任李俊，韓帥琪，胡建宏

(1.白水縣同羊原種場，陜西 白水715600；2.西北農(nóng)林科技大學(xué))

隨著我國社會經(jīng)濟(jì)的不斷向前發(fā)展、人民的生活質(zhì)量也在逐步提升，這使得人們對于優(yōu)質(zhì)肉、奶、蛋產(chǎn)品的需求也越來越高。市場的巨大需求也促使我國畜牧業(yè)的生產(chǎn)方式以及產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)發(fā)生重大變化，由傳統(tǒng)的小規(guī)模、散養(yǎng)戶養(yǎng)殖方式逐漸向集約化、規(guī)?；默F(xiàn)代舍飼飼養(yǎng)轉(zhuǎn)變。同時，伴隨著規(guī)?；?、現(xiàn)代化養(yǎng)殖方式的推廣，人工授精技術(shù)也開始在畜牧生產(chǎn)中扮演一個越來越重要的角色。相比與常溫或低溫保存下的精液，冷凍保存的精液保存的時間更長，使得優(yōu)良種公畜精液的長距離的運(yùn)輸成為可能，擴(kuò)大了優(yōu)質(zhì)精液的使用范圍，提高了優(yōu)秀雄性遺傳資源的利用率，并且加快了良種后代育種和擴(kuò)繁的速度。因此，家畜精液的冷凍保存技術(shù)的研究對于畜牧業(yè)的發(fā)展具有十分重要的意義。

哺乳動物的細(xì)胞膜富含多不飽和脂肪酸，其極易遭受細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)的攻擊從而發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。在精液冷凍保存時，精子不斷進(jìn)行能量代謝產(chǎn)生ROS。死亡和損傷的精子則可以產(chǎn)生更多ROS。精液中存在的低含量ROS能夠作為一種信號傳遞物質(zhì)，調(diào)節(jié)精子正常生理生化水平。然而當(dāng)濃度超過一定范圍時，ROS會首先作用于精子質(zhì)膜上的磷脂，對精子質(zhì)膜造成過氧化損傷，從而破壞精子的正常生理功能；ROS 還可以對精子細(xì)胞核中的DNA 結(jié)構(gòu)造成破壞，使得精子發(fā)生凋亡；此外，ROS 可降低精子質(zhì)膜和胞內(nèi)酶的活性或者造成酶失活，使ROS大量聚集導(dǎo)致一種不良循環(huán)，使精子氧化損傷而死亡。目前，常通過在稀釋液中添加抗氧化劑來達(dá)到防止精子質(zhì)膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，減緩精子細(xì)胞的氧化損傷的目的，以期得到最佳的保存效果。

1 酶類抗氧化劑

目前，實(shí)際生產(chǎn)中常使用過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)及谷胱甘肽過氧化氫酶(GSH-Px)等作為精液冷凍稀釋液中的酶類抗氧化劑。精液中添加高活性及高含量的SOD、CAT、GSH和GSH-Px可以顯著提高冷凍保存的精液的品質(zhì)。Leao等研究表明，盡管CAT對稀釋或冷凍-解凍后的精液的任一評估參數(shù)都不產(chǎn)生影響，但仍能發(fā)現(xiàn)在精液冷凍稀釋液中加入50 μg/mL CAT有利于維持冷凍保存中精液的質(zhì)膜完整性，完整率可達(dá)62.35%。Olfati等則通過研究向牛精液冷凍稀釋劑中添加不同濃度GSH×SOD組合對解凍后荷斯坦牛和西門塔爾牛精液品質(zhì)的影響，發(fā)現(xiàn)荷斯坦牛精液中MDA水平降低而GPx活性增加，西門塔爾牛精液中SOD活性升高，這表明精液稀釋液中添加抗氧化劑組合(GSH × SOD)能夠提升凍融后精液的品質(zhì)，這可能與脂質(zhì)過氧化被抑制以及抗氧化酶活性得到提升有關(guān)。Silva等研究表明，稀釋液中添加100 U/mL SOD以及2 mM和5 mM GSH均能夠保持公羊精子在凍融后的頂體的完整，而向Tris卵黃稀釋之中添加100 U/mLSOD則能夠維持解凍后的精子細(xì)胞膜的完整性。

