白坤宏 向婷 趙敏越 卜雯卿 程政 王菲

[關(guān)鍵詞]炎癥環(huán)境;振動(dòng);牙周膜干細(xì)胞;成骨分化;牙周病;蛋白水平

牙周病是我國(guó)發(fā)病率最高的口腔慢性疾病之一，長(zhǎng)期的牙周病可以造成牙周支持組織的損傷、缺失，包括牙齦紅腫出血、牙齦退縮、牙槽骨吸收等，最終導(dǎo)致牙齒松動(dòng)、脫落[1]。牙周支持組織的自身修復(fù)能力較弱，并且持續(xù)處于炎癥微環(huán)境之中，使得喪失的牙周支持組織難以再生。牙周組織工程技術(shù)為牙周缺損開(kāi)辟了新的治療途徑。牙周膜干細(xì)胞（Periodontal ligament stem cells，PDLSCs）相較其他干細(xì)胞表現(xiàn)出更強(qiáng)的牙槽骨、牙周韌帶重建能力，被認(rèn)為是最理想的牙周組織工程種子細(xì)胞[2]。

低強(qiáng)度高頻振動(dòng)（Low magnitude high frequencyvibration，LMHFV）是一種新穎的機(jī)械力學(xué)輔助療法，以其非藥物性、非侵入性的優(yōu)勢(shì)，被應(yīng)用于肥胖、骨質(zhì)疏松、肌肉疲勞、骨折等疾病的臨床研究與康復(fù)治療之中，并且取得了不錯(cuò)的效果[ 3 - 5 ];在干細(xì)胞研究領(lǐng)域也有學(xué)者證實(shí)LMHFV對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone m a r r o wmesenchymal stem cells，BMSCs）、PDLSCs的增殖、分化有相應(yīng)的作用[6-7]。目前尚無(wú)LMHFV在炎性條件下對(duì)PDLSCs成骨性能影響的相關(guān)報(bào)道，所以本課題組就LMHFV在炎性條件下對(duì)PDLSCs成骨分化能力的作用展開(kāi)探索，為今后將LMHFV應(yīng)用于牙周組織工程技術(shù)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料：αMEM培養(yǎng)基（Hyclone，美國(guó)）;胎牛血清（Gibco，美國(guó)）;Ⅰ型膠原酶、中性蛋白酶、青霉素-鏈霉素-兩性霉素B混合溶液（索萊寶，北京）;重組人TNF-α、重組人IL-1β（PeproTech，美國(guó)）;β甘油磷酸鈉、地塞米松、抗壞血酸、Trizol Regent（Invitrogen，美國(guó)）;PrimeScriptTM RT-PCR kit 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Syber Green熒光定量PCR試劑盒（Takara，日本）;Z45CT垂直振動(dòng)機(jī)（廣州美亦豐試驗(yàn)設(shè)備有限公司）;CO2恒溫培養(yǎng)箱、酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（Thermo，美國(guó)）;RealTime PCR儀（Biosytems 7500，美國(guó)）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 PDLSCs的分離培養(yǎng)：選取年齡為12～18歲正畸治療需要拔除的前磨牙，用含1%三抗的PBS將離體牙牙根沖洗干凈，用解剖刀片搔刮牙根根中1/3獲得牙周膜碎片，離心后，在牙周膜沉淀中加入3mg/ml Ⅰ型膠原酶和4mg/ml中性蛋白酶各500μl，37℃消化30min。等體積含10%胎牛血清（FBS）的αMEM培養(yǎng)基終止消化，1 000r/min離心5min，棄上清。加入含10% FBS的αMEM培養(yǎng)基重懸，接種于培養(yǎng)瓶，于37℃、5% CO2條件孵箱培養(yǎng)。原代細(xì)胞匯合達(dá)80%時(shí)傳代培養(yǎng)。

1.2.2 PDLSCs間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物檢測(cè)：取P3代的PDLSCs，以1×106個(gè)/毫升并移入1.5ml EP管，每管200μl;依次向EP管中加入2μl熒光標(biāo)記的抗體（CD34、CD45、CD90、CD146、STRO-1），4℃避光孵育1h，PBS沖洗3次，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)情況。

