劉永芳吳正存馬開利

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院&北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院,醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所,昆明 650118;2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院&北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院,醫(yī)學(xué)靈長類研究中心&神經(jīng)科學(xué)中心,北京 100005)

帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是帕金森氏綜合征廣泛運(yùn)動障礙中最常見的形式,以步態(tài)不穩(wěn)、肌肉僵直、運(yùn)動遲緩、靜止性震顫為特征。新的診斷標(biāo)準(zhǔn)將姿勢不穩(wěn)排除在外。目前,全球PD患病人數(shù)超過六百萬,65歲以上人群發(fā)病率大約為1.5%[1],中國占全球發(fā)病人數(shù)的一半。據(jù)統(tǒng)計(jì),隨著人口老齡化,截至2030年,全球50歲以上發(fā)病率將會增加一倍[2]。已有研究表明,PD的病理改變主要是中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的進(jìn)行性丟失、紋狀體多巴胺神經(jīng)遞質(zhì)的減少以及α突觸核蛋白包涵體的形成。臨床上,PD患者確診時已經(jīng)是疾病的中晚期,丟失了50%~60%多巴胺能神經(jīng)元和60%~70%的多巴胺能神經(jīng)遞質(zhì),大多出現(xiàn)運(yùn)動癥狀,晚期伴有疼痛和抑郁,嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。而疾病早期,多數(shù)患者會出現(xiàn)便秘、嗅覺障礙、睡眠障礙等非運(yùn)動癥狀[3]。在確診之前,這些非運(yùn)動癥狀往往并不會和PD聯(lián)系起來。目前,PD的治療藥物以多巴胺前體藥物左旋多巴和多巴胺受體激動劑為主,但隨著服用時間的延長,這些藥物的療效會逐漸減弱,并會引起藥物引發(fā)的震顫[4]。近些年來,非侵入性的深部腦刺激療法取得了良好的效果,可以緩解患者的疼痛,干細(xì)胞療法也開始走向臨床。但這些治療手段的發(fā)現(xiàn)和評價都離不開動物模型的建立,一個最接近臨床PD患者發(fā)病過程和病理變化的動物模型將有利于PD的發(fā)病機(jī)制、診斷、治療方法以及藥物篩選的研究。

嚙齒動物已經(jīng)廣泛用于建立PD模型,而非脊椎動物,如果蠅、線蟲、斑馬魚,由于其神經(jīng)元數(shù)量少,便于操作,可進(jìn)行藥物高通量篩選,也常用于PD模型的建立。非人靈長類(non-human primate,NHP),在進(jìn)化上與人類關(guān)系更近,大小、行為、生理、生化、免疫功能方面與人類更相似,更適合用于模擬人類疾病模型。最常用來建立PD模型的NHP有狨猴和獼猴。猴子具有一定的學(xué)習(xí)、認(rèn)知、情緒、社交能力[5]。這使得相比較于嚙齒動物和豬,猴子更便于測試精細(xì)運(yùn)動和非運(yùn)動癥狀。猴腦和人腦的高度相似使得能用磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI)和正電子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層顯像(positron emission tomography,PCT)對大腦結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行非侵入性高分辨率成像。這些證據(jù)均表明NHP是更適合研究PD的動物,因此,本文通過總結(jié)和闡明PD的NHP模型研究現(xiàn)狀,為基于NHP的PD模型的藥物評價及機(jī)制研究提供參考和依據(jù)。

