張俊鴻， 熊 瑋

［陸軍軍醫(yī)大學（第三軍醫(yī)大學）第一附屬醫(yī)院老年醫(yī)學與特勤醫(yī)學科，重慶400038］

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmo?nary disease，COPD）以持續(xù)呼吸道癥狀和不可逆氣流受限為特征，是目前世界上第四大死亡原因，預計到2030年每年死于COPD和相關疾病的達450萬人［1］，給全球帶來巨大經濟和社會負擔。目前COPD的病理機制包括氧化細胞機制、氧化應激、衰老、線粒體功能異常等假說，但確切機制仍存在爭議。一直以來COPD主要依靠臨床癥狀及肺功能檢測診斷［2］，但存在漏診及過度診斷問題，治療方面以癥狀控制及疾病進展延緩為主，尚未發(fā)現能治愈COPD的藥物，所以迫切需要進一步研究COPD的發(fā)病機理，尋找新的生物標志物和治療靶點。

細胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）是各種類型細胞在生理狀態(tài)、應激、損傷或凋亡情況下釋放到細胞外環(huán)境中的囊泡，根據其大小可分為外泌體、微粒（microparticles，MPs）、凋亡小體等。MPs也稱微泡、胞外體、脫落囊泡等，直徑0.1~1μm，其內含有mRNA、miRNA、蛋白質、脂質等活性成分。很多研究表明MPs通過轉移其內容物介導細胞間通訊，調節(jié)信號轉導、炎癥反應等，參與疾病的發(fā)生發(fā)展，近年研究認為MPs也是COPD病理機制之一。本文對MPs介導的COPD發(fā)病機制的研究進展進行綜述。

1 COPD中常見的微粒及其活性

MPs在細胞間的交流中起著重要的作用，影響包括COPD在內的許多疾病，研究顯示COPD患者循環(huán)、肺泡灌洗液及痰液中細胞MPs增加，可能參與COPD的發(fā)生發(fā)展。

1.1 淋巴細胞來源的MPs（lymphocyte-derived MPs，LMPs）COPD是一種慢性氣道炎癥性疾病，淋巴細胞等炎癥細胞增加，炎癥機制在COPD的發(fā)生發(fā)展中起關鍵作用［3］。LMPs是淋巴細胞受到活化或凋亡時從漿膜上脫落的直徑0.05~1μm的小囊泡顆粒，含有多種特異性膜糖蛋白和生物學活性受體［4］，其數量的增加與免疫和炎癥性疾病的病理狀態(tài)有關。COPD中增多的LMPs聚集在支氣管上皮細胞（bron?chial epithelial cells，BECs）表面，可能誘導BECs的損傷。

臨床COPD患者肺泡灌洗液中LMPs病理性升高，且LMPs的量與疾病的嚴重程度有密切關系，進一步動物實驗證實LMPs促進C57BL/6小鼠的氣道炎癥［5］。體外研究顯示LMPs抑制人BECs生長，使細胞周期阻滯在G1期［6］，同時導致BECs的炎癥介質［包括腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）和IL-8等］增多，并通過p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-ac?tivated protein kinase，p38 MAPK）信號通路誘導BECs凋亡，促進氧化應激［7-8］。近來研究表明T淋巴細胞來源MPs抑制自噬，誘導BECs分泌炎癥因子（IL-1β、IL-18等），導致核苷酸結合寡聚化結構域樣受 體 蛋 白3（nucleotide-binding oligomerization do?main-like receptor protein 3，NLRP3）炎癥小體形成和積聚［9］，調節(jié)COPD炎癥反應。

目前體內外實驗已證實LMPs可對BECs發(fā)揮抑制生長、促炎和促凋亡的作用，可能作為COPD患者氣道炎癥及BECs損傷的有害生物標志物。但LMPs中包含有豐富的脂質、蛋白質和核酸成分，其發(fā)揮作用的具體成分仍需要進一步研究，才能為COPD的治療提供更精準的靶點。

1.2 BECs來源的MPs BECs是抵御有害物質的第一解剖氣道屏障，氣道上皮組織能產生跨膜型黏蛋白（transmembrane mucins，transmembrane MUCs），保持上皮表面濕潤，保護上皮免受病原體和環(huán)境刺激的影響，BECs來源的MPs中含很多不同MUCs（MUC-1、MUC-4和MUC-16等），能發(fā)揮中和H1N1流感病毒的作用［10］。因此，BECs來源的MPs可能與正常氣道生物學機制的調節(jié)有關。