1.2.3 構(gòu)建體外炎癥微環(huán)境與體外LMHFV模型：通過(guò)參考同研究領(lǐng)域?qū)W者的實(shí)驗(yàn)方法[8-9]，選擇在常規(guī)培養(yǎng)液（含10% FBS的α-MEM培養(yǎng)液）中添加TNF-α（10ng/ml）與I L - 1 β （ 5 n g / m l ） 配制成炎性培養(yǎng)液， 以此構(gòu)建體外炎癥微環(huán)境。采用廣州美亦豐Z 4 5 C T 垂直振動(dòng)機(jī)（見(jiàn)圖1），該裝置由控制臺(tái)與振動(dòng)臺(tái)構(gòu)成，可以產(chǎn)生5～500Hz正弦振動(dòng)波。進(jìn)行細(xì)胞加力實(shí)驗(yàn)時(shí)，通過(guò)控制臺(tái)設(shè)置振動(dòng)參數(shù)，將細(xì)胞培養(yǎng)板固定于振動(dòng)臺(tái)，進(jìn)行細(xì)胞加力。根據(jù)本課題組前期的預(yù)實(shí)驗(yàn)，調(diào)整振動(dòng)參數(shù)為：加速度=0.3g，頻率=40Hz，時(shí)間=15min/d時(shí)，P D L S C s 的成骨分化能力提高最為明顯（ 見(jiàn)圖2 ） ， 因此選擇這一參數(shù)構(gòu)建LMHFV環(huán)境。實(shí)驗(yàn)分組：Control組（0 H z，常規(guī)培養(yǎng)液培養(yǎng)）;LMHFV組（40Hz，常規(guī)培養(yǎng)液培養(yǎng)）;Inflammation Microenvironment（IM）組（0Hz，炎性培養(yǎng)液培養(yǎng)）;IM+LMHFV組（40Hz，炎性培養(yǎng)液培養(yǎng)）。

1.2.4 Rea l t i m e RT-PCR檢測(cè)成骨相關(guān)基因表達(dá);取第4代細(xì)胞，以1×105個(gè)/孔接種于6孔板，待細(xì)胞匯合至6 0 %，根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組更換成骨誘導(dǎo)液（含10% F B S 的α-MEM培養(yǎng)基，加β甘油磷酸鈉10mmol/L、抗壞血酸5 0 g / m l、地塞米松1×1 0 m o l / L）進(jìn)行成骨誘導(dǎo);炎性成骨培養(yǎng)液需在常規(guī)成骨培養(yǎng)液的基礎(chǔ)上添加1 0 n g / m lT N F - α 與5 n g / m l IL-1β）。換液后2h將6孔板固定于Z45CT垂直振動(dòng)機(jī)振動(dòng)臺(tái)上，根據(jù)分組設(shè)置振動(dòng)參數(shù)，每組均加力15min/d（0Hz組在振動(dòng)臺(tái)上靜置15min/d），連續(xù)加力7d;期間每3d換液，每次2ml;在最后一次振動(dòng)結(jié)束后2h終止培養(yǎng)，使用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA;控制RNA濃度在300～500ng/μl，A260/A280為1.8～2.0。使用PrimeScriptTM RT-PCR kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，使用Syber Green熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行qPCR檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)所用引物序列見(jiàn)表1所示。

