車建美 劉國紅 陳倩倩 劉丹瑩 劉波

摘 要：為研究不同地區(qū)分離的短短芽胞桿菌菌株的多樣性特征，并篩選產(chǎn)揮發(fā)性物質(zhì)生防菌株，采用REPPCR、BOXPCR和ERICPCR對(duì)短短芽胞桿菌進(jìn)行遺傳多樣性分析;同時(shí)，采用二分隔平板進(jìn)行產(chǎn)揮發(fā)性物質(zhì)生防菌株的篩選。結(jié)果表明：采用BOX、ERIC和REP引物可以擴(kuò)增出11～15條較亮、較穩(wěn)定的條帶，多態(tài)性比率分別達(dá)到85.71%、93.33%和90.91%，表明不同地區(qū)分離的菌株基因組存在豐富的遺傳多樣性。系統(tǒng)聚類分析結(jié)果表明，當(dāng)λ=4.02時(shí)，可將20株短短芽胞桿菌菌株分為3個(gè)類群，其中來源青海的75%菌株都聚集在類群Ⅱ;來源西藏的75%菌株都聚集在類群Ⅲ中的第1個(gè)亞群;來源福建漳州的菌株都聚集在類群Ⅲ中的第2個(gè)亞群。采用二分隔平板篩選到5株短短芽胞桿菌，其產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)龍眼焦腐病菌FJAT3586具有顯著的抑制作用，其中菌株FJAT18569和FJAT18570的抑菌率分別為62.80%和59.85%。本試驗(yàn)為研究短短芽胞桿菌多態(tài)性提供一定的依據(jù)，并為擴(kuò)充采后水果病害生物防治微生物資源奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：短短芽胞桿菌;REPPCR;揮發(fā)性物質(zhì);遺傳多樣性

中圖分類號(hào)：S 476.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：0253-2301（2021）01-0001-08

DOI：10.13651/j.cnki.fjnykj.2021.01.001

Abstract：In order to study the diversity characteristics of Brevibacillus brevis strains isolated from different areas and to screen the biocontrol strains which produce volatile substances， the genetic diversity of Brevibacillus brevis strains was analyzed by using REPPCR， BOXPCR and ERICPCR， and the biocontrol strains which produced volatile substances were screened by using two-compartment plates. The results showed that 11-15 bright and stable bands could be amplified with BOX， ERIC and REP primers， and the polymorphism rates reached 85.71%， 93.33% and 90.91%， respectively， indicating that there were rich genetic diversity in the genomes of Brevibacillus brevis strains isolated from different regions. The hierarchical cluster analysis results showed that：20 strains of Brevibacillus brevis could be divided into three groups when λ=4.02. Of these clusters， 75% of the strains which were collected from Qinghai were gathered in group Ⅱ， 75% of the strains which were collected from Tibet were gathered in the first subgroup of group Ⅲ， and all the strains which were collected from Zhangzhou in Fujian were gathered in the second subgroup of group Ⅲ. By using two-compartment plates， 5 strains of Brevibacillus brevis were screened， by which the volatile substances produced had significant inhibiting effect on Lasiodiplodia theobromae FJAT3586， and the bacteriostasis rates of FJAT18569 and FJAT18570 were 62.80% and 59.85%， respectively. This study provided some basis for studying the polymorphism of Brevibacillus brevis and laid a foundation for expanding the microbial resources for biological control of postharvest fruit diseases.

Key words：Brevibacillus brevis; REP-PCR; Volatile substance; Genetic diversity

短短芽胞桿菌Brevibacillus brevis屬于短芽胞桿菌屬，能夠形成芽孢，具有很強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)力及與土著微生物的競(jìng)爭(zhēng)力等[1]，廣泛分布于植物根際土壤、海水、濕地和淤泥等生態(tài)環(huán)境中[2]。近年來，不同生境的短短芽胞桿菌被分離出來應(yīng)用于環(huán)保、生防、化工、食品等方面[3-5]。從大慶油田采油廠含油污水中分離篩選得到的短短芽胞桿菌可降解高碳鏈飽和烷烴，提高油田采收率[6]。分離自貴州煙田根際土壤的短短芽胞桿菌DZQ3對(duì)煙草青枯菌病原菌具有強(qiáng)烈的拮抗作用，能夠誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性，增強(qiáng)煙草的抗病能力[7]。從云南昆明滇池一水生植物中分離得到1株內(nèi)生短短芽胞桿菌，對(duì)楊桃炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides、香石竹疫霉Phytophthora nicotianae和腐皮鐮刀菌Fusadum solani等多種植物病原真菌有著較強(qiáng)的拮抗作用[8]。