1 神經(jīng)毒素誘導(dǎo)模型

1.1 MPTP模型

MPTP,全稱1-甲基-4苯基-1,2,3,6-四氫吡啶,其可通過血腦屏障,被膠質(zhì)細(xì)胞膜上的單胺氧化酶B(monoamine oxidase B,MAO-B)代謝為1-甲基-4-苯基吡啶離子(1-methyl-4-phenylpyridine ion,MPP+),后者可由多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體(dopamine transporter,DAT)轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi),與線粒體復(fù)合物Ⅰ結(jié)合,損傷氧化呼吸鏈,選擇性損傷多巴胺能神經(jīng)元[6]。因此,MPTP是最常用的制備PD模型的神經(jīng)毒素。不同獼猴物種對MPTP的敏感性不同,同一物種間不同猴子個體敏感性也有差異。食蟹猴和恒河猴同屬于獼猴。食蟹猴對MPTP的敏感性強(qiáng)于恒河猴[7]。Potts等[7]通過回顧108只獼猴靜脈注射MPTP的方案,給出建議:①單次MPTP注射后,3~8周內(nèi)運(yùn)動障礙會自發(fā)恢復(fù),因此建議最后一次MPTP注射后,至少8周內(nèi)每周進(jìn)行一次癥狀評估;②多次低劑量注射MPTP,可以減少并發(fā)癥的發(fā)生;③可根據(jù)動物的行為學(xué)調(diào)整MPTP劑量,直到出現(xiàn)“明顯運(yùn)動障礙”為止。在靜脈注射MPTP的方案中,猴子雖能保持相對穩(wěn)定的癥狀,但仍然不能模擬PD慢性發(fā)生的過程。Seo等[8]在此基礎(chǔ)上作了改進(jìn),建立起一個穩(wěn)定的慢性NHP帕金森模型:一周兩次小劑量(0.2 mg/kg),左股骨區(qū)肌肉注射給藥,給藥48周后,模型猴的紋狀體和黑質(zhì)TH陽性神經(jīng)元明顯丟失,同時還發(fā)現(xiàn)模型猴中的T淋巴細(xì)胞慢性浸潤到了腦部。類似的,Masilamoni等[9]采用慢性MPTP給藥方案(0.2~0.5 mg/kg,肌肉注射,一周一次,持續(xù)21周),在猴子模型中重現(xiàn)了PD病人大腦中多巴胺能神經(jīng)元退變的模式。另有團(tuán)隊(duì)采用前17周每周一次肌肉注射給予0.2 mg/kg劑量的MPTP,后4周調(diào)整為0.5 mg/kg的給藥方案,也建立出了穩(wěn)定的獼猴帕金森模型[10]。慢性給藥方案中,模型猴中腦腹側(cè)神經(jīng)元丟失多于背側(cè),而急性方案中腹側(cè)和背側(cè)丟失情況差不多。頸靜脈注射所需要的MPTP劑量一般會比皮下給藥的劑量要小。一周一次0.5 mg/kg MPTP皮下注射狨猴,總劑量2.5 mg/kg和6 mg/kg時,并未發(fā)現(xiàn)腦部明顯的病理變化,行為學(xué)也不明顯并且還發(fā)生恢復(fù)[11-12]。皮下連續(xù)給予MPTP,似乎能有更好的PD癥狀和病理表現(xiàn)。采用連續(xù)3 d分別2 mg/kg、2 mg/kg、1 mg/kg皮下注射的給藥方法,模型猴的左右兩側(cè)大腦損傷程度不一致,行為學(xué)特征持續(xù)了1年以上[13]。

老年猴通常比青年猴更易感。老年恒河猴單側(cè)給予MPTP,可誘導(dǎo)出中度帕金森癥狀。5~9歲恒河猴所需要的MPTP劑量是20~23歲猴的三倍[14]。普遍認(rèn)為,老年動物可能更能模擬PD病人的實(shí)際情況,但也存在不同看法。Shi等[15]發(fā)現(xiàn)給老年恒河猴0.2 mg/kg劑量肌肉注射MPTP,第1次連續(xù)注射15 d,間隔8周后,第2次連續(xù)注射30 d,期間模型猴病情變化不可控,于是采用青年恒河猴分兩段給予MPTP:肌注+靜脈注射,呈現(xiàn)了穩(wěn)定的運(yùn)動和非運(yùn)動癥狀[16]。以往的MPTP模型研究中,大多檢測到猴子腦中有α突觸核蛋白(αsynuclein,α-syn)沉積,但沒有發(fā)現(xiàn)磷酸化的α-syn聚集體。但近幾年有研究者將MPTP給予恒河猴后,發(fā)現(xiàn)可產(chǎn)生p-α-syn和路易病理,但無法重現(xiàn)特發(fā)性PD尾狀核-殼核漸變的特征[17]。NHP的MPTP模型總結(jié)見表1。

