鄧詩勇 宮蘋 譚震

口腔疾病研究國家重點實驗室 國家口腔疾病臨床醫(yī)學研究中心四川大學華西口腔醫(yī)院種植科 成都610041

作為人體重要器官，骨具有支持、運動、存儲礦物質等作用，維持著人體進行正常的生理功能。骨的發(fā)育過程中，四肢骨、軀干骨及顱底骨等主要由軟骨內(nèi)成骨形成，該過程由軟骨細胞為主導；頜骨、鎖骨則由膜內(nèi)成骨形成，由間充質干細胞分化為成骨細胞以直接形成骨[1]。骨組織并非一成不變，而是處于動態(tài)平衡之中，其中涉及骨形成與骨吸收，在多種因素下維持著動態(tài)平衡，一方面，軟骨細胞與成骨細胞形成正常骨組織并發(fā)育成熟，另一方面，破骨細胞與成骨細胞相互作用與制約，二者的平衡與骨生理穩(wěn)定至關重要[2]。骨代謝異常則可能導致疾病發(fā)生或誘發(fā)并發(fā)癥，因而研究骨相關細胞活動及調(diào)控機制，對于相關疾病的防治具有十分重要的意義。

腦和肌肉芳香烴受體核轉運樣蛋白1（brain and muscle aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator-like protein 1，Bmal1）基因廣泛參與調(diào)節(jié)生物體內(nèi)生理活動。近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)其在骨生理及病理過程上起著重要作用[3]。通過影響間充質干細胞的成骨向分化、軟骨細胞及破骨細胞的功能[4-6]，Bmal1基因分別從骨形成與骨吸收兩方面參與調(diào)控骨生理，但其中的分子機制尚無定論。近年來，發(fā)現(xiàn)多種疾病中存在晝夜節(jié)律的變化，時相療法的概念也應運而生[7]，骨組織中，包括顱面部骨，存在著節(jié)律的變化[8-9]，而牙槽骨的骨量變化一直是口腔醫(yī)學領域的重要課題，因而探究骨代謝性疾病的晝夜節(jié)律調(diào)控機制具有重要意義。本文就Bmal1基因調(diào)控骨組織生理活動的研究進展作一綜述，分析其中可能的分子機制，并討論其在口腔及全身相關骨代謝疾病診療中可能發(fā)揮的作用。

1 Bmal1基因是參與機體正常生理活動的重要調(diào)節(jié)因子

對哺乳動物來說，大多數(shù)生理活動都在近日鐘基因調(diào)節(jié)下，遵循24 h的晝夜節(jié)律，這種節(jié)律受外界光強、溫度等因素的影響，環(huán)境信號的變化主要通過視網(wǎng)膜感知并傳輸至視交叉上核，并進一步作用于組織細胞中的局部振蕩系統(tǒng)。近日鐘基因包括Bmal1、生物鐘循環(huán)輸出蛋白（circadian locomotor output cycles kaput，Clock）基因、周期（period，Per）基因家族、隱花色素（cryptochrome，Cry）家族及維甲酸相關孤兒受體等成員，Bmal1與Clock二者表達蛋白形成二聚體結合到Per與Cry基因啟動子的E-box區(qū)域進而調(diào)控其表達，當Per與Cry表達達到峰值，反過來抑制Bmal1與Clock的表達，如此隨著時間推移周而復始，形成周期振蕩的負反饋調(diào)節(jié)系統(tǒng)[10]。

