李世鳳

(民樂縣畜牧獸醫(yī)工作站,甘肅 民樂734500)

近年來，尤其是H7N9流感及非洲豬瘟疫情爆發(fā)后，熒光定量PCR診斷方法在基層動(dòng)物疫病防控、檢疫檢驗(yàn)、流行病學(xué)調(diào)查和疫病診斷中的優(yōu)勢(shì)越來越凸顯。PCP方法因其敏感性高、操作簡(jiǎn)單、診斷周期短、準(zhǔn)確性高的特點(diǎn)，已經(jīng)成為基層畜牧獸醫(yī)業(yè)務(wù)部門最主要的診斷手段之一。

如何在最短的時(shí)間內(nèi)做出最準(zhǔn)確的判斷就顯得尤為重要。熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)必須在二級(jí)生物安全水平以上實(shí)驗(yàn)室內(nèi)、由技術(shù)過硬的專業(yè)人員精準(zhǔn)操作下完成。因此，本文從以下3個(gè)方面，簡(jiǎn)單分析影響實(shí)驗(yàn)精準(zhǔn)性的因素。

1 二級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室的運(yùn)行基本要求

1.1 實(shí)驗(yàn)室的選址要求

實(shí)驗(yàn)室選址不僅要符合國(guó)家、當(dāng)?shù)氐沫h(huán)境保護(hù)部門要求，也要復(fù)符合建設(shè)主管部門的要求。首先要了解這些要求并征得其部門同意和批準(zhǔn)，方可進(jìn)行實(shí)質(zhì)性的設(shè)計(jì)和建設(shè)，不要盲目選址建設(shè)。要根據(jù)當(dāng)?shù)厮募緶夭?、風(fēng)向、溫度變化范圍、空氣濕度等自然條件，建在相對(duì)地勢(shì)較高、僻靜、交通相對(duì)便捷的地方。

1.2 實(shí)驗(yàn)室建設(shè)要求

選址完成之后，建議請(qǐng)專業(yè)的實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)人員，根據(jù)現(xiàn)有的條件，設(shè)施設(shè)計(jì)和規(guī)劃建設(shè)實(shí)驗(yàn)室，充分考慮未來實(shí)驗(yàn)室的使用方向和可能的發(fā)展趨勢(shì)。建設(shè)原則要符合各區(qū)獨(dú)立、注意風(fēng)向、因地制宜、方便工作的原則。硬件設(shè)施要求越完善，越有利于運(yùn)行管理。我縣的獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室建在原民樂縣畜牧獸醫(yī)局辦公樓一樓，與辦公區(qū)域獨(dú)立分開，建設(shè)之前就在民樂縣環(huán)保局的備案。

1.3 建立完善的質(zhì)量管理和生物安全管理體系

一個(gè)合格的獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室必須要有規(guī)范的質(zhì)量管理體系和生物安全管理體系并且嚴(yán)格執(zhí)行。我縣獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室制定了完善的質(zhì)量手冊(cè)、生物安全手冊(cè)、程序文件等，建立了嚴(yán)格的管理體系。

1.4 過硬的人員隊(duì)伍

獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室管理人員必須要有防范大于治理的安全意識(shí)，把好質(zhì)量安全和生物安全關(guān)。技術(shù)人員要掌握必要的理論基礎(chǔ)、積累一定的實(shí)驗(yàn)室工作經(jīng)驗(yàn)并且掌握熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)工作原理、熟悉儀器設(shè)備、掌握不同試劑原理，最好人員隊(duì)伍固定。我縣獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有專職實(shí)驗(yàn)室工作人員3名，均在5年以上的實(shí)驗(yàn)室工作經(jīng)歷，都具備中級(jí)以上職稱。

1.5 合格的硬件設(shè)施及輔料

熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)對(duì)硬件設(shè)施要求高，必備的生物安全柜、離心機(jī)、移液器及常用的一些輔助試劑和耗材(采樣管、拭子、離心管、PCR管、吸頭、移液器、無核酸酶水和試管架等)必須符合基本要求。

民樂縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室在2004年農(nóng)業(yè)部動(dòng)物防疫基礎(chǔ)設(shè)施建設(shè)項(xiàng)目和2017年獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室能力提升建設(shè)項(xiàng)目的基礎(chǔ)上，對(duì)獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行了改擴(kuò)建。目前建筑面積達(dá)458平方米，設(shè)有解剖室、接樣室、檔案室、無菌室、血清學(xué)檢測(cè)室、病原學(xué)檢測(cè)室、分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室七個(gè)功能室。2020年5月通過甘肅省獸醫(yī)局的授權(quán)，開展非洲豬瘟熒光PCR檢測(cè)，止目前共檢測(cè)34批次2691份樣品，涵括血清、環(huán)境樣品、生豬運(yùn)輸車輛及組織等。樣品覆蓋全縣的規(guī)模養(yǎng)豬場(chǎng)(戶)、生豬定點(diǎn)屠宰廠、輛運(yùn)輸車輛。同時(shí)開展口蹄疫病毒及H5、H7流感病毒的檢測(cè)，累計(jì)完成3469份樣品的分子生物學(xué)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。

2 樣品的采集、處理、保存和運(yùn)輸

實(shí)驗(yàn)樣品采集遵循適時(shí)、合理、典型、無菌、安全的原則。采集樣品時(shí)要根據(jù)不同的疾病或者檢驗(yàn)?zāi)康?，采集相?yīng)的臟器、內(nèi)容物、分泌物、排泄物等，樣品要有代表性；同時(shí)做好自我安全防護(hù)，以免造成不必要的損傷。采樣結(jié)束后做好包裝、運(yùn)送和記錄工作。并在最短的時(shí)間內(nèi)送檢。