表1 非人靈長類MPTP模型總結(jié)Table 1 Summary of MPTP NHP model

1.2 6-OHDA模型

6-OHDA,中文名稱6-羥多巴胺,是一種多巴胺(dopamine,DA)類似物,可競爭性抑制DAT對DA的攝取,進(jìn)入細(xì)胞后可抑制線粒體復(fù)合物Ⅰ和線粒體復(fù)合物Ⅳ的活性。6-OHDA不能通過血腦屏障,一般需要進(jìn)行腦立體定位注射。對猴腦要進(jìn)行多點(diǎn)注射,以保證藥物的均勻分布和減少自發(fā)恢復(fù)的發(fā)生。DA神經(jīng)遞質(zhì)的丟失、行為學(xué)的改變與6-OHDA劑量呈正相關(guān)性。關(guān)于6-OHDA關(guān)注的一個問題是注射部位的選擇。研究人員將180~216 μg的6-OHDA多點(diǎn)注射到狨猴的皮層和尾狀核進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)二者引起注意力發(fā)展方向不同[18]。單側(cè)注射到狨猴紋狀體內(nèi),5月后病變側(cè)DA能神經(jīng)元丟失46%,運(yùn)動功能和感覺功能出現(xiàn)異常[19];注射到黑質(zhì),能引起多巴胺能神經(jīng)元丟失80%,非多巴胺能神經(jīng)元丟失77%,猴子出現(xiàn)姿勢改變,記憶障礙[20]。有人認(rèn)為,單側(cè)模型并不能完全模擬PD的癥狀。2004年,Milton等[21]發(fā)現(xiàn)左側(cè)注射的PD模型猴子表現(xiàn)出空間和運(yùn)動癥狀的單方面缺陷,而雙側(cè)注射的PD模型可能表現(xiàn)出雙側(cè)的精神障礙。2015年,Santana等[22]分兩個階段對狨猴內(nèi)側(cè)前腦束5個位點(diǎn)進(jìn)行腦立體定位注射6-OHDA,總劑量為120 μg,發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生了持續(xù)的帕金森癥狀。另外研究采用靜脈注射的給藥方式,以50 mg/kg劑量全身應(yīng)用6-OHDA,引起了心臟交感神經(jīng)去支配[23]、炎癥、氧化應(yīng)激、PPARγ激活[24]、近端結(jié)腸兒茶酚胺損失[25]。

2 轉(zhuǎn)基因模型

目前已有的PD轉(zhuǎn)基因模型主要基于α突觸核蛋白野生型及其A53 T突變型(第53位氨基酸由丙氨酸突變?yōu)樘K氨酸)。同時,利用病毒載體局部或全身過表達(dá)制作轉(zhuǎn)基因動物的方式,因方便、快捷而受到科研人員的青睞,并且,有效病毒載體遞呈系統(tǒng)及高效的遞送方式的選擇是轉(zhuǎn)基因動物成功的關(guān)鍵。

2.1 遞呈系統(tǒng)的選擇

目前,常用的轉(zhuǎn)基因制備的病毒載體有腺相關(guān)病毒(adeno-associated viral vector,AAV)和慢病毒(lentivirus,LV)。

