張安琪 安萌 姜博 唐文強 潘麗 付波

RNA 修飾在基因表達調(diào)控中發(fā)揮重要作用。在不同的生物學進程中，RNA 修飾是動態(tài)、可逆且廣泛存在的。目前，已知的RNA 化學修飾達170 多種，RNA 修飾既可以發(fā)生在編碼RNA 也可發(fā)生在非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA），被稱作“表觀轉(zhuǎn)錄組”。其中甲基化是最主要的RNA 修飾之一，也是近年的研究熱點。RNA 甲基化修飾主要包括N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine，m6A）、N1-甲基腺苷（N1-methyladenosine，m1A）、假尿苷（pseudouridine，Ψ）和5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，m5C）修飾等。對于m5C 修飾，過往的研究主要集中于DNA，而RNA 中m5C 修飾的功能及調(diào)節(jié)機制的研究尚處于起步階段。近年來，隨著甲基化測序技術(shù)的發(fā)展，在編碼RNA 及非編碼RNA 中均證實了m5C 甲基化修飾的存在[1-3]。RNA m5C 甲基化修飾主要依賴于甲基轉(zhuǎn)移酶（writers）、去甲基化酶（erasers）及結(jié)合蛋白（readers）。RNA m5C 甲基化修飾發(fā)揮多種生物學功能，如調(diào)節(jié)mRNA 的轉(zhuǎn)運、RNA 的穩(wěn)定性、翻譯、線粒體活性、壓力應(yīng)激等。近年來的研究表明，RNA m5C 甲基化修飾參與調(diào)節(jié)多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移，如膀胱癌[3]、肝癌[4]、頭頸鱗狀細胞癌[5]、膠質(zhì)瘤[6]等。本文綜述RNA m5C 甲基化修飾的調(diào)控機制、功能以及在腫瘤中的研究進展。

1 RNA m5C 甲基化修飾的調(diào)節(jié)機制

RNA m5C 甲基化修飾是一個動態(tài)、可逆的過程，主要調(diào)節(jié)因子有3 個：m5C 甲基轉(zhuǎn)移酶、去甲基化酶和m5C 甲基化結(jié)合蛋白。RNA m5C 甲基轉(zhuǎn)移酶主要包含NOL1/NOP2/sun（NSUN）甲基轉(zhuǎn)移酶和DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶類似物DNMT2，其催化形成5-甲基胞嘧啶。m5C 甲基化結(jié)合蛋白通過識別和結(jié)合m5C 甲基化位點來發(fā)揮作用，去甲基化酶催化RNA m5C 的去甲基化。

1.1 m5C 甲基轉(zhuǎn)移酶

m5C 甲基轉(zhuǎn)移酶以S-腺苷-L-甲硫氨酸（Sadenosylmethionine，SAM）作為甲基供體，將甲基轉(zhuǎn)移至胞嘧啶形成5-甲基胞嘧啶。目前，已知的RNA m5C 甲基轉(zhuǎn)移酶有10 余種，包括NSUN 家族、DNA甲基轉(zhuǎn)移酶類似物DNMT2、tRNA 特異性甲基轉(zhuǎn)移酶TRDMT 家族。

NSUN 家族蛋白含有Rossman 折疊催化結(jié)構(gòu)域和1 個SAM 結(jié)合位點。NSUN 家族成員包括NSUN1-NSUN7。NSUN1 直接結(jié)合60～80 S 核糖體前體，催化人28S rRNA m5C 修飾。NSUN2 為研究最多的NSUN 家族成員。NSUN2 可以催化多種RNA的m5C 甲基化修飾，如rRNA、tRNA、mRNA、mt-RNA和病毒RNA 等。NSUN2 介導的m5C mRNA 廣泛分布在所有的編碼區(qū)。NSUN2 發(fā)揮多種生物學功能，如調(diào)節(jié)上皮細胞分化、HIV-1 轉(zhuǎn)錄、EB 病毒降解等。NSUN2 在多種腫瘤中高表達，介導腫瘤發(fā)生發(fā)展。如在膽囊癌中，NSUN2 沉默抑制膽囊癌細胞的增殖及腫瘤形成[7]。在肝癌中，長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）H19 是NSUN2 的特異性靶標，m5C 修飾的H19 通過招募Ras-GTPase 激活蛋白結(jié)合蛋白1（Ras-GTPase-activating protein SH3 domainbinding protein 1，G3BP1）促進肝癌發(fā)生發(fā)展[8]。NSUN3 主要定位于線粒體，催化反密碼子環(huán)中C34處線粒體編碼的tRNA 甲硫氨酸（mttRNAMet）甲基化。NSUN4 是rRNA 特異性的甲基化轉(zhuǎn)移酶，以N 端26個氨基酸基序依賴的方式轉(zhuǎn)運至線粒體。NSUN4 與線粒體調(diào)節(jié)因子MTERF4 相互作用，募集到線粒體核糖體大亞基，通過甲基化修飾12S rRNA C911 位點，促進線粒體核糖體組裝。NSUN5 定位于核仁，也是rRNA 特異性的甲基轉(zhuǎn)移酶，催化25S rRNA 的Ⅳ結(jié)構(gòu)域C2278 位點甲基化。在結(jié)直腸癌中，高表達的NSUN5 通過調(diào)節(jié)細胞周期促進腫瘤細胞的增殖[9]。NSUN6 部分存在于高爾基體和中心小體，是tRNA甲基化調(diào)節(jié)因子，催化C72 位tRNACys和tRNAThr甲基化，影響tRNA 生成。NSUN6 在腫瘤中表達下調(diào)，NSUN6 高表達與部分腫瘤預(yù)后較好相關(guān)[10]。NSUN7介導增強子RNA（enhancer RNA，eRNA）m5C 甲基化修飾。