不同地理區(qū)域的生態(tài)環(huán)境、氣候條件等差異明顯，研究不同生境分離得到的短短芽胞桿菌群體的遺傳多樣性對(duì)于促進(jìn)短短芽胞桿菌的廣泛應(yīng)用具有重要的理論意義。微生物基因組中廣泛分布著短重復(fù)序列，根據(jù)這些序列設(shè)計(jì)引物，選擇性地?cái)U(kuò)增重復(fù)序列之間的不同基因區(qū)域，以得到大小不等的DNA擴(kuò)增片段的方法日漸增多[9]。在微生物多樣性分析中，基因外重復(fù)回文因子（repetitive extragenic palindromic，REP）、腸桿菌基因間重復(fù)一致序列（enterobacterial repetitive inter-genic consensus，ERIC）和BOX插入因子等細(xì)菌重復(fù)序列（repetitive sequence，Rep）的PCR擴(kuò)增操作簡(jiǎn)單快捷，易獲得較為豐富的條帶，能夠完成大量菌株的DNA多態(tài)性分析[10-12]。采用ERICPCR進(jìn)行新疆牛源大腸桿菌O157∶H7的指紋圖譜分析表明，不同來源的菌株之間，存在著某些相似的ERIC特性，并聚集在同一個(gè)簇群中[13]。以BOX引物對(duì)烤煙葉片內(nèi)生固氮菌基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果表明，62株固氮菌可被劃分為16種不同的遺傳圖譜類型[14]。采用REPPCR和ERICPCR可將140株蘇云金芽胞桿菌Bacillus thuringiensis劃分為4個(gè)主要類群[15]。但目前未見采用該方法進(jìn)行短短芽胞桿菌遺傳多樣性分析的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。

與非揮發(fā)性抗菌物質(zhì)相比，芽孢桿菌產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)更容易在空氣中擴(kuò)散，能更有效地抑制病原菌生長，因此近年來廣泛應(yīng)用于采后保鮮研究[16-17]。甲基營養(yǎng)芽孢桿菌Bacillus methylotrophicus BCN2和蘇云金芽胞桿菌B.Thuringiensis（BCN10）產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)可以抑制尖孢鐮刀菌Fusarium oxysporum、灰霉病菌Botrytis cinerea、膠孢炭疽菌等5種采后病原菌[18]。貝萊斯芽孢桿菌Bacillus velezensis（BUZ14）產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)褐腐病菌Monilinia fructicola和柑橘青霉菌Penicillium italicum生長的抑制率分別為72%和80%。貝萊斯芽孢桿菌Bacillus velezensis（BUZ13）和BUZ15對(duì)灰霉病菌B.cinerea生長的抑制率為100%[19]。短短芽胞桿菌FJAT8672揮發(fā)性抑菌代謝物對(duì)尖孢鐮刀菌的抑制率為36.10%，GCMS檢測(cè)表明，該菌株可以產(chǎn)生21種高匹配度揮發(fā)性抑菌代謝物[20]。但目前關(guān)于短短芽胞桿菌產(chǎn)生揮發(fā)性物質(zhì)抑制果實(shí)采后病原菌的研究報(bào)道較少。本研究通過REPPCR、BOXPCR和ERICPCR對(duì)短短芽胞桿菌進(jìn)行遺傳多樣性分析，以期揭示不同地區(qū)分離的短短芽胞桿菌菌株的多樣性特征，同時(shí)，采用二分隔平板進(jìn)行產(chǎn)揮發(fā)性物質(zhì)生防短短芽胞桿菌菌株的篩選，為豐富采后水果病害防治微生物菌種資源開發(fā)和利用提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試菌株 供試短短芽胞桿菌菌株均為本實(shí)驗(yàn)室分離并保存，供試菌株及來源列于表1。龍眼焦腐病病原菌FJAT3586為本實(shí)驗(yàn)室分離并保存。