2.1.1 AAV病毒系統(tǒng)

AAV是單鏈DNA病毒,包裝容量大約4.7 kb,對外源基因的表達(dá)能力中等。因其不整合到宿主基因組中,因此目的基因可能在宿主傳代的過程中丟失。目前共發(fā)現(xiàn)12種血清型(AAV1-AAV12),不同血清型對組織的特異性不同。神經(jīng)領(lǐng)域使用較多的血清型有2、5、8、9型。AAV2型主要針對神經(jīng)系統(tǒng);AAV5型針對肺、眼、神經(jīng)系統(tǒng);AAV8型針對肝、肌肉、眼、神經(jīng)系統(tǒng);AAV9型針對肺、肝、肌肉、心臟和神經(jīng)系統(tǒng),且AAV9型在NHP腦部軸突中可以進(jìn)行雙向運(yùn)輸[26]。運(yùn)用失去復(fù)制能力的AAV假病毒已成為趨勢,尤其是以2型為核心,其他型為衣殼蛋白的血清型病毒。Allocca等[27]發(fā)現(xiàn)AAV2/5型載體可容納的基因組可擴(kuò)大到8.9 kb。Gerits團(tuán)隊(duì)比較了不同血清型和不同啟動子下報告基因在恒河猴新皮層的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率,發(fā)現(xiàn)鈣調(diào)蛋白激酶II(CaMKIIα0.4)啟動子下,病毒的傳播效率為:rAAV2/5>>rAAV2/7>rAAV2/8>rAAV2/9>>rAAV2/1,轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的比例為:rAAV2/1>rAAV2/5>rAAV2/7=rAAV2/9>rAAV2/8[28]。與嚙齒動物不同,通用巨細(xì)胞病毒(cytomegalovirus,CMV)啟動子在恒河猴腦中效果最差。而另一研究組給6只獼猴右殼核和同側(cè)內(nèi)囊注入相同劑量的病毒,發(fā)現(xiàn)rAAV2/1、rAAV2/2和rAAV2/5在大腦中的總體擴(kuò)散沒有顯著差異。而在大腦和遠(yuǎn)端神經(jīng)元結(jié)構(gòu)(脊髓和周圍神經(jīng))中,rAAV2/1和rAAV2/5在每個細(xì)胞中的載體拷貝數(shù)高于rAAV2/2[29]。利用AAV2/9遞送基因發(fā)現(xiàn),無論動物年齡,轉(zhuǎn)導(dǎo)的最主要的細(xì)胞類型都是星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞。據(jù)此,綜合考量與實(shí)際案例來看[30-32],目前,AAV2/5型和AAV2/9型可能更適合作為PD造模的血清型,AAV2/1也可作為參考。

2.1.2 LV病毒

LV是一種由人免疫缺陷病毒改造而來的單鏈RNA病毒,包裝容量<9 kb,能隨機(jī)整合在宿主基因組中。2001年,美國科學(xué)家將滅活的慢病毒注射進(jìn)獼猴體外受精的胚泡中,制備了第一只攜帶綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的轉(zhuǎn)基因猴“安迪”,但綠色熒光蛋白基因并不在其生殖細(xì)胞中表達(dá)[33]。2008年,Yang等[34]在4~8細(xì)胞期的胚胎中注射攜帶亨廷頓基因的高滴度的慢病毒,第一個亨廷頓恒河猴模型誕生,但至此,尚未證明基因能向后代傳遞。2009年,日本科學(xué)家將滅活的5.6×109~5.6×1011/mL滴度的EGFP-慢病毒注射到狨猴最早時期的胚胎中,EGFP在狨猴后代中多個器官中表達(dá),實(shí)現(xiàn)了種系的傳遞[35]。

