張 帆李思洋丁軍穎?劉清泉?

(1.首都醫(yī)科大學附屬北京中醫(yī)醫(yī)院,北京市中醫(yī)研究所,中醫(yī)感染性疾病基礎研究北京市重點實驗室,北京 100010;2.北京中醫(yī)藥大學,北京 100029)

近年來,隨著抗生素治療產生的毒副反應、細菌譜耐藥性的增加,加之空氣質量下降、環(huán)境中粉塵顆粒等有害因子增多,與肺相關的疾病,尤其是炎性疾病,已成為發(fā)達國家和發(fā)展中國家發(fā)病率和死亡率升高的主要原因[1]。為炎性疾病尋找新的生物標志物和早期診斷方法引起了諸多學者的研究興趣[2]。諸多證據(jù)表明,miRNAs通過各種機制影響著呼吸系統(tǒng)炎性疾病的發(fā)生和發(fā)展,且miRNA干擾技術在其中的應用更是發(fā)揮著重要的作用。miRNA通過抑制mRNA的翻譯廣泛參與基因表達、細胞分化、信號轉導、免疫應答、腫瘤的發(fā)生等多種生命活動[3]。miRNA作為基因表達的關鍵調節(jié)劑,對呼吸系統(tǒng)疾病的預防、診斷和治療起著重要的作用[4]。本文綜合分析近年來miRNA與呼吸系統(tǒng)炎性疾病相關的研究報道,總結miRNAs及miRNA干擾技術在呼吸系統(tǒng)炎性疾病研究中的進展,能夠為呼吸系統(tǒng)炎性疾病的研究提供更多的思考,為難治性肺炎尋找更多的突破口。

1 miRNA的生物合成與調控

microRNAs(miRNAs)是一組內源性非蛋白編碼RNA,長度約為20~22個核苷酸,其主要功能是參與基因轉錄后的調控。miRNA可與其信使RNA(massage RNA,mRNA)的3’端非翻譯區(qū)(universal training reactor,UTR)結合,引起靶mRNA在蛋白水平上的表達抑制(不完全互補匹配)或靶mRNA的降解(完全互補匹配),通過負向調節(jié)mRNA轉錄后抑制調節(jié)多種信號通路并影響基因表達[5]。

miRNA的生物合成過程主要分為以下三個階段:①miRNA在細胞核內經(jīng)基因組DNA編碼和RNA聚合酶II或III轉錄后,形成莖環(huán)結構的初級miRNA(primary miRNA,pri-miRNA),隨后被RNA聚合酶III(RNase III)Drosha和DGCR8切割形成莖環(huán)結構的前體miRNA(precursor miRAN,premiRNA)。②Pre-miRNA在轉運蛋白Expotin5的協(xié)助下輸出細胞核。③Pre-miRNA在細胞質中由Dicer酶切割成雙鏈miRNA,其中一條鏈即成熟miRNA。成熟的miRNA結合RNA介導的沉默復合體(RNA-induced silencing complex,RISC)成為活性miRNA。活性復合物通過堿基互補配對的方式特異性的識別靶mRNA的3’-UTR區(qū),誘導降解或抑制靶mRNA的翻譯,從而發(fā)揮轉錄后水平的調控,調節(jié)基因表達。

miRNA發(fā)揮作用的途徑主要有兩種方式:①降解靶基因mRNAs;②抑制靶基因mRNAs的翻譯水平。兩種途徑的選擇區(qū)別在于miRNAs與其靶mRNAs之間的互補匹配程度。如果miRNAs與靶mRNAs完全互補,miRNAs會使對應的靶mRNAs完全降解;而當miRNA與其靶基因不完全互補匹配時,只會抑制靶基因mRNAs的翻譯,而不會導致靶mRNAs的降解。在許多動物體內,miRNA是和靶mRNA的3′-UTR區(qū)域進行非完全互補結合,以此來抑制靶mRNAs的翻譯表達,從而影響靶基因對應的蛋白質表達[6]。

