冼群澤 季興華 霍建忠 葛軍勇 郭耀

1.山西醫(yī)科大學(xué)，山西 太原 030000 2.山西白求恩醫(yī)院，山西 太原 030000

1 骨質(zhì)疏松的發(fā)病機(jī)制與治療現(xiàn)狀

骨質(zhì)疏松(osteoporosis，OP)是一種由多因素引起的以單位體積骨量減少，骨組織微結(jié)構(gòu)破壞為特征，從而導(dǎo)致骨脆性增加，骨折風(fēng)險(xiǎn)增高的全身性骨代謝疾病[1]。人體的骨骼時(shí)刻在經(jīng)歷動態(tài)的變化過程，舊的骨質(zhì)不斷被破骨細(xì)胞所產(chǎn)生的單核巨噬細(xì)胞吸收降解，而新骨則由來源于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨細(xì)胞重塑。雖然各類骨質(zhì)疏松的發(fā)病機(jī)制有所不同，但最終都表現(xiàn)為破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞活動失衡導(dǎo)致的骨重建平衡的破壞，從而使骨吸收速度超過骨形成速度[2]。因此，促進(jìn)新骨形成以補(bǔ)充丟失的骨組織是治療此類疾病的關(guān)鍵。目前，臨床上對于OP患者多采用藥物治療、物理治療和運(yùn)動療法[3-5]。盡管對骨質(zhì)疏松的治療取得了很大進(jìn)步，但其治療效果仍難達(dá)到臨床預(yù)期，一方面很多新研發(fā)抗骨質(zhì)疏松藥物價(jià)格昂貴，普通人難以承受，限制了其在臨床上的廣泛應(yīng)用；另一方面患者依從性差，不良反應(yīng)較多[6-7]。近年來，越來越多的學(xué)者開始關(guān)注骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與骨質(zhì)疏松的相關(guān)性研究，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞并進(jìn)一步形成骨細(xì)胞，是機(jī)體內(nèi)骨組織更新的唯一途徑，研究表明，MSCs數(shù)量的減少或成骨功能的缺失，會直接引起OP[8-9]。因此，通過系統(tǒng)或局部移植正常功能的BMSCs并促進(jìn)向成骨方向分化，是其治療OP的關(guān)鍵。

2 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞概述

Friedenstein等[10]首次在骨髓中發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，這種細(xì)胞貼壁生長，呈梭形，能形成單細(xì)胞來源的集落。BMSCs廣泛存在于中軸骨及外周骨松質(zhì)骨骨髓腔中，能夠自我更新并分化成多種細(xì)胞類型，是當(dāng)前組織工程研究理想的種子細(xì)胞。無論從動物模型還是人體試驗(yàn)，BMSCs的應(yīng)用都涉及很多疾病，包括骨關(guān)節(jié)炎、血管修復(fù)、骨折愈合、骨質(zhì)疏松癥等[11-13]。骨質(zhì)疏松患者M(jìn)SCs的增殖、成骨分化能力均下降，但通過移植骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞則為治療骨質(zhì)疏松開辟了新領(lǐng)域。研究表明移植骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)骨再生，改善骨質(zhì)量主要通過兩種機(jī)制起作用：(1)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向受損部位或病理區(qū)域歸巢，然后分化成骨細(xì)胞，合成新的骨組織，修復(fù)退化組織；(2)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞通過分泌某些生長因子，改變周圍微環(huán)境，并招募其他相關(guān)細(xì)胞，以旁分泌的方式作用修復(fù)退化組織[14-15]。體外培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞最多可達(dá)到15～30個(gè)群體倍增[16]。而大規(guī)模的體外擴(kuò)增會導(dǎo)致BMSCs增殖和分化能力的喪失，Mandana等[17]通過體外培養(yǎng)不同年齡段的人體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，隨著傳代次數(shù)的增加，細(xì)胞的增殖能力逐漸減弱，分化潛能從第6代開始下降，端粒酶的長度也逐漸出現(xiàn)磨損，推測端?？s短與細(xì)胞的衰老有關(guān)。Samantha等[18]發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞的增殖能力在第7代開始出現(xiàn)下降，不同的是隨著時(shí)間的推移，端粒的長度及線粒體活性保持穩(wěn)定，低代與高代細(xì)胞之間并無顯著差異。因此，對于端粒酶的縮短是否與BMSCs細(xì)胞的衰老有關(guān)，目前還存在爭議。從活體內(nèi)提取間充質(zhì)干細(xì)胞的數(shù)量總是有限的，必須通過體外擴(kuò)增，以達(dá)到足夠治療數(shù)量的BMSCs。盡管BMSCs能夠自我更新，有很強(qiáng)的增殖能力，但是有限的增殖壽命也一定程度上限制了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的進(jìn)一步應(yīng)用。