DNMT2 具有DNA 甲基化酶的序列和結(jié)構(gòu)特征，可以催化胞嘧啶DNA 甲基化。同時，DNMT2 也可以催化C38 位tRNAAsp甲基化。DNMT2 催化的tRNA 甲基化在tRNA 的加工、維持翻譯準確性、穩(wěn)定性和差異性中發(fā)揮重要作用，并可保護其免受核糖核酸酶的裂解。另有兩種甲基轉(zhuǎn)移酶，TRM4A 和TRM4B，可以特異性催化tRNA m5C 甲基化修飾。綜上所述，甲基轉(zhuǎn)移酶是RNA m5C 甲基化修飾重要調(diào)控因子之一，不同的甲基轉(zhuǎn)移酶催化一種或多種RNA 的甲基化。盡管目前部分研究已證實甲基轉(zhuǎn)移酶在部分腫瘤中發(fā)揮重要作用，但不同類型的甲基轉(zhuǎn)移酶在不同腫瘤的發(fā)生發(fā)展中的作用及機制仍有待闡明。

1.2 去甲基化酶

去甲基化酶（ten-eleven translocation，TET）家族是依賴于Fe（Ⅱ）和α-酮戊二酸（α-ketoglutaric acid，α-KG）的雙加氧酶，其家族成員包括TET1、TET2 和TET3，其中TET3 在細胞核和細胞質(zhì)均有分布，而TET1 和TET2 多定位于細胞核。TET 酶家族可催化DNA 5-甲基-2'-脫氧胞苷（5-methyl-2'-deoxycytidine，5mdC）氧化形成5-羥甲基-2'-脫氧胞苷（5-hydroxymethyl-2'-deoxycytidine，5hmdC）、5-甲?；?2'-脫氧胞苷（5-formyl-2' deoxycytidine，5fdC）和5-羧基-2'-脫氧胞苷（5-carboxyl-2'-deoxycytidine，5cadC）。TET 酶家族也可以作為RNA 去甲基酶，對編碼RNA 和非編碼RNA 中的5-甲基胞苷（5-methylcytidine，5mrC）及其氧化類似物均具有活性，包括5-羥甲基胞苷（5-hydroxymethylcytidine，5hmrC）、5-甲?；眨?-formylcytidine，5frC）和5-羧胞苷（5-carboxycytidine，5carC）。TET 酶家族對多種核酸底物包括dsDNA、ssDNA、ssRNA 和DNA-RNA 雜交鏈均可發(fā)揮催化作用[11]。但是對于TET 的結(jié)構(gòu)和生物學功能以及如何增強TET 介導的氧化特異性和選擇性等問題仍有待深入研究。