1.1.2 供試培養(yǎng)基 短短芽胞桿菌培養(yǎng)采用牛肉浸膏（NA）培養(yǎng)基，龍眼焦腐病病菌培養(yǎng)采用PDA培養(yǎng)基。

1.1.3 主要試劑和儀器 PCR儀、電泳儀為BioRad公司生產(chǎn);凝膠成像儀為Gel DocItTM UVP凝膠成像系統(tǒng)。細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購自BioTeke公司;Taq酶、dNTPs購自北京天根生物有限公司;3000 bp Marker購自Ferments生物有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株培養(yǎng) 用滅菌牙簽挑取活化的不同菌株單菌落于25 mL液體培養(yǎng)基中，30℃、170 r·min-1培養(yǎng)24 h。

1.2.2 菌株基因組DNA提取 參照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取各菌株的基因組DNA。

1.2.3 菌株多態(tài)性分析 （1）BOXPCR：25 μL PCR反應(yīng)體系包括19.7 μL ddH2O;10×Buffer 2.5 μL、10 μmol BOXA1R引物1 μL、2 mmol·L-1 dNTPs 0.5 μL、2.5 U Taq酶0.3 μL和25 ng模板DNA 1 μL。PCR循環(huán)參數(shù)為：95℃預(yù)變性7 min;然后進(jìn)入94℃ 1 min，52℃ 1 min，72℃ 8 min，共30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸15 min。采用2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳并拍照。（2）REPPCR：25 μL PCR反應(yīng)體系中含有15.7 μL ddH2O;10×Buffer 2.5 μL、2 mmol·L-1 dNTPs 0.5 μL、10 μmol REP引物5 μL、2.5 U Taq酶0.3 μL和25 ng模板DNA 1 μL。PCR循環(huán)參數(shù)為：95℃預(yù)變性 7 min;然后進(jìn)入94℃ 1 min，44℃ 1 min，72℃ 8 min，共30個(gè)循環(huán);最后72℃延伸15 min。采用2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳并拍照。（3）ERICPCR：25 μL PCR反應(yīng)體系中含有ddH2O 15.7 μL ;10×Buffer 2.5 μL、2 mmol·L-1 dNTPs 0.5 μL、10 μmol REP引物5 μL、2.5 U Taq酶0.3 μL和25 ng模板DNA 1 μL。PCR循環(huán)體系為94℃預(yù)變性 4 min;然后進(jìn)入94℃ 1 min，52℃ 1 min，65℃ 6 min，共30個(gè)循環(huán);最后65℃延伸16 min。采用2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，并拍照。

1.2.4 產(chǎn)揮發(fā)性物質(zhì)生防菌株的篩選 在二分隔培養(yǎng)皿的一邊倒入PDA固體培養(yǎng)基，待凝。隨后取350 μL供試細(xì)菌懸浮液（1×107 cfu·mL-1）于7 mL NA半固體培養(yǎng)基中，混勻，倒入培養(yǎng)皿的另一邊，30℃培養(yǎng)2 d。取龍眼焦腐病病原菌FJAT3586菌餅5.55 mm，置于二分隔培養(yǎng)皿PDA的另一邊，以無菌水為對(duì)照。28℃培養(yǎng)5 d后，測(cè)量病原菌菌落直徑，參照以下公式計(jì)算抑菌率。

抑菌率=（對(duì)照組病原菌菌落直徑-處理組病原菌菌落直徑）/（對(duì)照組病原菌菌落直徑-菌餅直徑）×100%。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 參照PCR擴(kuò)增結(jié)果的瓊脂糖凝膠電泳圖譜，根據(jù)各擴(kuò)增條帶的遷移率及其有無統(tǒng)計(jì)所得位點(diǎn)的二源數(shù)據(jù)：無帶計(jì)為“0”，強(qiáng)帶和弱帶均計(jì)為“1”。 多態(tài)性比率參照以下公式計(jì)算：

多態(tài)性比率=（總擴(kuò)增條帶數(shù)-公共條帶數(shù)）/總擴(kuò)增條帶數(shù)×100%

不同菌株間聚類采用歐式距離法，小類之間的距離計(jì)算方法采用最遠(yuǎn)距離法（Furthest neighbor），即在類中最遠(yuǎn)的兩個(gè)樣品之間的聚類為這兩個(gè)類的距離。