2 miRNA與疾病的關系

目前,在植物、動物和病毒中已鑒定出數(shù)百種miRNAs。其中,已報道并廣泛研究的miRNAs超過700個[7]。miRNAs可以控制多種作用途徑并廣泛參與機體多種重要的生理及病理過程,其中包括調控細胞生長、發(fā)育、分化、增殖及凋亡[4]。并且在調節(jié)免疫和抑制免疫反應中也發(fā)揮著重要的作用[8]。相當多的研究表明,miRNAs在包括神經(jīng)系統(tǒng)[9]、心血管系統(tǒng)[10]、泌尿系統(tǒng)[11]以及癌癥[12]等諸多復雜疾病中成為疾病診斷的特征性標志物和治療的靶點。此外,miRNA作為RNA干擾(RNA interference,RNAi)途徑中的重要分子,研究者利用其能夠調節(jié)基因表達、調控細胞的生命活動的功能,結合RNA干擾的原理,在體外引入特定的突變,通過同型基因化或換位將突變基因導入宿主體內原來的位置,觀察表型的改變,使miRNA成為以阻斷方式反向驗證通路節(jié)點的有效工具,為疾病的研究提供了一種新的手段,且已成為當前各系統(tǒng)疾病研究領域的重要方法。例如,在探索和驗證miR-451a在SiNPs誘導的血管內皮功能障礙和血栓形成前狀態(tài)中的作用的研究中,在SiNPs誘導下,miR-451a的化學模擬物可以導致IL6R/STAT/TF信號通路在體內外表達減弱,miR-451a的抑制劑增強了IL6R/STAT/TF信號通路的激活。證實了miR-451a通過負調控IL6R/STAT/TF信號通路,SiNPs可以加速血管內皮功能障礙和凝血前狀態(tài)[13]。在探討CXCR4與神經(jīng)性疼痛的關系時,在pSNL誘導下,鞘內注射miR-23a模擬物或慢病毒可導致miR-23a的過表達減少脊髓CXCR4分泌并預防pSNL誘導的神經(jīng)性疼痛。鞘內注射miR-23a抑制劑或慢病毒可引起疼痛樣行為。證實了miR-23a通過CXCR4/TXNIP/NLRP3軸調節(jié)脊髓神經(jīng)膠質細胞的神經(jīng)性疼痛[14]。

近年來由于環(huán)境污染以及醫(yī)療實踐對呼吸系統(tǒng)疾病造成的不可避免的副作用,加之今年新冠病毒在全球肆虐[15],嚴重威脅人類健康與社會穩(wěn)定,使得分子生物學層面對呼吸系統(tǒng)疾病發(fā)病機制的研究熱度大增,尤其是在重癥呼吸感染性疾病中的研究更是備受關注。而miRNA干擾技術憑借高效特異的抑制靶基因表達的優(yōu)勢,更是成為研究者們關注的焦點。

3 呼吸系統(tǒng)炎性疾病中miRNA的研究

3.1 感染性肺炎中的miRNA

感染性肺炎是指機體受微生物感染而產生的肺炎。主要由細菌、病毒及真菌等引起并發(fā)感染。研究表明,miRNA能夠調節(jié)宿主對細菌[16]、病毒[17]和真菌[18]病原體感染的反應。miRNA與肺部感染的發(fā)生發(fā)展、診斷及預后關系密切[19]。運用miRNA干擾技術證實關鍵miRNA分子的作用將會對肺部感染性疾病的發(fā)病機制、臨床診斷、治療及預后評估產生重大影響。