樣品的采集、處理、保存和運(yùn)送時(shí)檢驗(yàn)工作順利開展的基礎(chǔ)，樣品決定了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。所以說樣品的采集、處理、保存和運(yùn)送是十分重要的。具體采樣要求建議參考原農(nóng)業(yè)部2002年8月頒布的“動(dòng)物疫病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)采樣方法(NY/T541-2002)”。

3 人為因素

對(duì)于基層獸醫(yī)檢測(cè)人員來說，在實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)建設(shè)好、現(xiàn)有的硬件設(shè)施及實(shí)驗(yàn)室的輔料，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性最主要因素的是實(shí)驗(yàn)過程的各種人為因素。筆者從事多年的基層獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室工作，認(rèn)為在現(xiàn)有的條件下，以下幾個(gè)方面是提高實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

3.1 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備工作

實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備工作十分重要，但往往卻經(jīng)常被忽視。首先要根據(jù)委托協(xié)議查看實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，?zhǔn)備耗材、提前開啟儀器設(shè)備保證正常運(yùn)行、所需試劑回溫及耗材查漏補(bǔ)缺等必備工作。其次檢查待檢樣品是否符合實(shí)驗(yàn)要求，如符合須先處理樣品(包括置盲、留樣及滅活、稀釋等前期工作)，實(shí)驗(yàn)前樣品處理(樣品滅活)可避免污染實(shí)驗(yàn)室的現(xiàn)象發(fā)生，留樣是復(fù)檢的前提。

3.1.1 確定耗材及以前配件是否使用正確 耗材對(duì)于熒光定量PCR來說比較重要，很多異常擴(kuò)增曲線是由于耗材使用不當(dāng)引起的。常見的有錯(cuò)誤使用普通PCR儀器所對(duì)應(yīng)的耗材，透光性太差，可能會(huì)出現(xiàn)打折的曲線。沒有選擇跟儀器加熱模塊規(guī)格匹配的耗材。造成反應(yīng)管外壁與熒光定量PCR儀器溫控模塊沒有充分接觸，熱傳導(dǎo)不充分進(jìn)而影響酶的活性，出現(xiàn)假陰性的結(jié)果。使用質(zhì)量差的耗材可能出現(xiàn)熒光值不穩(wěn)定得到的CT值不穩(wěn)定。

3.1.2 確認(rèn)所有試劑是否正確 確認(rèn)試劑是否有效，核查有效期、運(yùn)輸條件、是否反復(fù)凍融等。若以上任何一項(xiàng)不符合，建議廢棄不用以免影響實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性。

3.2 實(shí)驗(yàn)過程

實(shí)驗(yàn)過程簡(jiǎn)單的說就是按照試劑說明書完成核酸提取、體系配制、擴(kuò)增分析三個(gè)過程。其中最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)核酸提取、體系配置。整個(gè)過程需要在獨(dú)立的區(qū)域內(nèi)(即準(zhǔn)備區(qū)、配置區(qū)、擴(kuò)增分析區(qū))、按照單向移動(dòng)(潔區(qū)到污區(qū))的原則完成。

這個(gè)階段要求實(shí)驗(yàn)室工作人員手穩(wěn)、手快、心細(xì)。我認(rèn)為熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)的以下操作細(xì)節(jié)要特別注意：

3.2.1 從冰箱冷凍取出的試劑是否混合均勻 提取核酸加樣是否精準(zhǔn)、倒廢液的時(shí)候是否污染了手套及操作臺(tái)面、離心管蓋是否蓋嚴(yán)實(shí)、離心過程進(jìn)來避免甩開管蓋等。

3.2.2 擴(kuò)增之前加樣是否精確 有沒有掛在八連管管壁、八連管蓋密閉性檢查、八連管與PCR儀有沒有充分接觸、八連管內(nèi)有沒有氣泡等等。

3.2.3 確認(rèn)軟件設(shè)置是否正確 對(duì)照試劑盒說明書，檢車時(shí)間、溫度、循環(huán)數(shù)、熒光采集等設(shè)置是否正確。

如果以上都正常，一般來說不會(huì)出現(xiàn)異常的擴(kuò)增曲線。但是個(gè)別情況下還是會(huì)出現(xiàn)，這就要求實(shí)驗(yàn)室工作人員具備判斷數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)的能力，為什么會(huì)出現(xiàn)異常曲線以及怎么避免出現(xiàn)異常曲線。

3.3 實(shí)驗(yàn)室去污染和廢棄物處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后對(duì)樣本、設(shè)備、操作臺(tái)面及操作間等進(jìn)行清潔、消毒、滅菌是最后環(huán)節(jié)。結(jié)合本人工作實(shí)際，PCR實(shí)驗(yàn)廢棄物經(jīng)過高壓滅菌之后，交于醫(yī)療廢棄物處理機(jī)構(gòu)統(tǒng)一處理。操作臺(tái)面、生物安全柜、移液器、試管架等硬件設(shè)施通過84消毒液噴灑--核酸去除劑噴灑--酒精擦拭三步法，輔以紫外燈照射徹底消毒。為下次實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備。

綜上所訴，在實(shí)驗(yàn)室建設(shè)運(yùn)行情況良好的情況下，符合樣品符合檢測(cè)要求、技術(shù)過硬的工作人員三個(gè)必備條件下，注意操作細(xì)節(jié)，選用合適的耗材及輔料，嚴(yán)謹(jǐn)細(xì)致的工作態(tài)度，才能克服影響因素從而大大提高實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性，為快速準(zhǔn)確的判斷疫情、檢疫檢驗(yàn)結(jié)果提供判斷依據(jù)。