2 結(jié)果與分析

2.1 短短芽胞桿菌BOXPCR多態(tài)性分析

不同來源的短短芽胞桿菌BOXPCR擴(kuò)增結(jié)果如圖1所示。采用BOX引物共擴(kuò)增出14條較亮、較穩(wěn)定的條帶，其中1000 bp和2000 bp的2條條帶是共有條帶，其余為特異性條帶，多態(tài)性比率達(dá)到85.71%。

2.2 短短芽胞桿菌ERICPCR多態(tài)性分析

不同來源的短短芽胞桿菌ERICPCR擴(kuò)增結(jié)果如圖2所示。采用ERIC引物共擴(kuò)增出15條較亮、較穩(wěn)定的條帶，其中1200 bp的1條條帶為所有菌株的共有條帶，其余為特異性條帶，多態(tài)性比率達(dá)到93.33%。

2.3 短短芽胞桿菌REPPCR多態(tài)性分析

不同來源的短短芽胞桿菌REPPCR擴(kuò)增結(jié)果如圖3所示。采用REP引物共擴(kuò)增出11條較亮、較穩(wěn)定的條帶，其中700 bp的1條條帶為所有菌株的共有條帶，其余為特異性條帶，多態(tài)性比率為90.91%。

2.4 短短芽胞桿菌的分子多態(tài)性分析

利用BOXPCR、REPPCR和ERICPCR在不同短短芽胞桿菌分布的擴(kuò)增條帶進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，結(jié)果（圖4）表明，當(dāng)λ=4.02時(shí)，可將20株短短芽胞桿菌菌株分為3個(gè)類群，類群Ⅰ僅為1個(gè)菌株，類群Ⅱ包含4個(gè)菌株，其中來源青海的75%菌株都聚集在該類群;類群Ⅲ共包含15個(gè)菌株，該類群可以劃分為3個(gè)亞群，在第1個(gè)亞群中，來源哈爾濱的菌株都聚集在該亞群，來源福建順昌的75%菌株都聚集在該亞群，來源西藏的75%菌株也聚集在該亞群;在第2個(gè)亞群中，來源于福建漳州的菌株都聚集在該亞群;青?？煽晌骼飿悠贩蛛x的菌株單獨(dú)在第3個(gè)亞群。

2.5 產(chǎn)揮發(fā)性物質(zhì)生防菌株的篩選

不同短短芽胞桿菌產(chǎn)生揮發(fā)性物質(zhì)的抑菌試驗(yàn)結(jié)果表明，所測(cè)試的20株短短芽胞桿菌中，有5株短短芽胞桿菌產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)龍眼焦腐病病原菌FJAT3586具有顯著的抑制作用（圖5），其中抑菌率最高的為菌株FJAT18569，其抑菌率為62.80%;其次為菌株FJAT18570，其抑菌率為59.85%;菌株FJAT17214和菌株FJAT10623抑菌率相對(duì)較低，分別為50.52%和49.75%（圖6）。

3 討論

BOXPCR、ERICPCR和REPPCR指紋分析技術(shù)可以反映出菌株間基因組存在的差異，具有快速性、靈敏性、可重復(fù)性和可靠性等優(yōu)點(diǎn)，在微生物分類鑒定、菌株分型和生態(tài)學(xué)研究中應(yīng)用廣泛，為植物病害生防菌篩選技術(shù)的深入研究奠定了基礎(chǔ)[21-22]。本研究首次通過BOXPCR、ERICPCR和REPPCR對(duì)不同短短芽胞桿菌進(jìn)行基因組擴(kuò)增，結(jié)果表明，采用BOX引物共擴(kuò)增出14條較亮、較穩(wěn)定的條帶，多態(tài)性比率達(dá)到85.71%;采用ERIC引物共擴(kuò)增出15條較亮、較穩(wěn)定的條帶，多態(tài)性比率達(dá)到93.33%;采用REP引物共擴(kuò)增出11條條帶，多態(tài)性比率達(dá)到90.91%，表明不同地區(qū)分離的菌株基因組存在豐富的遺傳多樣性。該結(jié)果與不同地區(qū)采集的蘇云金芽胞桿菌遺傳多樣性分析結(jié)果相似，采用REPPCR和ERICPCR對(duì)27株標(biāo)準(zhǔn)蘇云金芽胞桿菌和113株分離的蘇云金芽胞桿菌進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果表明，其電泳條帶分別為2～7條和3～10條，具有豐富的遺傳多樣性。