口腔及全身生理過程中廣泛地存在著節(jié)律振蕩及其調(diào)控，如人的牙齦及牙周膜成纖維細胞、牙髓來源干細胞、骨髓間充質干細胞等均被發(fā)現(xiàn)表達近日鐘的組分[11-12]，機體生物節(jié)律的紊亂，尤其是Bmal1基因的表達降低可能誘發(fā)一系列疾病的發(fā)生。若敲除Bmal1基因，正常的生物節(jié)律被破壞，敗血癥、阻塞性肺部疾病、阻塞性睡眠呼吸暫停等疾病的風險將增加，其炎癥發(fā)展將更為嚴重，其在頭頸部鱗狀細胞癌的診斷及預后判斷中也存在潛在的應用價值[13]；晝夜節(jié)律的破壞，也將進一步導致機體的衰老變化，如白內(nèi)障、皮下脂肪減少及器官萎縮等[14]。作為衰老的主要癥狀之一，骨的增齡性改變。同樣，受Bmal1的調(diào)控：8周齡Bmal1-/-基因敲除小鼠骨吸收增加，骨量明顯減少[5]；相比野生型小鼠，16周齡的Bmal1-/-小鼠脛骨長度更短[15]。研究發(fā)現(xiàn)，顱骨的礦化發(fā)育過程存在周期性，且與Per基因的表達節(jié)律相關[9]，包括Bmal1在內(nèi)的多個近日鐘基因元件在顱骨、牙槽骨及牙骨質中均有節(jié)律振蕩的表達[16-17]，亦能影響正畸治療的過程中牙周組織的重塑[18]，而Bmal1-/-小鼠基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）表達升高，出現(xiàn)下頜骨發(fā)育不全的癥狀[19]。

近年來，在骨代謝領域，Bmal1的作用日益受到關注；另外，隨著中國人口老齡化的加劇，骨質疏松、骨關節(jié)炎等增齡性疾病亟待解決，在口腔醫(yī)學領域，在中老年患者群體中，牙周炎骨質喪失、種植體的成功率等問題也需要密切關注。因此，從時間生物學角度，研究骨的衰老變化及骨髓微環(huán)境中相關細胞的生理活動，可為相關骨代謝疾病提供新的思路，具有廣闊的前景。

2 Bmal1基因通過多種途徑調(diào)控骨生理

2.1 Bmal1基因可調(diào)控MSCs成骨-成脂分化

間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）有多種組織來源，具有自我更新和多向分化潛能，在組織再生工程中被廣泛使用，其增殖能力及分化命運的誘導一直是生命科學領域的研究熱點。MSCs可分化為成骨細胞，在骨生理研究領域同樣受到廣大學者的密切關注。Bmal1基因與MSCs成骨分化關系十分密切。研究[8]發(fā)現(xiàn)，MSCs中的近日鐘基因Bmal1與Per3二者表達亦呈8~12 h的交替節(jié)律變化，符合一般生物節(jié)律。Bmal1在包括骨髓的多種人體組織中廣泛表達，隨著間充質干細胞的老化，Bmal1表達呈增齡性降低，而其表達水平下降與MSCs的衰老與成骨分化能力的降低明顯相關[20]。另外，老化相關的細胞內(nèi)在因子改變可干擾MSCs的成骨-成脂平衡，更多轉向成脂分化，而其成脂分化的過程同樣受Bmal1調(diào)控[21]。通過轉染過表達MSCs的Bmal1基因，能促進其增殖及成骨分化能力[22]，負向干擾Bmal1基因得出了同樣的結論[23]；過表達Bmal1基因的負向調(diào)節(jié)因子Reverbα，其增殖與成骨能力則相應減弱[24]。體內(nèi)實驗同樣表明Bmal1基因通過調(diào)控MSCs的成骨分化能力進而調(diào)節(jié)骨量[25]，糖尿病引起代謝失衡，導致骨喪失，過表達Bmal1也能恢復MSCs被抑制的成骨分化能力[26]。如今種植義齒已經(jīng)成為牙列缺損或缺失的首選修復方法之一，種植體植入牙槽骨后形成特殊的異源物微環(huán)境，其中MSCs的成骨分化能力對種植體—骨之間形成直接的骨結合至關重要[27]。可以合理推測，Bmal1基因參與到種植體骨結合的形成及維持。一項研究通過全基因組芯片分析，發(fā)現(xiàn)種植體周組織節(jié)律基因表達明顯變化[28]，在其中Bmal1的上調(diào)更為顯著。而目前最常使用的是鈦種植體，在鈦生物材料表面培養(yǎng)MSCs，誘導了神經(jīng)元PAS結構域蛋白2與Bmal1的異常共表達網(wǎng)絡[29]。