1.2.5 Western-Blot檢測(cè)成骨相關(guān)蛋白表達(dá)：取P4代的PDLSCs，以1×105個(gè)/孔接種于6孔板，待PDLSCs匯合至70%左右，根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組更換成骨誘導(dǎo)液進(jìn)行成骨誘導(dǎo);換液后2h將6孔板固定于Z45CT垂直振動(dòng)機(jī)振動(dòng)臺(tái)上，根據(jù)分組設(shè)置振動(dòng)參數(shù)，每組均加力15min/d（0Hz組在振動(dòng)臺(tái)上靜置15min/d），連續(xù)加力7d;期間每3d換液，每次2ml;在最后一次加力后12h終止培養(yǎng)，提取總蛋白，經(jīng)BAC蛋白定量試劑盒對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)定量，按30μg/20μl體系加入蛋白上樣緩沖液，煮沸10min，置于-80℃冰箱待用。制備SDS-PAGE膠，依照蛋白分子量大小進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜。5%脫脂奶粉室溫封閉2h，洗膜后加入一抗，4℃靜置過(guò)夜。次日洗膜后加入二抗，于室溫?fù)u床孵育2h，洗膜后于暗室中將ECL熒光劑均勻浸濕膜表面，最后進(jìn)行顯影定影及曝光。

1.2.6 茜素紅染色檢測(cè)：連續(xù)加載LMHFV并成骨誘導(dǎo)21d進(jìn)行茜素紅染色（茜素紅染液：1g茜素紅溶于100ml蒸餾水，pH=4.3），棄6孔板培養(yǎng)液，蒸餾水沖洗2遍，60%異丙醇固定，茜素紅染液染色5min，蒸餾水沖洗，觀察并采用酶標(biāo)儀檢測(cè)450nm波長(zhǎng)的吸光度（A）值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，t 檢驗(yàn)分析數(shù)據(jù)，P <0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PDLSCs間充質(zhì)干細(xì)胞表面抗原標(biāo)志物鑒定：流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，PDLSCs陽(yáng)性表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD90、CD146、STRO-1，陰性表達(dá)造血系來(lái)源細(xì)胞表面標(biāo)志物CD34、CD45。見(jiàn)圖3。

2.2 成骨相關(guān)基因表達(dá)情況：Realtime RT-PCR結(jié)果顯示：與IM組相比，IM+LMHFV組的RUNX-2、ALP、COL-1相對(duì)表達(dá)量均有上升，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;而OCN的相對(duì)表達(dá)量雖然有升高趨勢(shì)，但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P >0.05）;上述兩組與Control組相比，成骨基因相對(duì)表達(dá)量均有明顯減低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P <0.05）。見(jiàn)圖4。

2.3 成骨相關(guān)蛋白表達(dá)結(jié)果：Western-blot結(jié)果表明：與IM組相比，IM+LMHFV組ALP、COL-1、OCN的蛋白表達(dá)量均有提高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P <0.05）;而RUNX-2雖然有增高的趨勢(shì)，但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P >0.05）;上述兩組與Control組相比，成骨標(biāo)志物的蛋白表達(dá)量均有顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P <0.05）。見(jiàn)圖5。

2.4 茜素紅染色結(jié)果：I M組幾乎觀察不到有鈣結(jié)節(jié)生成， 而I M + L M H F V 組有少量紅染的鈣結(jié)節(jié); 與C o n t r o l組比較， I M 組和I M + L M H F V 組的鈣結(jié)節(jié)生成量顯著減少;通過(guò)對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行半定量分析，提示IM+LMHFV組細(xì)胞基質(zhì)鈣含量較IM有所增多，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P >0.05）。見(jiàn)圖6。

