王 學綜述, 任麗君, 張英為, 周玉皆審校

0 引 言

1961年Hayflick和Gil[1]觀察發(fā)現，當正常人成纖維細胞連續(xù)傳代時，細胞分裂至一定代數也會發(fā)生停滯，并伴隨著表型改變，由此細胞衰老的概念第一次被正式提出。細胞衰老分為復制性衰老和過早性衰老，前者與端?？s短相關，后者與壓力應激誘因相關，主要包括線粒體功能障礙、抑癌基因的失活、氧化應激、電離輻射或高氧等，大多數這些誘因導致細胞DNA損傷或染色質結構改變，并且激活DNA損傷修復(DNA damage repair，DDR)反應。通常，衰老細胞更多表達p21、p16、p53等因子并且出現永久的細胞周期停滯，被認為受p53-p21-RB和p16通路的調節(jié)[2]。p53表達增加后通過p21上調細胞周期素依賴性蛋白激酶抑制因子1A(Cyclin dependent protein kinase inhibitor 1A，CDKN1A)，CDKN1A使得磷酸化Rb蛋白轉變?yōu)榉橇姿峄疪b蛋白從而綁定轉錄因子E2F，細胞增殖周期進入阻滯。細胞周期素依賴性蛋白激酶(Cyclin-dependent kinase, CDK)和細胞周期蛋白Cyclin是細胞周期調控中起重要作用的兩類蛋白，p16抑制CDK/cyclin復合物活性阻止非磷酸化Rb和E2F分離介導細胞周期永久阻滯。除生長停滯外，衰老細胞還具有衰老相關分泌表型(senescence-associated secretory phenotype，SASP)，分泌多種促炎細胞因子、趨化因子、生長因子和金屬蛋白酶，以旁分泌和自分泌的方式參與細胞的生理病理過程[3]。細胞衰老與細胞代謝改變也有關，β-半乳糖苷酶(β-Galactosidase，SA-β-gal)在衰老細胞中表達上調。

1 細胞衰老的主要發(fā)生機制

眾多研究者發(fā)現多種因素均參與細胞衰老的發(fā)生。20世紀70年代端?？s短與細胞“末端復制問題”的聯系首次被發(fā)現[4]。隨后，多種研究證實端?？s短可導致細胞DNA末端暴露引發(fā)DDR，細胞進入衰老周期[5-7]。1989年Linnane等[8]發(fā)現由于線粒體DNA(Mitochondrial DNA,mtDNA)的修復機制有限，mtDNA會發(fā)生突變和缺失，是參與細胞衰老發(fā)生的主要靶標。進一步研究顯示，線粒體功能障礙還可導致細胞內線粒體活性氧(Reactive oxygen species, ROS)持續(xù)增加，使得mtDNA突變積累、氧化磷酸化、抗氧化防御能力受損加重DDR，增加細胞衰老的程度[9-10]。20世紀90年代，科學家紛紛探索細胞衰老與癌癥之間的關系，發(fā)現抑癌基因失活后可使下游細胞DNA損傷、基因表達以及染色質結構的變化，還可激活細胞增殖阻滯通路，從而引起細胞衰老[11-12]。2007年He等[13]發(fā)現DNA損傷和致癌應激還以p53依賴性方式強烈誘導miR-34a、miR-34b和miR-34c的表達，當miR-34過表達時，細胞進入衰老階段。隨后，深入研究顯示miRNA家族在控制和參與細胞衰老中均起著重要參與作用，且miRNA表達降低可減弱p53介導的細胞衰老[14-15]。近期，電離輻射(Ionizing radiation，IR)誘導細胞衰老的觀點得到眾多學者的認同。已有研究表明，IR一方面會導致腫瘤細胞DNA受損，抑制腫瘤細胞的增殖；另一方面，IR可誘導周圍正常細胞衰老，導致正常組織纖維化和器官功能障礙[16-19]。同時IR刺激免疫系統(tǒng)迅速消除這些衰老細胞，如果衰老細胞產量超過免疫系統(tǒng)清除能力或免疫系統(tǒng)受損而無法有效清除這些衰老細胞，則衰老細胞會積累[20-21]。