Bmal1調(diào)控MSCs成骨分化的核心機制，目前尚缺乏定論。作為MSCs成骨分化的最為核心的信號通路之一，Wnt/β-連環(huán)蛋白通路被證實與Bmal1在促進成骨分化上存在協(xié)同作用，Bmal1基因轉染的細胞中，核心因子β-連環(huán)蛋白的表達明顯增強[30]，但二者在成骨中的相互作用機制需要進一步研究。另外，MSCs的老化與細胞周期相關p53/p21信號激活密切相關，而Bmal1對該通路起到抑制作用[31-32]，糖尿病導致的MSCs成骨分化能力減弱同樣與Bmal1對p53信號通路的調(diào)控有關[33]，這也為Bmal1調(diào)控成骨分化的機制研究提供了可能思路；而有染色質免疫沉淀分析表明低氧應激通路作為與MSCs老化息息相關的調(diào)節(jié)因子，與Bmal1之間存在串擾[34]。綜上可見，Bmal1基因參與調(diào)節(jié)多方面生命活動，與多種信號通路形成了復雜的分子調(diào)控網(wǎng)絡，因此調(diào)控MSCs成骨分化機制研究線索雖眾，但缺乏有力證據(jù)明確其核心通路。

2.2 Bmal1基因參與維持軟骨細胞功能

生長板軟骨細胞主導的軟骨內(nèi)成骨形成，對個體四肢發(fā)育具有重要作用。通過測定軟骨細胞的有絲分裂指數(shù)、生長板高度，表明軟骨組織同樣具有晝夜節(jié)律[35]，超過600個軟骨細胞表達的基因具有節(jié)律性，隨著細胞老化，軟骨的晝夜節(jié)律振蕩幅度還將明顯降低[36]。作為節(jié)律基因的核心因子，Bmal1基因參與維持軟骨完整及軟骨細胞功能。關節(jié)內(nèi)間充質干細胞的Bmal1基因被敲除后，表現(xiàn)出更強的促炎性，軟骨發(fā)育受到抑制[37]。骨關節(jié)炎（osteoarthritis，OA）的核心病理機制便是軟骨細胞的功能異常與退化，已經(jīng)證明在OA患者及老年小鼠軟骨組織中BMAL1表達水平降低，軟骨細胞中靶向敲除Bmal1基因，導致了小鼠關節(jié)軟骨的退化，下游軟骨主要基質相關轉錄因子SOX9，聚蛋白多糖和Ⅱ型膠原蛋白Col2a1的表達降低[38]。

新近研究發(fā)現(xiàn)，Bmal1基因的敲除明顯抑制了軟骨細胞的增殖，MMP13表達增加，它的機制可能是通過低氧誘導因子（hypoxia inducible factor，HIF）介導的信號通路[4]。BMAL1與HIF1α具有相似的蛋白結構域，二者相互作用，而作為HIF1的主要調(diào)控靶點之一，血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）作用于生長板軟骨最后轉化為骨組織的血管化過程[39]?？梢钥吹?，HIF1所代表的低氧誘導信號轉導，不論是與軟骨細胞還是成骨細胞均有密切關系，Bmal1通過這一途徑同時參與調(diào)控膜內(nèi)成骨與軟骨成骨，值得進一步探索其在骨代謝相關領域的作用。此外，Akagi等[40]利用RNA-Seq測序推測乙型轉化生長因子-β也可能是Bmal1調(diào)控軟骨細胞功能的途徑之一。