2.2 遞送方式

2.2.1 局部注射

在NHP中,腦立體定位普遍針對黑質(zhì)和紋狀體,而未見有報道直接采用腦室注射。2003年,Kirik等[30]率先用AAV2型載體通過腦立體定位注射的方式向黑質(zhì)內(nèi)遞送野生型及A53T突變型的αsyn,16周后發(fā)現(xiàn)A53T突變引起30%~60%的黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元丟失,存活的黑質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞中90%~95%的細(xì)胞有陽性α-syn包涵體。利用rAAV2/5型載體在成年猴腹側(cè)中腦中表達(dá)人野生型α-syn,然而神經(jīng)變性僅局限于尾狀核多巴胺能神經(jīng)纖維[31],并且他們還證實(shí)過表達(dá)人A53T能導(dǎo)致黑質(zhì)多巴胺能細(xì)胞死亡[36]。這證明A53T毒性強(qiáng)于野生型α-syn。Koprich等[32]利用AAV2/1型載體讓黑質(zhì)內(nèi)過表達(dá)α-syn A53T突變體發(fā)現(xiàn)病毒滴度為1.7×1012時沒有顯著性的病理變化;而當(dāng)?shù)味冗_(dá)到5.1×1012時黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元減少50%,紋狀體多巴胺減少60%,且病毒表達(dá)持續(xù)至少4個月。這些證據(jù)表明,成年猴腦立體定位注射AAV載體可以實(shí)現(xiàn)局部的目的基因表達(dá),并能表現(xiàn)出一定的相關(guān)表型,且可通過調(diào)整病毒滴度來控制目的基因的表達(dá)量。

除了腦立體定位外,為了探究α-syn從腸道逆行傳播到大腦的假說,Manfredsson等[37]將AAV2/5-CBA-α-syn注射到結(jié)腸和胃,發(fā)現(xiàn)腸神經(jīng)系統(tǒng)明顯的α-syn病理,但猴子腦中并沒有任何病理出現(xiàn)。

2.2.2 全身給藥

(1)成體全身給藥

為了提高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率,近幾年開始不斷嘗試宮內(nèi)感染、出生后進(jìn)行靜脈注射或鞘內(nèi)給藥。2003年,Garrett等[38]將rAAV2-GFP注射進(jìn)羊膜囊,72 h后開始表達(dá)和分泌GFP,并且維持了1年以上。rAAV2/9靜脈注射能通過血腦屏障,并長期表達(dá)。獼猴圍生期后期,研究人員將scAAV9-CMV-eGFP通過臍靜脈注射進(jìn)兩只獼猴胎兒,病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)到了中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)[39]。同時,給P1、P30、P90、3歲的食蟹猴靜脈注射rAAV2/9-GFP,發(fā)現(xiàn)成年猴子比年輕猴子轉(zhuǎn)導(dǎo)效率低[40]。這些數(shù)據(jù)表明,幼年比成年神經(jīng)元更容易受到病毒感染。AAV9型病毒鞘內(nèi)給藥也可以實(shí)現(xiàn)基因的持續(xù)表達(dá),長達(dá)4年[41]。

(2)卵母細(xì)胞或胚胎時期注射

相比于胎兒或新生兒,更早的時間點(diǎn)還可以選擇卵母細(xì)胞或胚胎前期。Niu等[42]以109/mL滴度的人A53T突變型慢病毒遞送至MⅡ期恒河猴卵母細(xì)胞,之后進(jìn)行體外受精(in vitrofertilization,IVF)和胚胎植入,成功制作6只A53T轉(zhuǎn)基因猴,進(jìn)一步檢測證實(shí)A53T突變基因在全身器官中表達(dá),并出現(xiàn)了年齡相關(guān)的認(rèn)知缺陷和焦慮,并且A53T突變的猴腦比鼠腦具有更廣泛的神經(jīng)變性。其中,值得注意的是,注射時機(jī)的選擇對轉(zhuǎn)基因猴組織表達(dá)的廣泛性具有重要的作用。2016年,Seita團(tuán)隊(duì)用帶人類巨細(xì)胞病毒即刻早期增強(qiáng)子和雞β肌動蛋白啟動子的GFP慢病毒表達(dá)載體注射食蟹猴,產(chǎn)生了全身表達(dá)GFP的轉(zhuǎn)基因猴[43],但發(fā)現(xiàn)向受精前的成熟卵母細(xì)胞注射LV表達(dá)系統(tǒng),可在組織中實(shí)現(xiàn)均勻的GFP表達(dá),而向受精卵中注射病毒則產(chǎn)生鑲嵌表達(dá)的轉(zhuǎn)基因猴。2017年,Tomioka團(tuán)隊(duì)報道,他們使用四環(huán)素誘導(dǎo)的慢病毒載體表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生了新型的轉(zhuǎn)基因猴[44]。