2 細胞衰老參與特發(fā)性肺纖維化的發(fā)生機制

特發(fā)性肺纖維化(Idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是一種慢性、不可逆和致命的進行性纖維化間質性肺疾病，約占所有間質性肺疾病病例的20%[22]。其病理特征是肺泡上皮細胞(alveolar epithelial cells，AEC)反復被破壞引發(fā)彌漫性肺間質纖維化，間質組織瘢痕化增厚，病因和發(fā)病機制不明[23]?；颊呖杀憩F為咳嗽、氣喘、呼吸困難，最終呼吸衰竭、甚至死亡。IPF在診斷后平均中位生存期為3～5年[24]?，F有證據表明，IPF的發(fā)生率和患病率隨年齡上升成倍增長，是一種與衰老相關疾病[25]。然而，年齡相關的IPF易感性背后的機制仍不十分清楚，有待深入研究。

2.1端?？s短參與IPF的發(fā)生IPF與端?？s短有關，短端粒會導致染色體末端暴露，機體識別為DNA雙鏈斷裂并激活DDR[26]。研究人員基于PCR測量端粒長度和總膠原含量，與正常對照組相比，IPF患者中端粒長度縮短了約27%，總膠原含量卻大幅增加。在有遺傳性端粒功能障礙的小鼠中，對博來霉素(Bleomycin，BLM)誘導的染色體損傷及肺纖維化表現有更高的敏感性[27]。人端粒結合因子TRF1(Telomere repeat binding factor 1，TRF1)為一種重要的端粒庇護蛋白。Ram等在小鼠II型AEC中發(fā)現，TRF1缺失會導致端?？s短和肺重構，其特征在于肺泡間隔增厚、結構變形、間質膠原沉積、羥脯氨酸含量增加以及衰老相關SA-β-gal在肺泡上皮細胞中積累加劇。研究顯示II型AEC中TRF1的缺失導致肺纖維化的自發(fā)發(fā)展。ZCCHC8是脊椎動物的一種含鋅關節(jié)蛋白，可調節(jié)端粒酶3'末端成熟。研究人員通過全基因組連鎖分析發(fā)現肺纖維化家庭中ZCCHC8的突變體(ZCCHC8部分丟失和完全丟失的兩種不同的RNA)失調性表型均發(fā)展為端粒酶RNA功能不全，導致端粒長度縮短。同時，他們還發(fā)現在8%～15%家族性IPF和其他11.3%IPF患者體中端粒酶有關的基因發(fā)生突變[28]。綜上所述，端粒縮短與IPF發(fā)生關系緊密。

2.2抑癌基因的下調參與IPF的發(fā)生Tian等[29]研究了IPF患者肺組織中PTEN/NF-κB的活化與細胞衰老之間的關系。結果表明，在纖維化肺組織AEC中PTEN基因表達降低，NF-κB活化和衰老標記增加。體內實驗顯示，在博來霉素誘導的小鼠肺纖維化模型中，衰老標志物與SASP表達水平增加，NF-κB被激活，PTEN顯著降低，上調PTEN基因的表達可延長小鼠的壽命，其下調可加速小鼠衰老。基于上述結果，作者認為，PTEN /NF-κB途徑控制AEC衰老，PTEN /NF-κB途徑失調可能是AEC衰老參與肺纖維化發(fā)生的機制之一。PTEN負調控的蛋白激酶B (Protein Kinase B, PKB/AKT)信號通路對細胞生長和細胞存活的調控起著至關重要的作用。Qiu等[30]在動物模型中發(fā)現PTEN的下調激活了AKT通路導致小鼠AEC衰老，而抑制AKT的活性可顯著減輕小鼠體內AEC的衰老和肺纖維化程度。該結果表明，由PTEN / Akt途徑調節(jié)的衰老AEC可能促進了肺纖維化的發(fā)生。