2.3 Bmal1基因調(diào)控成骨-破骨平衡

成骨細胞與破骨細胞分別行使的骨形成與骨吸收作用是骨改建的基本方面，它們相互協(xié)同又相互制約，共同維持骨組織的穩(wěn)定，而以Bmal1為核心的近日鐘基因在其中發(fā)揮重要作用，可能是今后骨再生醫(yī)學的調(diào)控靶點。破骨細胞起源于單核/巨噬細胞，分化過程中核因子κB受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL）信號轉導起核心作用，而成骨細胞可分泌護骨素（osteoprotegrin，OPG）競爭結合胞膜上的RANKL蛋白，抑制破骨細胞形成[41]；反之，破骨細胞可分泌信號素Semaphorin-4Dl來抑制成骨細胞的成骨功能[42]。Bmal1基因通過調(diào)節(jié)骨形成蛋白-2/SMAD1信號轉導調(diào)節(jié)成骨細胞的成骨活性[43]，共培養(yǎng)實驗表明，敲除Bmal1基因的成骨細胞具有更強的支持破骨細胞形成的能力，說明在二者的協(xié)同中Bmal1也起到了調(diào)節(jié)作用；Bmal1基因可上調(diào)OPG表達，進而抑制骨吸收，當其被特異性敲除，可以通過OPG的表達下調(diào)降低對破骨細胞分化的抑制[44]，這抑或與核因子（nuclear factor，NF）-κB通路相關。直接敲除破骨細胞Bmal1基因，對小鼠骨量無影響[45]，似乎表明Bmal1基因調(diào)控破骨細胞功能是間接作用，但晝夜節(jié)律的破壞直接影響了破骨細胞的功能，Xu等[46]提出Bmal1基因可通過與SRC家族及活化T細胞核因子的交互作用，進而促進破骨細胞分化，故破骨細胞特異性敲除Bmal1基因甚至增加了骨量。這種矛盾的出現(xiàn)基于成骨-破骨平衡機制的復雜性，Bmal1基因參與介導骨生理的雙向平衡，如何厘清其中復雜的分子調(diào)控機制，明確Bmal1基因在各方面的作用，是當下研究其調(diào)控骨生理的難點。

3 Bmal1基因在異常骨代謝中的作用

Bmal1基因參與調(diào)節(jié)β-連環(huán)蛋白、HIF1、NFκB等關鍵轉錄因子表達，通過復雜的分子機制，調(diào)控MSCs、成骨細胞、破骨細胞及軟骨細胞的生理功能，維持骨代謝平衡。當受到外界因素刺激，平衡被打破則會引發(fā)骨代謝相關疾病或誘發(fā)并發(fā)癥，在其中Bmal1基因及其代表的生物節(jié)律亦會受到影響，并對疾病恢復起到一定作用。

3.1 Bmal1基因與牙周骨質喪失

牙周炎是最常見的口腔慢性疾病之一，以菌斑為始動因子，主要表現(xiàn)為牙周組織的破壞，其中包括牙槽骨的骨質流失。牙周組織中表達晝夜節(jié)律基因，缺氧條件模擬炎癥狀態(tài)下牙周膜節(jié)律蛋白表達水平降低[47]。牙齦卟啉單胞菌（牙周炎的主要致病菌之一）可使Bmal1啟動子甲基化，從而抑制Bmal1轉錄，Bmal1的下調(diào)介導NF-κB因子激活，進一步促進了炎癥發(fā)展[48]。目前的牙周序列治療難以修復已經(jīng)缺損的牙周組織，而組織工程技術的出現(xiàn)為牙周病治療提供了新的思路。種植體周圍炎同樣地存在著周圍骨質的喪失，二者在臨床特征及組織病理學上有著諸多相似之處，但種植體周圍炎往往存在更多的炎性細胞浸潤[49]。如前述，Bmal1基因與種植體骨結合的形成關系緊密，在失敗的骨結合過程也發(fā)生上調(diào)。作為促進牙周組織愈合、牙槽骨缺損修復的干細胞基礎，MSCs在牙周組織工程技術治療中發(fā)揮了巨大作用[50-51]。研究顯示，與牙周膜干細胞相比，MSCs的成骨分化能力更強，在炎癥微環(huán)境中具有更強的免疫調(diào)節(jié)作用。近年來，Bmal1基因在促進MSCs成骨分化、逆轉干細胞衰老方面發(fā)揮的作用日益受到關注，在控制炎癥方面的作用也得到證實[52]，以此在菌斑控制的基礎上，將為修復牙周炎及種植體周圍炎牙周缺損提供新的思路。