3.1.1 miRNA參與細菌性肺炎發(fā)生發(fā)展

細菌性肺炎是最常見的感染性肺炎的類型,是社區(qū)獲得性肺炎的主要病原體。其中,常見的病原體包括肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、流感嗜血桿菌、銅綠假單胞菌、肺炎支原體、肺炎衣原體等?？垢腥局委熓羌毦苑窝椎闹饕委煷胧?。盡管現(xiàn)代醫(yī)學治療感染性肺炎的方法不斷發(fā)展,肺炎病原學診斷仍然存在諸多困難。近年來隨著抗生素治療產生毒副反應、細菌譜耐藥性增加,細菌性肺炎的預防和治療遭遇瓶頸。研究發(fā)現(xiàn)miRNA能夠調節(jié)細菌誘發(fā)炎癥的分子機制,且miRNA干擾技術廣泛應用于其分子機制的研究中,miRNA作為新思路新方法能夠為細菌性肺炎的研究提供更多的可能。

(1)miRNA參與調控銅綠假單胞菌肺炎

銅綠假單胞菌(pseudomonas aeruginosa,PA)是臨床最常見的革蘭氏陰性桿菌,可存在于人體的皮膚黏膜、呼吸道及消化道。PA感染是囊性纖維化,支氣管擴張和慢性支氣管炎等患者慢性氣道感染的主要病因[20]。隨著抗菌藥物的濫用,抗PA抗生素的敏感性不斷下降,以及PA抗性的產生,致使PA肺炎患者病情嚴重,治療困難,病死率較高[21]。目前已有多項研究利用miRNA干擾反向驗證了相關miRNA參與調節(jié)PA肺炎的炎癥反應過程。

miR-301b通過影響嗜中性粒細胞向肺部的募集,調節(jié)宿主防御功能的發(fā)揮。Li等[22]研究發(fā)現(xiàn)在PA感染肺炎的炎癥反應中,miR-301b的表達水平升高。他們利用miRNA干擾技術將miR-301b模擬物和抑制劑分別轉染至PA感染的細胞中,證實了PA感染通過TLR4/MyD88/NF-κB途徑誘導miR-301b的表達。進一步研究發(fā)現(xiàn)咖啡因能夠通過cAMP/PKA/NF-κB軸的負調控來降低miR-301b表達水平,而抑制miR-301b導致其靶基因c-Myb轉錄增加,使得嗜中性粒細胞浸潤水平升高,引起抗炎細胞因子的釋放,進而減輕了小鼠的感染癥狀。

miR-466i-5p通過影響巨噬細胞的吞噬能力以及炎癥因子和抑炎因子的表達,調節(jié)肺組織中的細菌負荷及病理損傷。石萌萌等[23]研究發(fā)現(xiàn),間充質干細胞(mesenchymal stem cells,MSC)釋放的微粒(micro vesicles,MV)對多重耐藥銅綠假單胞菌(multiple-drug resistant pseudomonas aeruginosa,MDR-PA)肺炎具有治療作用。同時發(fā)現(xiàn)MSC釋放的MV中miR-466i-5p表達水平較高。將miR-466i-5p模擬物轉染至MSC中構建miR-466i-5p過表達的MSC MV,顯著降低了肺泡灌洗液中炎癥因子TNF-α、MIP-2及抑炎因子IL-10的表達水平,增強巨噬細胞的吞噬功能,降低了炎癥水平及細菌負荷,改善肺組織病理損傷。證實了MSC MV對MDR-PA肺炎的治療作用與其攜帶的miR-466i-5p有關。

(2)miRNA參與調控肺炎鏈球菌肺炎

肺炎鏈球菌(streptococcus pneumoniae,Sp)屬于革蘭氏陽性細菌,是上呼吸道常見的定植菌。由于肺炎鏈球菌肺炎在社區(qū)獲得性肺炎中的發(fā)病比率較高,加之當前所用的莢膜血清型疫苗存在缺點以及抗生素的耐藥日趨嚴重[24],迫切需要明確其免疫信號傳導機制,以為其提供新的預防和治療手段。