2.3線粒體功能障礙參與IPF的發(fā)生Zank等[31]人發(fā)現線粒體產能過程受過氧化物酶體增殖物激活的受體-γ復合物1α/β(PPARγcoactivator-1α/β，PGC-1α/β)控制。研究發(fā)現IPF患者和纖維化小鼠肺中PGC-1α表達均降低且缺乏PGC-1α的小鼠更易受博來霉素誘導的肺纖維化的影響。此外，一磷酸腺苷活化蛋白激酶(Adenosine monophosphate activated protein kinase ，AMPK)是PGC-1α/β的上游激活物，隨年齡的增長AMPK以及線粒體功能調節(jié)因子活性受抑制，引起線粒體生物發(fā)生能力降低。這些結果均說明線粒體功能障礙可能是機體患IPF的因素之一。同時，Schuliga等[32]人通過熒光染色發(fā)現在IPF患者肺成纖維細胞中存在線粒體超氧化物、細胞ROS、線粒體DNA、應激水平均升高等線粒體功能障礙表現，該研究結果顯示線粒體功能障礙與IPF發(fā)生確有相關性。

PTEN誘導的激酶1(PTEN induces putative kinase 1，PINK1)在維持線粒體的形態(tài)和功能發(fā)揮重要作用。Marta等[33]人將PINK1缺失小鼠與WT小鼠進行圖像和形態(tài)比較發(fā)現PINK1缺失小鼠出現線粒體腫大、線粒體異常百分比增加、線粒體數量減少等現象且小鼠氣道周圍膠原沉積增加。在進行氣管內滴注博來霉素建立肺纖維化模型時發(fā)現，相較于對照組，PINK1 缺失小鼠膠原蛋白沉積度、肺纖維化程度、TGFβ的轉錄水平均更高。由此可知，線粒體功能障礙會影響IPF的發(fā)展。

2.4輻射參與IPF的發(fā)生IR會損傷接受胸腔放射治療肺癌患者的II型肺泡上皮細胞(Type II alveolar epithelial cells，AECII)，隨著輻射持續(xù)存在，AECII損傷耗竭，再生能力下降引發(fā)細胞衰老，當輻射再次發(fā)生時易導致肺纖維化的發(fā)生。Chen等[34]將小鼠肺組織暴露于可誘導纖維化劑量的輻射后發(fā)現，衰老的AECII刺激促炎細胞因子釋放，其將巨噬細胞、淋巴細胞募集到損傷部位產生多種細胞因子、趨化因子，放大炎癥反應并觸發(fā)成纖維細胞的增殖和募集，一旦成纖維細胞被激活，就會轉化為肌成纖維細胞，從而分泌細胞外基質(Extracellular matrix,ECM)蛋白。當輻射持續(xù)存在時，ECM產生過量，受損組織不斷重塑，輻射誘發(fā)的肺纖維化就會發(fā)生。

2.5其他因素參與IPF的發(fā)生

2.5.1 IL-18參與IPF的發(fā)生以往研究發(fā)現，在BLM誘導小鼠IPF模型中，IL-18表達升高，加入IL-18結合蛋白(Interleukin 18 Binding Protein，IL-18BP)后，小鼠肺中膠原蛋白沉積量、TGF-β1含量、α-SMA含量均降低，小鼠肺纖維化程度減輕且存活率提高[35]。該結果提示IL-18參與IPF的發(fā)生。同時，其他研究人員在肺纖維化小鼠體中分別分離了接受和未接受IL-18BP治療的小鼠原代肺成纖維細胞。結果顯示，未接受IL-18BP治療的小鼠肺成纖維細胞中SA-β-gal陽性細胞、P21及P53的含量均增加，而經IL-18BP處理后含量均明顯減少。研究結果表明，IL-18BP通過結合IL-18因子阻礙小鼠肺成纖維細胞的衰老和肺纖維化的發(fā)生[36]。