3.2 Bmal1基因與骨質疏松

衰老和婦女絕經(jīng)后狀態(tài)是骨質疏松的兩大主因，表現(xiàn)出骨量及骨密度的下降，并導致骨的脆性增加，增加骨折風險。小鼠經(jīng)卵巢切除術模擬絕經(jīng)后骨質疏松狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)包括BMAL1在內(nèi)的晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)蛋白表達降低[53]；自然衰老小鼠骨質退化，雖然晝夜節(jié)律正常，但應對外界刺激時觀察到了年齡相關的運動節(jié)律破壞[54]。近日鐘基因中，Bmal1的調(diào)節(jié)因子維甲酸相關孤兒受體和REV-ERBα可能是骨質疏松癥的治療靶點[55]，而其下游基因Cry2被證明與老年骨質疏松患者相關[56]，Bmal1作為反饋循環(huán)中的關鍵因子，對骨質疏松的直接作用有待證實，而鑒于Bmal1基因對MSCs老化的逆轉作用，可為骨質疏松的再生治療提供可能思路。

3.3 Bmal1基因與骨關節(jié)炎

OA常發(fā)生在四肢關節(jié)處，是關節(jié)軟骨的退化損傷所導致，軟骨細胞的功能異常或退化在其中占有重要作用。近年來，學者逐漸關注到骨關節(jié)炎中軟骨的生物節(jié)律破壞與可能的治療靶點，骨關節(jié)炎軟骨細胞中Per2的表達較高，而Bmal1的表達則明顯降低，提示軟骨細胞內(nèi)源性節(jié)律破壞可能是骨關節(jié)炎早期發(fā)展的關鍵[57]，而后RNA測序也證實了這一點[58]。而衰老作為骨關節(jié)炎的另一危險因素，同樣受到Bmal1的影響。骨關節(jié)炎中軟骨細胞的特征性表型改變，如SOX9表達減少，MMP13的產(chǎn)生增加，均受Bmal1及下游基因Per2的影響[59]。Bmal1通過調(diào)控軟骨細胞功能，如形成軟骨基質，進而參與維持軟骨完整與修復，特異性敲除Bmal1基因，導致關節(jié)軟骨的退化。HIF1、HIF2在軟骨發(fā)育中發(fā)揮重要作用，可能成為治療骨關節(jié)炎的可能靶點[60]，而Bmal1與HIF1之間存在交互，新近研究從體內(nèi)與體外兩方面證實了Bmal1通過HIF1/VEGF信號軸調(diào)控軟骨發(fā)育，但目前缺乏對該機制研究的疾病模型，是進一步研究的熱點。除以上骨代謝相關疾病之外，還發(fā)現(xiàn)骨性下頜發(fā)育不全中Bmal1表達下調(diào)，其機制可能是Bmal1的缺失降低了OPG表達，破骨細胞分化增強，而國內(nèi)學者發(fā)現(xiàn)骨性下頜發(fā)育不全中Bmal1表達降低通過影響p65的磷酸化上調(diào)MMP3表達進而抑制了成骨分化。

4 總結與展望

目前，關于Bmal1基因調(diào)控骨生理病理過程的研究尚存在一定的局限性，首先體現(xiàn)在近日鐘基因在組織中廣泛表達，在長骨與頜骨中的具體作用尚且不明，同時其與眾多分子信號均有交互，因而對分子機制的研究大多淺嘗輒止，厘清其中核心的信號轉導通路是當下研究的難點；其次，生物鐘受到外界環(huán)境、自身情緒及精神狀態(tài)等多種復雜因素的影響，需要克服多重因素的影響，構建精準的研究模型；最后，相關臨床證據(jù)不足，明確Bmal1基因在骨代謝性疾病中發(fā)揮的作用，為疾病防治提供切實理論，需要進一步研究。

Bmal1通過對MSCs成骨分化的調(diào)控作用，為其在再生組織工程中的應用提供了理論可行性，或可應用于骨質喪失的再生治療；其對機體的衰老、與低氧誘導信號轉導在多方面的交互，為進一步研究調(diào)控骨生理的機制提供了可行方向。隨著我國人口老齡化的加劇，進一步探究Bmal1基因對下游系列分子信號的作用，對探索口腔及全身骨代謝相關疾病的防治提供新的思路，具有深遠意義。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。