COPD的部分特征是上皮-間充質轉化（epithe?lial-mesenchymal transition，EMT）相 關 的 氣 流 受限［11］。EMT可能導致氣道成纖維細胞產生，導致氣道重塑與氣流受限。人BECs來源的EVs能參與COPD上皮-成纖維細胞的異常交互作用，臨床研究表明COPD患者血清總EVs中miR-21水平較高，而在體外實驗中經香煙煙霧提取物處理的BECs來源的EVs中miR-21含量較低，這種EVs通過減輕M2巨噬細胞極化，改善COPD發(fā)病機制中EMT而減輕氣道重塑［12］，同時在COPD小鼠模型中證實下調BECs來源EVs的miR-21可以減輕香煙煙霧誘導的小鼠氣道重塑［13］。所以上皮細胞來源的EVs可能是COPD中一種新的減輕EMT的代償保護機制。

COPD是加速衰老的肺部疾病，表現出上皮細胞衰老、線粒體功能障礙等衰老相關特征。衰老的BECs可分泌含有很多炎癥因子（IL-6、IL-8等）的MPs，這些MPs具有衰老相關分泌表型的功能，被認為是一種新的衰老相關的分泌表型，在促進炎癥發(fā)展、衰老和氧化應激中起著重要作用［14］。最近研究顯示，經LMPs處理的視網膜色素上皮（retinal pig?ment epithelium，RPE）產生RPE來源的MPs（RPE-derived MPs，RMPs），影響上皮細胞的衰老及吞噬功能，參與衰老相關的病理改變［15］。而在COPD中LMPs能促進BECs分泌MPs，而這些BECs分泌的MPs是否參與衰老的病理改變及其具體調控機制可能值得進一步研究。

1.3 內皮細胞來源的MPs（endothelial cell-derived MPs，EMPs） 臨床研究表明，COPD患者循環(huán)中的EMPs含量增加［16］，且與吸煙和COPD有關，健康吸煙者戒煙后血漿EMPs的水平能恢復到不吸煙者的水平，不改變吸煙狀態(tài)的受試者血漿EMPs水平在1年內保持穩(wěn)定，而COPD吸煙者戒煙后血漿中EMPs水平在1年內仍然顯著升高［17］。這種EMPs含量的增加可能與肺毛細血管內皮細胞損傷有關［18］。近年來Takahashi等［19-21］發(fā)現，COPD患者循環(huán)血中的EMPs（CD144+、CD31+/CD42?和CD62E+）含量增加水平與疾病嚴重程度正相關；同時EMPs（CD62E+和CD144+）水平與第一秒用力呼氣容積（forced expiratory volume in 1 s，FEV1）變化呈顯著負相關，穩(wěn)定期COPD患者EMPs（CD62E+）水平高預示FEV1快速下降。還有研究表明，痰液中EMPs（CD31+）水平升高與肺損傷之間存在相關性［22］。此外，EMPs作為旁分泌或內分泌因子參與細胞間通訊可能參與COPD的發(fā)病，肺血管內皮細胞通過EMPs向肺泡上皮細胞轉運保護性α1-抗胰蛋白酶（alpha-1 antitrypsin，AAT）［23］。AAT是血清中主要的一種蛋白酶抑制劑，在COPD等炎癥性疾病時，AAT能透過毛細血管到組織液中，上皮細胞內化AAT可保護肺免受彈性蛋白酶和炎癥的影響，而AAT水平降低可導致呼吸困難及肺氣腫發(fā)生。

上述研究結果提示，COPD患者存在持續(xù)的內皮細胞激活和損傷，從而導致EMPs的穩(wěn)定釋放，而釋放的這些特定的EMPs亞群可能作為COPD患者診斷分級以及病情惡化易感性的潛在生物標志物，同時近來研究認為香煙煙霧引起的內皮功能障礙/損傷與COPD（特別是肺氣腫）的肺部損害以及包括肺動脈高壓、動脈粥樣硬化和慢性腎損傷等COPD并存疾病密切相關［24］，但EMPs在疾病中的確切作用機制仍需要進一步研究。