1.3 m5C 甲基化結(jié)合蛋白

RNA 修飾發(fā)揮的生物學功能主要與其結(jié)合蛋白相關(guān)。m5C 甲基化結(jié)合蛋白主要有ALYREF（ Aly/REF export factor） 和YBX1 （ Y-box binding protein 1）。ALYREF 是mRNA 轉(zhuǎn)運蛋白復合體TREX 的主要組成部分。在mRNA 出核過程中，ALYREF 首先被募集，在CBP80 介導下與mRNA的5'端結(jié)合，在PABPN1 介導下與mRNA 的3'末端結(jié)合；ALYREF 還通過與3'端加工因子CstF64 直接作用，進一步加強ALYREF 和mRNA 的結(jié)合。在人HeLa 細胞和小鼠組織中，ALYREF 直接與mRNA m5C 位點結(jié)合，促進mRNA 核-質(zhì)穿梭，而mRNAALYREF 的結(jié)合親和力以及出核過程均由NSUN2介導。YBX1 是一種新發(fā)現(xiàn)的m5C 結(jié)合蛋白，YBX1可調(diào)節(jié)細胞質(zhì)中mRNA 的穩(wěn)定性。在膀胱癌中，YBX1 通過其冷休克結(jié)構(gòu)域（cold-shock domain，CDS）中W65 位吲哚環(huán)識別m5C 修飾的mRNA 并與之結(jié)合，通過募集YBX1 互作因子（ELAV-like protein 1，ELAVL1），YBX1 可穩(wěn)定m5C 修飾的mRNA 從而調(diào)節(jié)mRNA 代謝。在肺癌中，YBX1 通過與lncRNA LINC00312 直接結(jié)合促進腫瘤細胞的侵襲、遷移和血管生成[12]。目前研究并發(fā)表的m5C 甲基化結(jié)合蛋白僅有ALYREF 和YBX1，其他甲基化結(jié)合蛋白仍待發(fā)現(xiàn)和驗證，其對于RNA m5C 修飾的調(diào)控機制亦待進一步研究。

2 m5C 甲基化修飾對RNA 的影響

2.1 m5C 甲基化修飾對mRNA 的影響

mRNA 中存在大量的m5C 甲基化修飾，m5C 甲基化修飾對mRNA 功能的影響是近年來的研究熱點。1）m5C 甲基化修飾影響mRNA 的翻譯。近期研究表明[13]m5C 修飾與mRNA 翻譯之間存在功能上的相互依賴性。在HeLa 細胞中，編碼區(qū)的m5C 位點與mRNA 的翻譯效率呈負相關(guān)。而另一項研究表明[14]，NSUN2 誘導的m5C 甲基化與METTL3/METTL14誘導的m6A 甲基化協(xié)同作用，介導p21 mRNA 3'-UTR（untranslated region）甲基化，增強p21 mRNA 的翻譯效率。近期亦有研究發(fā)現(xiàn)[15]mRNA 編碼區(qū)m5C修飾與翻譯效率呈負相關(guān)，而3'-UTR 中的m5C 甲基化修飾與翻譯效率則呈正相關(guān)；2）m5C 甲基化修飾影響mRNA 的轉(zhuǎn)運。研究表明[16]m5C 修飾在富含CG堿基的區(qū)域及緊鄰起始密碼子下游富集，并在mRNA出核中發(fā)揮關(guān)鍵作用；3）m5C 甲基化修飾影響mRNA的穩(wěn)定性。在膀胱癌中，YBX1 通過招募ELAVL1 增強m5C 修飾的mRNA 穩(wěn)定性[3]。有研究發(fā)現(xiàn)[17]m5C修飾水平與mRNA 穩(wěn)定性無關(guān)或呈負相關(guān)。因此，m5C 甲基化修飾對mRNA 穩(wěn)定性的影響仍需進一步研究。

2.2 m5C 甲基化修飾對tRNA 的影響

m5C 甲基化修飾調(diào)節(jié)tRNA 的穩(wěn)定性，調(diào)節(jié)細胞代謝，參與細胞應(yīng)激。研究表明，NSUN2 和DNMT2介導的tRNA m5C 修飾可維持tRNA 穩(wěn)定性并調(diào)節(jié)細胞代謝[13,17]。在人、小鼠和植物中，TRM4/NSUN2 介導的m5C 甲基化可防止tRNA 因氧化應(yīng)激而降解。DNMT2 介導的tRNA 甲基化可保護其免受核酸內(nèi)切酶作用，調(diào)節(jié)底物tRNAAsp-GTC和tRNAGly-GCC的穩(wěn)定性。

2.3 m5C 甲基化修飾對rRNA 的影響

m5C 甲基化修飾調(diào)節(jié)rRNA 的穩(wěn)定性，影響核糖體合成。在小亞基12S rRNA 中，m5C甲基轉(zhuǎn)移酶NSUN4可使胞嘧啶911 甲基化（m5C911），并與MTERF4 形成復合體，確保僅有成熟大亞基和小亞基組裝形成復合體。m5C2278 與G2288 甲基化缺失導致25S rRNA 結(jié)構(gòu)變化。當細胞暴露于過氧化氫時，Rcm1/NSUN5 的缺失會導致25S rRNA C2278 附近序列折疊更松散，說明Rcm1/NSUN5 在氧化應(yīng)激條件下對維持rRNA 的穩(wěn)定發(fā)揮重要作用。