利用BOXPCR、REPPCR和ERICPCR在不同短短芽胞桿菌菌株分布的擴(kuò)增條帶進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，結(jié)果表明，當(dāng)λ=4.02時(shí)，可將20株短短芽胞桿菌菌株分為3個(gè)類群，其中來源青海的75%菌株都聚集在類群Ⅱ;來源西藏的75%菌株聚集在類群Ⅲ中的第1個(gè)亞群;來源福建漳州的菌株都聚集在類群Ⅲ中的第2個(gè)亞群。說明，BOXPCR、REPPCR和ERICPCR可用于短短芽胞桿菌地理區(qū)域多樣性的分析。該結(jié)果與采用BOXPCR、REPPCR和ERICPCR分析不同病原菌、芽胞桿菌及其他屬菌株的地域多樣性結(jié)果類似。對(duì)84株來自福建地區(qū)不同寄主的青枯雷爾氏菌多樣性分析表明，青枯雷爾氏菌的地域性差異主要由BOXPCR提供[23]。采用BOXPCR和ERICPCR分析采自云南省不同地區(qū)溶桿菌也具有明顯的地域差異，采自昆明、石林、臨滄等地區(qū)的溶桿菌被劃分為不同的類群[24]。由于本研究所用菌株數(shù)量有限，其代表程度存在一定的局限性，在今后的研究中，將進(jìn)一步收集分離更多不同地域的短短芽胞桿菌菌株進(jìn)行遺傳多樣性分析。

短短芽胞桿菌在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，可抑制多種植物病原菌生長[7-8]以及抑制水果采后病原菌的生長等[25]。芽孢桿菌產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)因不與水果直接接觸，且能更有效地抑制病原菌生長，因此近年來成為采后保鮮研究的熱點(diǎn)之一[17]。短短芽胞桿菌也會(huì)產(chǎn)生揮發(fā)性物質(zhì)[20]，但關(guān)于其對(duì)采后病原菌的抑制作用研究并不多。因此，本研究還對(duì)20株短短芽胞桿菌產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)的抑菌效果進(jìn)行研究。結(jié)果表明，有5株短短芽胞桿菌產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)龍眼焦腐病病原菌FJAT3586具有顯著的抑制作用，其中抑菌率最高的為菌株FJAT18569，其抑菌率為62.80%。該結(jié)果與鄭香香等[26]研究的芽孢桿菌HB2、B1和X發(fā)酵液產(chǎn)生的揮發(fā)性氣體對(duì)極早熟桃采后鏈格孢菌的抑菌率（50%以上）較一致。橡膠樹內(nèi)生枯草芽孢桿菌菌株Czk1揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)橡膠樹5種根病菌和橡膠樹炭疽病菌的抑菌活性均表現(xiàn)出良好的抑制作用，利用HSSPMEGCMS對(duì)Czk1所產(chǎn)揮發(fā)性物質(zhì)組分進(jìn)行分析，共分離鑒定獲得包括碳?xì)浠衔?、胺類、醇類、烯類、酚類、酯類、吡嗪類、醛類、酮類及其他類?3種揮發(fā)性物質(zhì)[27]。陳崢等[20]采用GCMS檢測(cè)短短芽胞桿菌FJAT8672揮發(fā)性抑菌代謝物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)生的高匹配度揮發(fā)性抑菌代謝物為21種。因此，推測(cè)本研究篩選得到的5株短短芽胞桿菌也可能產(chǎn)生不同種類的揮發(fā)性抑菌代謝物，然而這些揮發(fā)性代謝物具體包括哪些種類目前還不清楚，后續(xù)研究將對(duì)其揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，并研究其主要揮發(fā)性物質(zhì)的抑菌效果和作用機(jī)理，為提升這5株短短芽胞桿菌在采后保鮮上的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯：林玲娜）