3 討論

慢性牙周炎患者接受牙周基礎(chǔ)治療之后炎癥反應(yīng)雖然得到控制，但是缺損區(qū)域的牙周組織仍然處于炎癥微環(huán)境之中，并且相較健康人群，這些患者對(duì)牙周致病菌具有更強(qiáng)的易感性，炎癥反復(fù)幾率大大增加，而炎性環(huán)境會(huì)削弱牙周各組織的修復(fù)再生能力。根據(jù)慢性牙周炎的形成機(jī)制，學(xué)者們主要通過(guò)三種方法在體外模擬牙周炎癥微環(huán)境，即：培養(yǎng)液中添加Pg.LPS[10-11]、培養(yǎng)液中添加炎性細(xì)胞因子[9，12]、直接從牙周病離體牙的牙根獲取炎性來(lái)源牙周膜干細(xì)胞（PDLSCs from periodontitis tissue，pPDLSCs）[13]。Park等[14]的研究已證實(shí)pPDLSCs與健康組織來(lái)源的牙周膜干細(xì)胞（PDLSCs from healthy periodontaltissue，hPDLSCs）相比表現(xiàn)出炎癥反應(yīng)刺激后的細(xì)胞特性的變化，包括增殖、多向分化等能力的改變;但是提供pPDLSCs的志愿者年齡一般較大，并且?guī)缀醪荒芡瑫r(shí)提供hPDLSCs，這影響了實(shí)驗(yàn)的可行性;如果使用不同年齡、不同個(gè)體來(lái)源的兩種PDLSCs進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，又增加了實(shí)驗(yàn)的干擾因素，所以這種體外炎癥模型的構(gòu)建方法還存在爭(zhēng)議。通過(guò)應(yīng)用Pg.LPS模擬炎癥模型也是常用的體外建模方法，其效果獲得一些學(xué)者的認(rèn)可，但是受到Pg.LPS刺激后所產(chǎn)生的細(xì)胞反應(yīng)十分復(fù)雜，涉及到的信號(hào)通路較多，這可能會(huì)影響到實(shí)驗(yàn)后續(xù)的機(jī)械力學(xué)刺激。IL-1β與TNF-α是牙周病進(jìn)展過(guò)程中發(fā)揮主要作用的炎癥介質(zhì)，兩者均會(huì)促進(jìn)膠原酶等基質(zhì)溶解酶的分泌，加速牙周纖維組織降解，造成附著喪失;與此同時(shí)IL-1β與TNF-α還是破骨細(xì)胞增殖、活化的刺激因子，可以激活破骨細(xì)胞，造成牙槽骨吸收;所以本實(shí)驗(yàn)選用IL-1β與TNF-α構(gòu)建體外炎癥微環(huán)境，旨在更為準(zhǔn)確地模擬牙周炎癥反應(yīng)。

LMHFV已經(jīng)被證實(shí)可以提高BMSCs的成骨分化能力[15]，而且在本實(shí)驗(yàn)前期的研究當(dāng)中也證實(shí)其可以促進(jìn)PDLSCs成骨相關(guān)基因的表達(dá)，但尚未有報(bào)道證實(shí)在炎性條件下LMHFV是否會(huì)增強(qiáng)或阻礙PDLSCs的成骨分化能力。因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)炎性細(xì)胞因子IL-1β和TNF-α模擬體外炎癥微環(huán)境，并應(yīng)用前期實(shí)驗(yàn)摸索的最適振動(dòng)參數(shù)對(duì)PDLSCs施加LMHFV刺激，探究炎性條件下LMHFV對(duì)PDLSCs成骨分化能力的作用。Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子-2（runt-related transcriptionfactor-2，RUNX-2）是Runt（Runt domain）轉(zhuǎn)錄因子家族中的一份子，是骨組織成熟過(guò)程中不可或缺的轉(zhuǎn)錄因子[16]。堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）是骨組織形成、代謝過(guò)程中重要的礦化調(diào)節(jié)物，其主要的作用是在骨形成過(guò)程中水解磷酸酯和破壞礦化阻斷劑從而促進(jìn)基質(zhì)礦化反應(yīng)，并且ALP可同時(shí)作為鈣結(jié)合蛋白和磷酸基轉(zhuǎn)運(yùn)子促進(jìn)礦化[17-18]。Ⅰ型膠原（Collagen typeⅠ，COL-1）是人和動(dòng)物體內(nèi)骨組織與纖維組織細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，在礦化的骨組織中COL-1是僅有的膠原成分，具有維持骨組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的作用;并且有研究證實(shí)COL-1可以促進(jìn)BMSCs向成骨細(xì)胞分化[19-20]。骨鈣素（Osteocalcin，OCN）是一種非膠原蛋白，只有分化成熟的成骨細(xì)胞可以特異性的合成并分泌OCN。本實(shí)驗(yàn)在炎癥微環(huán)境下對(duì)PDLSCs施加LMHFV刺激，7d后通過(guò)Realtime RT-PCR與Western-blot對(duì)成骨相關(guān)標(biāo)志物RUNX-2、ALP、COL-1、OCN的mRNA表達(dá)及蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果均表明LMHFV能夠在炎性條件下增強(qiáng)PDLSCs的成骨分化能力。這一結(jié)果與Kim等的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果接近，該實(shí)驗(yàn)對(duì)Balb/C小鼠注射LPS建立炎癥骨吸收動(dòng)物模型，并讓其中一部分小鼠接受全身振動(dòng)刺激（加速度=0.4g，頻率=45Hz），結(jié)果發(fā)現(xiàn)接受振動(dòng)刺激小鼠的脛骨、腓骨的骨量與骨密度明顯高于單純注射LPS的小鼠;在進(jìn)行機(jī)制研究時(shí)還發(fā)現(xiàn)在LPS誘導(dǎo)的炎性環(huán)境下，微振動(dòng)可以降低BMSCs對(duì)破骨相關(guān)基因IL-1β、TNF-α以及巨噬細(xì)胞集落刺激因子（Macrophage Colony stimulating Factor，M-CSF）的表達(dá)[21]。茜素紅染色結(jié)果顯示：炎癥微環(huán)境下LMHFV刺激后PDLSCs生成的鈣結(jié)節(jié)略有增多;而對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行半定量分析后發(fā)現(xiàn)，炎癥微環(huán)境下LMHFV并未顯著增加PDLSCs的鈣結(jié)節(jié)合成量，僅有略微增多的趨勢(shì)。茜素紅染色的結(jié)果與染液的pH值、細(xì)胞固定的時(shí)間、水化的時(shí)間等因素均有關(guān)聯(lián)，其中任何一項(xiàng)的偏差均會(huì)影響實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，因此成骨染色實(shí)驗(yàn)的結(jié)果還需進(jìn)一步驗(yàn)證。