2.4 m5C 甲基化修飾對其他RNA 的影響

m5C 甲基化修飾對病毒RNA、lncRNA、環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）等也具有重要作用。病毒RNA 中存在大量m5C 甲基化修飾。研究表明DNMT2 介導的m5C 甲基化可穩(wěn)定HIV-1 基因組RNA，保障其在宿主細胞中存活[18]。然而近期亦有研究發(fā)現(xiàn)m5C 修飾對病毒RNA 復制和穩(wěn)定性有負面影響。NSUN1 與HIV-1 Tat 蛋白競爭催化HIV-1 TAR RNA5'-UTR 的甲基化，從而抑制了HIV-1 復制并促使其進入潛伏狀態(tài)[19]。非編碼RNA、lncRNA 和circRNA 中也存在大量的m5C修飾。LncRNA HOTAIR和XIST 染色質(zhì)修飾復合物相互作用區(qū)或其附近的m5C 甲基化，可通過影響XIST 與染色質(zhì)相關(guān)蛋白復合物PRC2 的結(jié)合來影響XIST 功能。在肝癌組織中l(wèi)ncRNA 和circRNA m5C 甲基化頻率和甲基化基因的數(shù)量也顯著多于癌旁組織，提示m5C 修飾在肝癌發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮重要作用[1-2]。綜上所述，m5C 修飾在多種RNA 中廣泛存在且可能發(fā)揮重要功能。目前，m5C 修飾對RNA 的影響研究還比較少，對其認知尚存爭議，仍有待進一步研究。

3 RNA m5C 修飾在腫瘤中的研究進展

3.1 m5C 甲基化修飾與肝癌

通過對比肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）及癌旁組織發(fā)現(xiàn)，HCC 中mRNA m5C 峰明顯多于癌旁組織，且分布更為廣泛[4]。除了編碼RNA，HCC 組織中circRNA 和lncRNA m5C 甲基化頻率和甲基化基因的數(shù)量也顯著多于癌旁組織[1，2]。RNA m5C 修飾促進HCC 進展，m5C 調(diào)節(jié)因子NSUN4 和ALYREF 的升高與HCC 患者的不良預(yù)后負相關(guān)[20]。近期研究發(fā)現(xiàn)，在肝癌細胞HepG2 中，NSUN2 缺失抑制細胞的增殖及遷移[8]。轉(zhuǎn)錄組測序及亞硫酸鹽測序（bisulfite sequencing，Bis-Seq）發(fā)現(xiàn)NSUN2 缺 失 后lncRNA H19 m5C 甲基化和基因表達顯著降低。機制研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA H19 是NSUN2 RNA 甲基修飾酶的特異靶點，m5C 修飾影響H19 的半衰期與穩(wěn)定性，m5C 修飾的H19 可通過特異結(jié)合G3BP1 腫瘤蛋白促進腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[8]。

3.2 m5C 甲基化修飾與膀胱癌

在膀胱癌中，癌組織和癌旁組織RNA Bis-Seq 發(fā)現(xiàn)在膀胱癌中存在高頻m5C 甲基化，大多數(shù)m5C 甲基化位點存在于mRNA 中，且高甲基化mRNA 在致癌通路中顯著富集。進一步研究表明，膀胱癌組織中NSUN2 和YBX1 表達異常升高，原癌基因肝素結(jié)合生長因子（heparin binding growth factor，HDGF） mRNA被NSUN2 甲基化，YBX1 通過與HDGF mRNAm5C甲基化位點結(jié)合并募集ELAVL1，維持HDGF mRNA穩(wěn)定性，促進腫瘤發(fā)生。

3.3 m5C 甲基化修飾與胃腸癌

研究表明與癌旁組織相比，NSUN2 在胃癌中上調(diào)表達。體內(nèi)外實驗證實NSUN2 促進胃癌細胞的增殖及腫瘤發(fā)生。RNA 測序發(fā)現(xiàn)在胃癌中p57KIP2 為NSUN2 調(diào)控的下游靶標。機制上，NSUN2 的甲基轉(zhuǎn)移酶活性及p57Kip2 mRNA 3'-UTR 區(qū)m5C 修飾破壞了p57Kip2 mRNA 的穩(wěn)定性，從而促進胃癌發(fā)生[21]。m5C 甲基轉(zhuǎn)移酶和結(jié)合蛋白在胃腸癌中表達上調(diào)，其高表達與患者生存率低顯著相關(guān)。生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，m5C 調(diào)節(jié)蛋白與ErbB/PI3K-Akt 信號通路密切相關(guān)，GSK3B 是m5C 調(diào)節(jié)蛋白的重要靶點[22]。