3 基因編輯技術(shù)

基因編輯技術(shù),如鋅指核酸酶(zinc-finger nucleases,ZFN)、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases,TALENS)、成簇的規(guī)則間隔的短回文重復(fù)序列(clustered regularly interspersed short palindromic repeats,CRISPR),可以實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)編輯。ZFN是第一個可編程的核酸酶。1996年,有報道將模塊鋅指蛋白(zinc finger protein,ZFP)與Fokl限制酶非特異切割域融合,ZFN由此產(chǎn)生。Folk核酸酶必須二聚體才具有切割功能。ZFP由包含結(jié)合鋅原子的半胱氨酸和組氨酸對的30個氨基酸殘基組成,即ZF基序,每個ZF基序識別3~4 bp的序列,通過將α螺旋插入DNA大溝來與DNA結(jié)合。與ZFN類似,將來源于植物病原體的TAL效應(yīng)子模塊融合到Folk切割域上,稱作TALENS。TALENS制作核酸酶的方式更簡單。CRISPR/Cas是細(xì)菌免疫系統(tǒng)的一部分,這個技術(shù)被分為兩部分:單個指導(dǎo)RNA(single guide RNA,sgRNA)和一個Cas核酸內(nèi)切酶。最常用的Cas核酸內(nèi)切酶是Cas 9。ZFN成本高,效率低;TALENS效率高、脫靶率低、構(gòu)建周期短;Cas 9效率是TALENS的5倍,實(shí)際操作更簡單。

目前,這幾種技術(shù)在哺乳動物中都有一定的應(yīng)用,但在帕金森猴中的應(yīng)用仍極為有限。近幾年,日本科學(xué)家Coghlan等[45]通過基因組編輯技術(shù)突變了狨猴的SNCA基因,產(chǎn)生了第一只帕金森狨猴模型,狨猴在第一年出現(xiàn)睡眠障礙,第二年腦干出現(xiàn)路易病理,第三年發(fā)生震顫。2019年,國內(nèi)學(xué)者楊偉莉等[46]使用CRIPSR Cas9技術(shù)生成了第一只PINK1敲除猴,其皮層、紋狀體、黑質(zhì)出現(xiàn)顯著神經(jīng)元退性?；蚓庉嬘兄鴱?qiáng)大的應(yīng)用前景,但基因編輯技術(shù)難度高,仍存在脫靶、鑲嵌表達(dá)模式、低同源重組的缺點(diǎn),仍面臨要攻關(guān)很多問題。

4 PFF模型/LB模型

路易小體(Lewy bodies,LB)是PD的病理性標(biāo)志,而LB中主要成分為淀粉樣纖維聚集體,α-syn是其中含量最高的成分[47]。于是α-syn聚集體和PD的關(guān)系令人著迷。現(xiàn)在普遍認(rèn)為α-syn單體和規(guī)則整齊的纖維是無毒的,而寡聚體和形成纖維之前的原纖維(preformed fibrils,PFF)是有毒的形式。其PFF的制備已經(jīng)有一定的基礎(chǔ)和成形的方案,而寡聚體的制備仍然存在難度。將制備的α-syn PFF注射進(jìn)猴子體內(nèi)的確產(chǎn)生了PD病理。Shimozawa等[48]向成年狨猴紋狀體內(nèi)注射α-syn PFF,三月后,α-syn S129磷酸化免疫反應(yīng)檢測陽性,而且α-syn從紋狀體向黑質(zhì)擴(kuò)散,誘發(fā)了PD樣α突觸核蛋白病理,這是第一個狨猴α-syn傳播模型。有團(tuán)隊(duì)向獼猴腸道接種α-syn PFF,1個月后,在迷走神經(jīng)和藍(lán)斑背側(cè)運(yùn)動核檢測到少量的病理性α-syn,研究持續(xù)12個月后,腸神經(jīng)系統(tǒng)仍有穩(wěn)定病理性的α-syn,而腦組織中卻并未發(fā)現(xiàn)[37],這說明α-syn從外周傳遞到中樞可能只是偶然事件。