1.4 單核/巨噬細胞來源的MPs 單核/巨噬細胞在不同生理及病理狀態(tài)下也能產生MPs，可能與COPD的發(fā)病機制相關。Tokes-Fuzesi等［25］通過比較健康者、穩(wěn)定期和急性加重期COPD患者循環(huán)中單核細胞來源MPs（CD45+、CD13+、CD14+和CD56+）的水平，顯示單核細胞來源的MPs在病情惡化中起著重要作用，在COPD患者中單核細胞MPs均顯著高于健康對照組，而且COPD急性加重期MPs（CD14+）水平顯著高于穩(wěn)定期COPD，并與FEV1呈顯著負相關。在體外實驗中單核/巨噬細胞來源的MPs上調人BECs炎癥介質［IL-8、單核細胞趨化蛋白1（macrophage che?moattractant protein-1，MCP-1）和細胞間黏附分子1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）］合成，介導COPD氣道炎癥反應［26］，并且顯示巨噬細胞來源的MPs含有基質金屬蛋白酶，具有明膠溶解和膠原溶解活性，與肺氣腫發(fā)生有關［27］，而使用基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）抑制劑能抑制單核巨噬細胞MPs的釋放及其蛋白水解活性［28］。單核/巨噬細胞釋放的MPs可能作為COPD潛在的診斷及嚴重程度分級的循環(huán)生物標志物，并且為COPD提供了其他可能的治療方式。

2 MPs作為COPD的潛在診斷生物標志物

根據COPD的GOLD診斷和治療策略，任何有呼吸困難、慢性咳嗽或排痰，和（或）有暴露于該疾病危險因素的病史，應臨床考慮COPD，再結合肺活量測定吸入支氣管擴張劑后FEV1/用力肺活量（forced vi?tal capacity，FVC）<0.70來確診。雖然肺活量測定是一項簡單的測試，但COPD在年輕患者中可能會被低估，在老年患者中可能會被過度診斷［29］。同時，COPD現在被廣泛認為是一種復雜的異質性疾病，在評估COPD患者時，根據預后和治療反應確定臨床表型以選擇最佳治療方案是很重要。因此，研究新的COPD生物標志物以補充肺功能測定很有必要。

目前研究表明，某些類型的EMPs是COPD潛在的生物標志物，EMPs水平的增加可能反映肺毛細血管內皮細胞的損傷。COPD患者循環(huán)中EMPs（CD144+、CD31+/CD42?和CD62E+）含量增加的水平與疾病嚴重程度正相關，且痰液中EMPs（CD31+）水平升高，與FEV1呈負相關［19-22］。

近年來許多臨床研究分析痰及血循環(huán)中miRNA圖譜以預測和診斷COPD。與健康對照組相比，COPD患者痰液中l(wèi)et-7c和miR-125b的表達水平降低［30］，血清miR-21和miR-181a水平升高［31］。最近Sundar等［32］對不吸煙者、吸煙者和COPD患者血漿來源的EVs進行miRNA譜分析，發(fā)現COPD患者較吸煙者或不吸煙者上調的miRNA有miR-22-3p、miR-99a-5p、miR-151a-5p、miR-320b和miR-320d，下調的有miR-335-5p、miR-628-3p、miR-887-5p和miR-937-3p，并在經香煙煙霧處理的BECs分泌的EVs中得到驗證。所以EVs中的miRNA可作為COPD新的生物標志物，COPD患者miRNA的分子圖譜對尋找COPD診斷及治療的特異生物標志物具有重要意義，但是miRNA發(fā)揮作用的具體機制仍需要進一步研究。

此外，最近有研究提出血漿EVs的表面蛋白質分析可以作為鑒別及診斷COPD的一種無創(chuàng)方法。Jung等［33］比較了健康對照者、社區(qū)獲得性肺炎（com?munity-acquired pneumonia，CAP）患者和COPD急性加重（acute exacerbation of COPD，AECOPD）患者的血漿樣本，顯示血漿EVs的表面蛋白質修飾在組間有顯著差異，在ROC分析中，CD45和CD28是CAP和AECOPD的鑒別標志物，進一步通過CD45、CD28、細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白4（cytotoxic T-lympho?cyte-associated protein 4，CTLA4）、TNF和CD16的組合又可以區(qū)分CAP和AECOPD。這提示血漿EVs的特異蛋白質組成可能對COPD的診斷及鑒別有意義。

3 MPs作為COPD可能的治療靶點

MPs可通過將內容物分子轉移到遠處的受體細胞而改變受體細胞，所以MPs有望成為一種新的治療靶點。近年針對MPs的治療策略主要有：（1）消除含有核酸或蛋白質的MPs（作為參與疾病發(fā)病機制的細胞內通訊介質）；（2）利用MPs作為肺再生或免疫調節(jié)劑的來源；（3）利用MPs作為藥物遞送介質。