3.4 m5C 甲基化修飾與白血病

在白血病中，NSUN1 特異性與BRD4 相互作用，直接與RNA 聚合酶Ⅱ（RNA polymerase Ⅱ，RNA-pol-Ⅱ）CTD-S2P 結(jié)合，在5-氮雜胞苷（5-azacytidine，5-AZA）耐藥的白血病細胞中形成獨特的NSUN1/BRD4/RNA-pol-Ⅱ CTD-S2P 復合物，從而介導5-AZA抗性染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的形成，造成白血病中的5-AZA 抵抗。而NSUN3 和DNMT2 則對5-AZA 敏感的白血病細胞表現(xiàn)出相反作用。在機制上，RNA 結(jié)合蛋白hnRNPK直接與m5C 甲基化轉(zhuǎn)移酶NSUN3 和DNMT2、譜系決定轉(zhuǎn)錄因子GATA1 和SPI1/PU.1 以及CDK9/PTEFb 相互作用，并在新生RNA 處募集RNA-pol-Ⅱ形成獨特的復合物，最終形成對5-AZA 敏感的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)。比較5-AZA 耐藥和5-AZA 敏感的白血病病骨髓樣本發(fā)現(xiàn)，5-AZA 耐藥的骨髓中m5C mRNA 明顯高于5-AZA 敏感的骨髓樣本。hnRNPK、NSUN1和BRD4 的表達水平與白血病病程相關(guān)，并參與5-AZA 耐藥及腫瘤進展[23]。

3.5 m5C 甲基化修飾與膠質(zhì)瘤

在膠質(zhì)瘤中，不同臨床病理特征的腫瘤RNA m5C 甲基轉(zhuǎn)移酶表達不同。利用5 種m5C 甲基轉(zhuǎn)移酶基因構(gòu)建風險預(yù)測模型可以預(yù)測膠質(zhì)瘤患者生存率及臨床病理特征，Cox 回歸分析結(jié)果顯示模型預(yù)測風險評分是膠質(zhì)瘤獨立預(yù)后因素[6]。此外，在多形神經(jīng)膠質(zhì)母細胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM）中，大部分miRNA 存在m5C 修飾， miRNA-181a-5p 甲基化修飾與GBM 患者的不良預(yù)后相關(guān)。機制上，經(jīng)含DNMT3a 和AGO4 的復合物介導，miR-181a-5p 的m5C 甲基化修飾抑制miRNA-181a-5p/mRNA 雙鏈的形成，導致其抑癌作用喪失[24]。

3.6 m5C 甲基化修飾與肺癌

在肺腺癌中，基于11 個m5C 調(diào)控因子，劃分了兩種m5C 甲基化修飾模式，其具有不同的腫瘤微環(huán)境免疫細胞浸潤特征；建立m5C 甲基化修飾評分體系，結(jié)果表明在高評分組肺腺癌患者預(yù)后較好，而m5C 低評分組預(yù)后較差[25]?；?4 個m5C 相關(guān)的lncRNA 構(gòu)建肺腺癌患者預(yù)后預(yù)測模型，結(jié)果顯示高危組預(yù)后較低危組差，具有較高敏感性和特異性[26]。在肺鱗狀細胞癌中，與正常肺組織相比，m5C 甲基化調(diào)控因子NSUN3、NSUN4 高表達，與患者預(yù)后不良相關(guān)[27]。

4 結(jié)語與展望

綜上所述，編碼RNA 及非編碼RNA m5C 甲基化修飾參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移、腫瘤耐藥等進程。RNA m5C 修飾及m5C 調(diào)節(jié)因子在作為腫瘤診斷和（或）預(yù)后判斷的標志物中也顯示出了巨大的潛力。對RNA m5C 修飾的靶向干預(yù)也可能為腫瘤的治療開辟新的方向。盡管如此，對RNA m5C 甲基化修飾的影響及調(diào)節(jié)機制的研究仍較淺顯，m5C 甲基化修飾在腫瘤中的研究尚處于起步階段，機制解析相關(guān)研究較少，研究涉及的腫瘤類型亦不夠全面，上述問題均有待于進一步研究探索。