP、ADP、AMP、TAN 和AEC 隨PMI 的變化各不相同。在死后不同時間內(nèi)，ATP、ADP 含量差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），AMP、TAN 和AEC 差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。重復(fù)測量方差分析結(jié)果（表1）顯示，AMP 的72、96 h 組和AEC 的48、72、96、120 h 組與其上組數(shù)據(jù)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

從擬合的回歸方程（表2）可見，大鼠死后雙后肢肌肉內(nèi)ATP、ADP、AMP、TAN 與PMI 擬合關(guān)系不佳（R2為0.198～0.754）；AEC 隨PMI 呈現(xiàn)出逐漸下降的變化規(guī)律，R2為0.903，曲線擬合關(guān)系較好。

表1 大鼠死后雙后肢肌肉中ATP、ADP、AMP、TAN及AEC變化Tab. 1 Changes of ATP，ADP，AMP，TAN，and AEC in the both hind limbs muscles of rats after death（n=5，）

表1 大鼠死后雙后肢肌肉中ATP、ADP、AMP、TAN及AEC變化Tab. 1 Changes of ATP，ADP，AMP，TAN，and AEC in the both hind limbs muscles of rats after death（n=5，）

注：1）單因素ANOVA分析，P＜0.05；2）與相鄰上組相比，P＜0.05?！?”表示該物質(zhì)含量低于檢測范圍。PMI表示死亡時間；ATP表示三磷酸腺苷；ADP表示二磷酸腺苷；AMP表示一磷酸腺苷；TAN表示總腺苷酸；AEC表示腺苷酸能荷。

PMI/h 0 24 48 72 96 120 144 168 ATP/（μg·g-1）30.419±17.685 40.584±30.028 49.262±23.312 32.929±14.875 20.104±14.046---ADP/（μg·g-1）168.520±15.953 155.295±37.016 153.840±30.992 165.160±17.690 193.600±32.975 221.882±51.465 226.000±80.087 180.721±47.444 AMP1）/（μg·g-1）13.088±1.729 40.594±9.206 54.300±16.142 120.013±29.6152）285.802±129.5492）322.330±103.434 397.746±113.638 387.117±135.965 TAN1）/（μg·g-1）212.027±31.910 236.472±16.405 257.403±38.017 318.103±37.915 495.486±148.910 544.212±145.310 623.746±183.752 567.837±165.761 AEC1）0.538±0.040 0.498±0.046 0.488±0.0182）0.367±0.0612）0.244±0.0742）0.207±0.0292）0.179±0.025 0.163±0.042

表2 大鼠雙后肢肌肉中ATP、ADP、AMP、TAN、AEC與PMI擬合方程Tab. 2 Fitting equations of ATP，ADP，AMP，TAN，AEC and PMI in the both hind limbs muscles of rats

3 討 論

1968 年，ATKINSON 教授首次提出“腺苷酸能荷”的概念，用于代表嘌呤腺苷酸系統(tǒng)的能量狀態(tài)。理論上AEC 值在0～1，如細胞內(nèi)嘌呤腺苷酸組成均為ATP，則能荷為1；均是ADP，能荷為0.5；均是AMP，則能荷為0。機體一般通過正負反饋調(diào)節(jié)，使活細胞的AEC穩(wěn)定在0.75～0.95[13]。本研究以TAN 和AEC 為指標(biāo)，探索大鼠死后雙后肢肌肉內(nèi)TAN 和能量狀態(tài)的時序性變化規(guī)律。結(jié)果顯示，死后48 h 內(nèi)，ATP 和AMP 與ADP呈現(xiàn)出相反的變化趨勢。大鼠死后組織內(nèi)殘余酶持續(xù)催化嘌呤腺苷酸激酶反應(yīng)，通過調(diào)節(jié)，保持細胞內(nèi)TAN 相對穩(wěn)定平衡，這與相關(guān)文獻的研究結(jié)果[6，15]一致。48～96h內(nèi)，AMP含量增加，可能是由于隨著TAN平衡狀態(tài)的打破，ATP 的降解速率增快，在三磷酸腺苷酶的作用下逐漸降解為ADP，由于底物ADP 的增加，進一步促進了AMP 的增加[6]。96 h 后，ATP 消耗殆盡，ADP 的合成速率減慢，并于144 h 后開始減少。由于ADP 含量較高，AMP 含量持續(xù)增加，導(dǎo)致大鼠死后168 h 內(nèi)，AEC 數(shù)值持續(xù)逐漸減小。結(jié)果表明，大鼠死后雙后肢肌肉的嘌呤腺苷酸系統(tǒng)能量狀態(tài)逐漸下降。大鼠死后雙后肢肌肉內(nèi)TAN 變化趨勢與AMP 相似，死后144 h 內(nèi)持續(xù)增加，可能因為前期不斷有外源性核苷酸補充嘌呤腺苷酸系統(tǒng)[16]。144 h 后，外源性核苷酸補充停止，TAN 降解速率增快，導(dǎo)致其含量開始下降。單因素ANOVA 分析發(fā)現(xiàn)，大鼠在不同PMI 內(nèi)，ATP、ADP 含量差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，但AMP、TAN 和AEC 差異有統(tǒng)計學(xué)意義。擬合方程顯示，大鼠死后雙后肢肌肉內(nèi)ATP、ADP、AMP、TAN 與PMI 擬合關(guān)系不佳（R2為0.198～0.754）；AEC 隨PMI 變化規(guī)律明顯，決定系數(shù)較高（R2為0.903），曲線擬合關(guān)系較好。

本研究初步探究了大鼠死后雙后肢肌肉內(nèi)ATP、ADP、AMP、TAN 和AEC 隨PMI 的變化規(guī)律，為法醫(yī)學(xué)PMI 的推斷提供了新的研究思路。另外，隨著電化學(xué)生物傳感器技術(shù)的不斷發(fā)展，無需再使用HPLC 等大型實驗室儀器分離，即可輕松測定各類嘌呤腺苷酸[17-19]，使TAN 及AEC 測定更適用于法醫(yī)學(xué)實踐。由于死后腐敗過程受各類因素的影響，聯(lián)合多因素推斷PMI，以及開發(fā)簡便高效測定嘌呤腺苷酸含量及能荷的電化學(xué)生物傳感器是下一步的研究方向。