炎性條件下，PDLSCs的多向分化潛能受到影響，成骨分化能力會(huì)遭到抑制。在本實(shí)驗(yàn)中，炎癥微環(huán)境下培養(yǎng)的PDLSCs成骨相關(guān)標(biāo)志物的檢測(cè)結(jié)果相較常規(guī)培養(yǎng)者均有顯著降低;雖然經(jīng)過(guò)LMHFV刺激后，成骨相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)量會(huì)有不同程度的升高，但是與常規(guī)培養(yǎng)者相比，RUNX-2、ALP、COL-1、OCN的表達(dá)仍然不及正常培養(yǎng)的PDLSCs，茜素紅染色的結(jié)果與此相一致。這一結(jié)果與Kim等的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果也接近，雖然微振動(dòng)刺激可以修復(fù)LPS造成的骨量和骨密度降低，但相較空白對(duì)照組的小鼠仍有明顯不足。這說(shuō)明，在炎癥微環(huán)境下LMHFV刺激雖然可以一定程度上提高PDLSCs的成骨分化能力，但是并不能完全抵消炎癥對(duì)成骨分化的抑制作用。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)著重探討了炎癥微環(huán)境下LMHFV對(duì)牙周組織工程種子細(xì)胞成骨分化能力的影響，這只是將LMHFV應(yīng)用于牙周組織工程的最初期探索，在后續(xù)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，還需要研究不同的生物支架材料對(duì)振動(dòng)的傳導(dǎo)性，以及LMHFV是否會(huì)使生物支架材料自身結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。此外，進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)時(shí)，牙周炎癥環(huán)境周?chē)赡軙?huì)有破骨細(xì)胞的存在，而LMHFV對(duì)破骨細(xì)胞的作用尚未可知，也需要開(kāi)展相關(guān)的研究。而且生物支架材料包裹種子細(xì)胞植入動(dòng)物體內(nèi)后，PDLSCs受到的振動(dòng)頻率、振幅等可能會(huì)與局部振動(dòng)裝置的參數(shù)不同，所以體內(nèi)實(shí)驗(yàn)所應(yīng)用的振動(dòng)參數(shù)包括加速度、頻率、時(shí)間等均需要進(jìn)一步探索。