miR-155參與調節(jié)宿主對Sp感染的防御反應,且能夠增強巨噬細胞的吞噬能力。肺炎鏈球菌內肽酶O(endopeptidase O,PepO)是一種新發(fā)現(xiàn)并廣泛表達的肺炎球菌毒力蛋白,能通過腹膜滲出的巨噬細胞(peritoneal exudate macrophage,PEMs)增強Sp的吞噬作用[25]。Yao等[26]研究發(fā)現(xiàn)miR-155在PepO誘導的PEMs中表達上調。借助miRNA干擾技術,證實了PepO誘導的PEMs吞噬作用在用miR-155抑制劑轉染的細胞中減弱,而在用miR-155模擬物轉染的細胞中增強。同時驗證了miR-155的上調是由TLR2/NF-κB信號通路介導的。這些結果證實了miR-155在PepO誘導的PEMs中有助于增強巨噬細胞的吞噬作用以及宿主對Sp的防御反應。

miRNA-302參與調節(jié)肺泡上皮細胞的增殖,調控Sp感染小鼠的肺功能。Sp感染的小鼠對肺泡上皮細胞(alveolar epithelial cell,AEC)的損害是一個“損害-再生”的過程[27]。Sp對AEC先是造成了實質性損害,隨后引起AEC的緩慢再生。Wang等[28]研究發(fā)現(xiàn)在AEC再生的同時,miRNA-302在AEC中的表達升高。他們采用miR-302模擬物模擬的再生療法治療Sp感染小鼠,成功促進肺泡上皮祖細胞的增殖使AEC再生并修復受損的肺泡上皮,改善了Sp感染小鼠的肺功能,提高存活率。這些發(fā)現(xiàn)表明,基于miRNA模擬物的療法可以用作促進AEC再生并增強宿主從細菌性肺炎恢復的有效療法。為開發(fā)再生醫(yī)學治療微生物感染的療法開辟了一個領域。

3.1.2 miRNA參與病毒性肺炎的發(fā)生發(fā)展

病毒是導致社區(qū)獲得性肺炎的另一個重要原因,包括腺病毒、呼吸道合胞病毒、流感病毒、副流感病毒等都是易引起病毒性肺炎的病毒。另外,目前正在流行的新型冠狀病毒肺炎(COVID-19),以前流行的嚴重急性呼吸系統(tǒng)綜合征(SARS)、中東呼吸系統(tǒng)綜合征(MERS)都屬于病毒性肺炎的范疇。由于病毒一般為RNA結構,容易變異,病毒性肺炎的治療效果往往不如細菌性肺炎。當下爆發(fā)流行的新冠肺炎,再次提醒呼吸道病毒同樣是重癥肺炎病因的重要來源。目前,抗病毒藥物、免疫調節(jié)劑以及特定疫苗等是較為普遍的治療手段。除了針對病毒蛋白的抗病毒治療外,針對病毒感染所需的宿主編碼因子的治療,能夠有效降低病毒突變的幾率[29]。McCaskill等[30]在所有篩選的呼吸道病毒中,將多種miRNA模擬物或抑制劑轉染到A549細胞中,鑒定出了幾種能夠抑制病毒復制的miRNA。其中,miR-744,miR-124a和miR-24具有廣譜抗病毒活性,表明宿主體內的的抗病毒miRNA可以為控制病毒感染提供補充策略。

(1)miRNA參與調控腺病毒肺炎

腺病毒(adenovirus,Ad)感染是大多數(shù)嬰幼兒社區(qū)獲得性肺炎的病因,到目前為止,尚無有效的抗病毒藥物可用于Ad肺炎的治療,且Ad感染的診斷方式也十分有限[31]。miRNA與腺病毒復制和宿主免疫反應有關[32]。應用miRNA技術明確miRNA作用靶點有助于明確miRNA在調節(jié)宿主對腺病毒感染的反應中的作用,并豐富腺病毒感染致肺炎的診斷方式及治療方法。