2.5.2纖溶酶原激活劑抑制劑-1(plasminogen activator Inhibitor-1，PAI-1參與IPF的發(fā)生研究發(fā)現，AECII衰老與IPF的發(fā)生相關，在IPF中AECII內PAI-1表達出更高的水平[37]。Jiang等[38]向PAI-1特異性敲除小鼠和WT小鼠注射BLM建立小鼠肺纖維化模型。研究發(fā)現，與WT小鼠相比，敲除小鼠體重、膠原蛋白、羥脯氨酸、原膠原1α1/2、α-SMA的表達均降低，小鼠肺纖維化程度減弱。該研究揭示，PAI-1的缺失保護小鼠免于博來霉素誘導的肺纖維化影響，PAI-1可能是IPF發(fā)生的相關機制之一。

2.5.3MicroRNA(miRNA)參與IPF的發(fā)生MiRNA是一類新發(fā)現的內源性非編碼RNA分子,能在轉錄后水平調控基因的表達。有報道稱miRNA在細胞增殖、發(fā)育、分化、凋亡、代謝、信號轉導以及IPF發(fā)生中發(fā)揮重要的調節(jié)作用[39]。Cui等[40]發(fā)現20月大老齡和10周大幼齡miR-34a消融小鼠對博來霉素誘導的肺纖維化反應不同。與老齡WT小鼠相比，老齡miR-34a消融小鼠肺纖維化程度、肺中膠原蛋白、α-SMA、纖連蛋白含量與WT小鼠相比均降低。此外，他們還發(fā)現纖維化小鼠肺泡上皮miR-34a的水平在老齡小鼠中上升，并在老齡小鼠的纖維化肺中被進一步誘導增加。然而在幼齡小鼠中發(fā)現，幼齡miR-34a消融小鼠與WT小鼠相比出現更嚴重的纖維化。這些結果表明miRNA參與IPF的發(fā)生，且miR-34a消融對幼年和老年小鼠肺纖維化的影響不同。作者推測miR-34a可能與那些公認參與腫瘤發(fā)生的調節(jié)因子一樣，在生命早期對肺部起保護性作用，隨著年齡的增長對肺部起有害性作用。同時，最新研究發(fā)現miRNA家族其他成員也參與了IPF的發(fā)生[41-42]。

2.5.4WNT信號失調與IPF發(fā)展相關WNT信號通路具有刺激細胞生長和分化的功能，該通路的異常激活可能引起細胞的異常增殖，進而導致疾病的發(fā)生[43]。在此前研究已發(fā)現IPF發(fā)病機制中存在WNT/β-catenin信號異常激活現象[44-45]。Shi等[46]在IPF患者肺組織中通過RNA序列分析顯示，WNT/β-catenin信號通路被激活且TGF-β含量增加，該信號與TGF-β之間的信號交叉對IPF的發(fā)展至關重要，阻斷WNT/β-catenin通路可引起IPF小鼠肌成纖維細胞、EMT含量降低，小鼠纖維化程度減弱。該研究結果顯示WNT/β-catenin信號異常激活與IPF發(fā)生相關。

WNT發(fā)育通路在胚胎發(fā)育中所必須，若在生命后期活躍起來，可能會導致包括肺在內的多個器官發(fā)生病變，這一過程稱為拮抗多效性或發(fā)育漂移。這些多效性效應也可解釋WNT/β-catenin信號異常激活在IPF發(fā)生中的作用[47]。

3 結 語

細胞衰老指的是細胞增殖能力達到極限，細胞周期進入阻滯。最近研究發(fā)現衰老可能是參與IPF發(fā)生的重要因素。衰老的細胞通過誘導DNA損傷或染色質結構改變，激活DDR反應，分泌多種促炎細胞因子、趨化因子、生長因子和金屬蛋白酶，以旁分泌和自分泌的方式參與IPF的發(fā)生。端?？s短、抑癌基因的失調、線粒體功能障礙以及輻射是此前被大家所熟知的通過細胞衰老參與IPF的發(fā)生發(fā)展的途徑，近期研究發(fā)現PAI-1、MicroRNA、WNT信號也可通過衰老細胞導致IPF。這些機制為我們從發(fā)生途徑上治療IPF提供了可能和依據。然而，仍有其他因素可通過細胞衰老參與IPF的發(fā)生，其具體發(fā)病機制仍需進一步深入探究。