將PD患者腦中提取的LB接種到猴子黑質(zhì)或紋狀體內(nèi),也可以引起α-syn病理和神經(jīng)退行性病變[49]。最近,Arotcarena等[50]向狒狒的紋狀體或腸道注射PD患者來源的α-syn聚集體,然而迷走神經(jīng)中并未發(fā)現(xiàn)α-syn病理學(xué)的改變,該研究同樣不支持通過迷走神經(jīng)和背側(cè)運(yùn)動核傳遞α-syn的假說。

5 討論

NHP的生命周期較長,這使得我們有機(jī)會來觀察造模過程中的病理變化。目前,MPTP模型是PD模型的金標(biāo)準(zhǔn)。神經(jīng)毒物模型方法簡單,易操作,病理變化一般與劑量呈正相關(guān)。由于人類對MPTP極其易感,所以使用MPTP對實(shí)驗(yàn)室和操作人員要求較高,防止造成MPTP泄露。而6-OHDA不能通過血腦屏障,多采取一次腦立體定位注射,相對安全很多。而神經(jīng)毒物造成的傷害一般比較直接,一般沒有報道有路易小體的形成,且容易錯過PD前期的發(fā)病過程。因此,推薦低劑量、長時間給藥。轉(zhuǎn)基因模型通常有一定難度。合格的轉(zhuǎn)基因模型應(yīng)該具備以下特征:①基因能整合到宿主基因組中;②基因能表達(dá)且有生物活性;③種系傳遞[51]。因?yàn)?AAV并未整合在基因組中,所以,AAV載體遞送的基因在猴子傳代的過程中可能會發(fā)生丟失。另外,研究顯示小鼠腦中pα-syn水平與黑質(zhì)紋狀體變性程度有關(guān),而與小鼠不同的是,猴子的p-α-syn水平與神經(jīng)變性之間沒有相關(guān)性[52]。值得注意的是,猴子本身的α-syn就含有A53T突變,所以,猴子體內(nèi)過表達(dá)α-syn A53T突變的蛋白是否能代表人體內(nèi)的A53T突變表型有待考證。CRISPR技術(shù)與其他基因編輯技術(shù)相比,可以實(shí)現(xiàn)對特定的基因位點(diǎn)進(jìn)行編輯,成本也降低,但操作難度大,仍存在脫靶的問題。然而,轉(zhuǎn)基因模型可以從基因水平來研究疾病機(jī)理,有神經(jīng)毒物模型不能替代的優(yōu)點(diǎn)。路易小體是PD患者腦中標(biāo)志性的病理,而α-syn作為其中主要的成分,被認(rèn)為PFF形式是有毒的,現(xiàn)在也有人認(rèn)為寡聚體毒性更強(qiáng)。重組α-syn PFF模型也重現(xiàn)了PD中多巴胺能神經(jīng)元丟失的特征,但其PFF制備的質(zhì)量通常不穩(wěn)定。PD患者腦中提取的LB產(chǎn)物成分更為復(fù)雜,達(dá)到70多種,不同人員,以及每一批次之間成分的差異可能會導(dǎo)致結(jié)果的變異。

6 小結(jié)

總之,即使NHP也有一定的缺陷,但仍然是與人類最接近的動物,在研究疾病機(jī)理、藥物臨床前安全性評價上仍然具有不可替代的作用,但由于倫理原因,要嚴(yán)守3R原則,只在必要的時候使用NHP。

續(xù)表1