miR-27a/b能夠通過抑制人突觸小體相關蛋白(SNAP25)和重組人硫氧還蛋白(TXN2)的表達抑制Ad感染。Machitani等[33]利用miRNA干擾技術在miR-27a/b模擬物轉染的細胞中,發(fā)現(xiàn)Ad基因組拷貝數(shù)減少了約80%,而用miR-27a/b抑制劑轉染后,Ad基因組的拷貝數(shù)大約增加了2.5~5倍。緊接著證實了SNAP25和TXN2是miR-27a/b的靶基因。這些結果表明,miR-27a/b通過轉錄后基因沉默抑制SNAP25和TXN2表達,進而抑制Ad進入細胞并引起細胞生長周期的停滯,從而實現(xiàn)對Ad感染的有效抑制,為Ad感染的治療提供了重要線索。

(2)miRNA參與調控合胞病毒肺炎

呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)是最常見的呼吸道病毒。研究發(fā)現(xiàn),miRNAs參與調控免疫細胞極化和白三烯(LTs)的合成,而改善免疫耐受可以顯著緩解RSV引起的氣道炎癥和支氣管痙攣[34]。miRNA可能成為檢測RSV感染的潛在生物標志物,甚至成為與RSV感染相關的反復性喘息或早期哮喘的干預及治療策略的新靶標。

miRNA參與調控RSV對宿主的持續(xù)性感染反應。許多病毒可以在宿主細胞中建立非溶細胞性慢性感染,這種病毒與宿主的長期寄生,使得宿主細胞持續(xù)性的產生感染性病毒,但卻可以逃避機體的防御,沒有感染的表征[35]。RSV也可以在其宿主細胞中建立持續(xù)性感染,且miRNA參與病毒調節(jié)宿主細胞對持續(xù)性感染的反應。Eilam-Frenke等[36]為了研究病毒與宿主細胞長期共存中miRNA的作用,建立了RSV持續(xù)感染的HEp-2+RSV-GFP細胞系,發(fā)現(xiàn)在Hep-2+RSV-GFP細胞中,miR-146a-5p的表達明顯上調,miR-345-5p,let-7c-5p和miR-221表達下調。因此,RSV持續(xù)性病毒感染誘導miRNA差異表達,miR-146-5p,miR-let-7c-5p,miR-221和miR-345-5p與病毒如何調節(jié)宿主細胞對感染的反應有關。

3.2 急性肺損傷/急性呼吸系統(tǒng)窘迫綜合征中的miRNA

急性肺損傷(ALI)/急性呼吸系統(tǒng)窘迫綜合征(ARDS)是繼發(fā)于非心源性疾病的嚴重呼吸系統(tǒng)疾病[37]。由于現(xiàn)代復蘇技術和危重疾病早期搶救水平的提高,雖然危重病人的早期死亡率降低,但是ALI/ARDS的發(fā)病率卻隨之增加。ALI/ARDS以彌漫性肺細胞損傷為基礎,以肺血管損傷所致的肺水腫和肺組織炎性細胞浸潤為其病理特征[38]。其發(fā)病機制復雜,尚未完全明確。目前認為巨噬細胞活化釋放大量炎癥因子是發(fā)病機制的關鍵[38]。當前臨床上尚無特效治療手段。

已有多項研究通過miRNA干擾技術反向驗證了相關miRNA參與ALI/ARDS炎癥反應過程,找到了相關炎癥信號轉導通路,進一步明確了其發(fā)病機制。miR-34b-5p在ALI的炎癥反應和細胞凋亡中起關鍵作用。Xie等[39]研究發(fā)現(xiàn)miR-34b-5p能通過靶向前顆粒蛋白(PGRN)來減輕LPS誘導的ALI小鼠模型中的肺損傷。通過體內靜脈注射miR-34b-5p拮抗劑可明顯抑制miR-34b-5p的上調,降低炎癥細胞因子的釋放,減少肺泡上皮細胞的凋亡,減輕肺部炎癥。進一步研究證實了miR-34b-5p/PGRN軸在ALI發(fā)病機理中的作用。此外,同樣利用miRNA干擾技術證實,miR-297通過靶向CDK8表達來影響NF-κB通路,減輕LPS誘導的小鼠肺部損傷[40];miR-216a通過調節(jié)JAK2/STAT3和NFκB信號傳導減輕LPS誘導的炎癥損傷[41]。