2 維生素類抗氧化劑

氧化應(yīng)激和冷休克是精子細(xì)胞在進(jìn)行冷凍保存的過程中最容易受到的兩大危害，都會導(dǎo)致精子凍融后出現(xiàn)活力降低的現(xiàn)象。維生素E(VE)是生物體內(nèi)重要的抗氧化物質(zhì)，能夠抑制氧化自由基的形成，阻止精子細(xì)胞脂質(zhì)層過氧化反應(yīng)的發(fā)生。同時，還具有卵黃的功能，防止冷休克的發(fā)生，特別是與環(huán)糊精配合使用時，可以調(diào)節(jié)精子在凍融過程中的氧化應(yīng)激，提高精子活率。Khellouf等研究表明，在牛精液低溫保存的過程中，可以通過預(yù)先向膽固醇和VE中加入環(huán)糊精來作為一種強(qiáng)效保護(hù)劑，以降低冷休克和氧化應(yīng)激的發(fā)生，最終達(dá)到提高凍融后精子的運(yùn)動能力和質(zhì)膜完整性的目的。而Hu等研究發(fā)現(xiàn)，相比于其他濃度，在稀釋液中加入1.0和1.5 mg/mL VE時，精液品質(zhì)的評估參數(shù)如VSL和STR值等會顯著提高，而且當(dāng)精液樣品添加1.5 mg/mL VE時其中的GSH-Px可達(dá)最高，使得頂體與質(zhì)膜完整率得到明顯的提升，從而降低了發(fā)生脂質(zhì)過氧化的可能性，改善了凍融后的精子活力和生存能力。Zhao等研究發(fā)現(xiàn)，VC和VE的組合也可以提高精液內(nèi)的抗氧化酶活性，其中對于精子品質(zhì)保護(hù)效果最好的組合是添加1400 IU/mL的VC以及0.12 IU/mL的VE。此外Varo-Ghiuru等通過研究發(fā)現(xiàn)，解凍后精子的活力在濃度為10 μM的葉黃素、200 μM的奎諾二甲基丙烯酸酯、200 μM的VC以及濃度范圍為400～200 μM的Trolox和抗壞血酸的作用下能夠更強(qiáng)，并且10 μM葉黃素可提高凍融后的NAR和HOST值。

3 植物提取物抗氧化劑

新近研究發(fā)現(xiàn)，某些植物中提取的活性物質(zhì)例如海帶多糖、海藻糖、白藜蘆醇等也具有抗氧化，清除氧自由基的能力，可以作為一種常用的抗氧化物質(zhì)使用到精液冷凍保存的過程中以減緩或消除氧化對精子的損傷。提取與多種植物的皮、殼、籽、核、花中的原花青素是一類生物類黃酮，也是一種的天然抗氧化劑，具有極強(qiáng)的抗氧化、清除自由基和活性氧的能力。Li等發(fā)現(xiàn)，BTS稀釋液中的精液隨著寡聚原花青素的加入其MDA和ROS含量在降低，而總抗氧化能力(T-AOC)得到了顯著提高，精液質(zhì)量也隨之提升。Zhu等通過研究檸檬酸-葡萄糖稀釋液中添加不同濃度海藻糖的對兔精液的影響，發(fā)現(xiàn)添加100 mM海藻糖時效果最好。解凍后的兔子精子活力、頂體完整性、膜完整性等得到了明顯的改善，而ROS水平和MDA含量也顯著降低。Bucak等則發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，在稀釋劑中添加50 mM海藻糖、25 mM?；撬帷?.0和10 mM半胱胺能夠使凍融后精子的活率得到明顯改善；維生素E的水平也得到明顯提高。另外，Akhtarshenas等還發(fā)現(xiàn)當(dāng)稀釋液中添加10 μM抗蛋白酶和30和60 mM海藻糖時，二者能夠產(chǎn)生協(xié)同作用，顯著提高了精液冷凍保存效果。

4 二甲雙胍的氧化作用

二甲雙胍(metformin)是一類天然的胍類衍生物，來源于法國紫丁香(French Lilac即山羊豆(Galega officinalis Linn)。早在中世紀(jì)時期，歐洲就有了使用山羊豆的地上部分來緩解糖尿病患者多尿癥狀的先例，同時畜牧業(yè)中也使用其來進(jìn)行生物催乳。20世紀(jì)20年代，Tanret與Muller從山羊豆種子中提取出山羊豆堿并進(jìn)行了初步研究，表明山羊豆堿有著降血糖的效果。20世紀(jì)20年代至50年代期間，許多的胍類衍生物被先后開發(fā)出來，包括十烷雙胍和十二烷雙胍等，但此類物質(zhì)的毒副作用一直是一個無法消除的問題。1922年，二甲雙胍被愛爾蘭化學(xué)家Werner和Bell首先制備得到。數(shù)年后，人們經(jīng)動物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了其無毒無害。與此同時胰島素被發(fā)現(xiàn)及廣泛使用，這使得雙胍類制劑的應(yīng)用研究也就停止不前。1957年，隨著二甲雙胍首次在臨床上使用，雙胍類制劑再次重回人們的視野。不久，苯乙雙胍和丁雙胍被發(fā)現(xiàn)并被允許作為一種治療糖尿病的藥物使用。由于苯乙雙胍被發(fā)現(xiàn)毒副作用且致死率很高、丁雙胍治療效果較差，隨后兩者又相繼被停用。此后二甲雙胍被人們?nèi)找嬷匾暡V泛使用至今現(xiàn)在。

二甲雙胍在抗氧化領(lǐng)域具有良好的效果。Michael等發(fā)現(xiàn)可以通過向冷凍稀釋液中添加50 μM二甲雙胍的方式來提升小鼠精子的抗氧化性，提高其受精能力。Nguyen等的研究結(jié)果顯示在雞精液冷凍稀釋視液中添加1 mM二甲雙胍可以顯著提高精子凍融后的品質(zhì)，并且精子活力可達(dá)58.8%。Grandhaye等則研究發(fā)現(xiàn),二甲雙胍還能夠通過影響線粒體功能的方式來抑制精子的氧化應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而提升解凍后犬精液的品質(zhì)。