消除MPs可以通過捕獲循環(huán)中的MPs、干擾受體細胞對MPs的攝取以及抑制MPs的產生或分泌來實現［34-35］。Fujita等［36］的研究表明，人BECs來源的EVs中miR-210可通過阻斷自噬相關基因7（autopha?gy-related gene 7，ATG7），促進肺成纖維細胞向肌成纖維細胞分化，從而引起COPD患者氣道重塑，因此消除表達miR-210的EVs可能有助于抑制氣道重塑。此外，體外實驗結果顯示，通過MMPs抑制劑抑制單核細胞MPs的產生可能有助于減輕肺部炎癥，緩解肺氣腫的變化［28］。

MPs在作為肺再生或免疫調節(jié)劑方面的也已有所 應 用 。Lener等［37］將 間 充 質 干 細 胞/基 質 細 胞（mesenchymal stem/stromal cells，MSCs）衍生的MPs（MSC-EVs）作為一種治療方式。骨髓MSCs是一種多能非造血細胞，具有分化為多種細胞類型的潛能。近來人們發(fā)現骨髓MSCs具有抗炎和（或）免疫抑制、協(xié)調組織再生等潛能；而到目前為止，許多研究表明，MSCs衍生的MPs與MSCs具有相同的功能。比如在卵清蛋白（ovalbumin，OVA）誘導的嚴重哮喘小鼠過敏模型中，MSC-EVs能減輕肺部炎癥及氣道膠原沉積［38］；de Castro等［39］的研究表明，MSC-EVs能減輕曲霉菌誘導小鼠Th2/Th17介導的氣道炎癥和高反應性。

MPs作為藥物遞送介質，目前主要是人工合成納米MPs聯(lián)合藥物或者miRNA以吸入的方式對COPD起治療作用［40-42］。但是目前多集中于MPs治療癌癥方面的報道，細胞MPs治療COPD的研究報道很少，還需要進一步研究來確定MPs治療COPD的特異性效應。

4 COPD背景下MPs致病可能成分討論

MPs作為細胞受到刺激活化或凋亡后形成的納米囊泡，參與COPD炎癥調節(jié)、氣道重塑等病理生理過程，但是MPs中富含脂質、蛋白質及核酸等生物活性成分，且不同狀態(tài)細胞來源的MPs成分又不相同，那么不同MPs中具體哪種成分發(fā)揮作用仍不清楚。目前研究主要報道了MPs中miRNA及蛋白質成分在COPD中的作用，如人氣道上皮細胞來源的EVs中miR-21參與吸煙誘導的COPD上皮-成纖維細胞的異常交互作用［13］；此外MPs中蛋白質成分如MUCs、MMPs也在COPD中發(fā)揮作用。然而脂質作為MPs的基本結構成分，其作用尚未明確。很多研究表明，鞘磷脂代謝產物［如神經酰胺和鞘氨醇-1-磷酸（sphingosine-1-phosphate，S1P）］控制著肺內關鍵的細胞信號事件，這些信號事件可能通過香煙煙霧誘導的鞘磷脂失衡，導致肺泡上皮細胞和BECs增殖、炎癥反應、凋亡和衰老［43-45］，所以有研究提出血漿脂質包括鞘脂及代謝產物是COPD的潛在生物標志物，可能為COPD診斷及嚴重程度分級提供一種方法［46］。近來Serban等［47］發(fā)現，香煙煙霧誘導釋放的EMPs和循環(huán)MPs（circulating MPs，cMPs）富含神經酰胺，而S1P的含量相對減少，所以MPs中的某些脂質包括鞘脂代謝物可能作為COPD潛在的生物標志物，但需要進一步研究具體脂質成分及其作用機制。

綜上所述，MPs通過不同的方式參與COPD的發(fā)生發(fā)展，具有作為COPD診斷及嚴重程度分級的生物標志物的潛力，且MPs中的某些成分如miRNA、MMPs等在COPD中發(fā)揮作用，為COPD精準治療提供了參考依據。但是MPs成分隨細胞類型、病理生理背景、接受測試的對象、給予的不同刺激波動、基因表達的變化而變化，而且MPs的鑒定、分離、提取、內容物如脂質成分的分析仍存在技術挑戰(zhàn)，因此MPs在COPD中的作用仍存在爭議。COPD中MPs的作用仍需進一步研究，以明確MPs與COPD病理生理的確切關系及尋找新的潛在生物標志物和臨床治療靶點。