3.3 慢性阻塞性肺疾病中的miRNA

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)簡稱慢阻肺,是以進行性的氣流受限為主要特征的疾病,與氣道和肺組織對有害氣體或有害顆粒的異常慢性炎癥反應有關。其中,吸煙、環(huán)境中的有毒顆粒或氣體等是其發(fā)病的主要危險因素。作為一種典型的慢性氣道炎性疾病,對COPD的研究始終是該領域的熱點,而miRNA及miRNA干擾技術在COPD研究中的重要性更是得到了學者的認可。

香煙煙霧(cigarette smoke,CS)作為一種強烈的炎癥反應誘導劑可以通過許多機制來促進COPD的發(fā)生[42]。長期接觸香煙煙霧會引起支氣管上皮氧化應激和凋亡,這種持續(xù)存在的炎癥反應,是COPD重要的致病機制之一。

在吸煙引起毛細支氣管炎導致的COPD患者中,調節(jié)相關miRNA的表達水平可能是治療COPD的重要策略。有研究發(fā)現(xiàn)miR-218具有抗炎作用,抑制miR-218導致炎癥細胞計數(shù)上調。Xu等[43]利用miRNA干擾技術反向驗證了miR-218通過靶向TNFR1介導的NF-κB活化,調節(jié)CSE誘導的人黏蛋白5AC(human mucin 5 subtype AC,MUC5AC)過度生產而引起的炎癥反應。同樣Song等[44]證實了miR-218-5p通過調節(jié)BRD4信號通路減輕香煙提取物(cigarette smoke extract,CSE)誘導的人肺微血管內皮細胞(human lung microvascular endothelial cells,HPMEC)損傷。此外,Sun等[45]證實了miR-206通過調節(jié)Notch3和VEGFA信號通路關鍵蛋白caspase-3,caspase-9和Bcl-2。miR-206抑制劑可使通路關鍵蛋白活性降低,顯著逆轉CSE誘導的HPMEC細胞凋亡。

流行病學證據(jù)表明,COPD患者更易感受PM2.5的影響,吸入PM2.5后,COPD患者會出現(xiàn)嚴重的呼吸困難和肺功能下降[46]。在PM2.5引起的支氣管上皮損傷加重的COPD患者中,調節(jié)相關miRNA的表達水平可能是治療該COPD的潛在治療策略。Zhou等[47]發(fā)現(xiàn)在PM2.5-CSS處理的HBE中miR-194-3p表達水平顯著下降。miR-194-3p模擬物降低了DAPK1和caspase 3的裂解,從而抑制了暴露于PM2.5香煙煙霧中的HBEpiCs的凋亡。證明了PM2.5通過直接靶向DAPK1來下調miR-194-3p并加速香煙煙霧引發(fā)的支氣管上皮細胞的凋亡。

4 總結與展望

miRNA作為近年的研究熱點,在感染性肺炎、創(chuàng)傷性肺炎、慢阻肺等多種呼吸系統(tǒng)炎性疾病的發(fā)生發(fā)展、診斷治療以及預后判斷中起著不同作用,且miRNA干擾技術在特定炎癥信號傳導通路研究中更是發(fā)揮著不可或缺的作用。在以往的研究中miRNA更多的作為診斷或預后的生物標志物和治療靶點。隨著研究的深入,miRNA不僅作為疾病研究的關鍵分子,而且將作為研究關鍵通路節(jié)點的有力工具,以反向驗證的思路揭示系列科學問題,為肺炎信號轉導通路的機制研究提供更多的可能。也將為當下肆虐的新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)提供研究及治療的突破口[15]。