3 BMSCs移植治療OP的可行性

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖能力及移植的存活率和植入率是影響骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療效果的主要因素。因此，提高移植細(xì)胞的存活率、開發(fā)高質(zhì)量可靠的體外MSC培養(yǎng)物、選擇合適的移植方法、促進(jìn)細(xì)胞歸巢等是促進(jìn)BMSCs治療骨質(zhì)疏松效果的關(guān)鍵。

3.1 提高移植細(xì)胞的抵抗性與存活率

BMSCs移植到體內(nèi)卻要面臨著缺血缺氧，缺乏營養(yǎng)物質(zhì)的病理環(huán)境，移植后氧化應(yīng)激作用可在局部區(qū)域介導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞大量凋亡，降低其存活率，影響治療效果。Robert等[19]于1983年首先提出“適應(yīng)性細(xì)胞保護(hù)”的概念，即細(xì)胞在低于生理閾值的應(yīng)激刺激條件下，可通過調(diào)節(jié)自身穩(wěn)態(tài)提高對抗應(yīng)激刺激的耐受性。有學(xué)者嘗試通過對體外培養(yǎng)的細(xì)胞低氧預(yù)處理，提高移植細(xì)胞的耐受性。Meng等[20]將體外培養(yǎng)的BMSCs分為正常培養(yǎng)組(20%O2)和缺氧培養(yǎng)組(1%O2)，檢測細(xì)胞的凋亡和遷移，結(jié)果顯示低氧預(yù)處理組骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的遷移和存活率明顯高于正常培養(yǎng)組。一定程度的缺氧處理能提高BMSCs的存活率、增殖能力、促進(jìn)BMSCs的多能性，而研究重點(diǎn)在于優(yōu)化最合適的氧濃度以提高BMSCs的細(xì)胞活性和治療效果[21]。另外，Zhou等[22]將維生素C化學(xué)修飾到三維石墨烯泡沫材料上，研究其對人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨的調(diào)節(jié)作用，發(fā)現(xiàn)維生素C對氧化應(yīng)激所致的成骨抑制有明顯的保護(hù)作用，能顯著提高BMSCs的成骨能力。無論是正常BMSCs還是經(jīng)過氧糖剝奪誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞，在經(jīng)過脂多糖預(yù)處理后均可提高BMSCs的存活率及遷移能力，這可能與脂多糖預(yù)處理促進(jìn)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達(dá)及激活Toll樣受體，增強(qiáng)細(xì)胞對缺血缺氧適應(yīng)性有關(guān)[23-24]。三維或3 D培養(yǎng)模型模擬靶組織內(nèi)復(fù)雜的環(huán)境，與傳統(tǒng)的二維培養(yǎng)相比，三維培養(yǎng)技術(shù)增強(qiáng)了細(xì)胞間的相互作用，促進(jìn)抗凋亡基因的表達(dá)，有助于提高移植細(xì)胞的存活率[25-26]。

3.2 基因修飾或細(xì)胞表面修飾

通過對BMSCs進(jìn)行基因修飾或細(xì)胞表面修飾等手段，可以促進(jìn)細(xì)胞的歸巢，提高存活率。骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)屬于轉(zhuǎn)化生長因子，能夠刺激誘導(dǎo)BMSCs成骨分化，促進(jìn)成骨細(xì)胞成熟，提高細(xì)胞成骨活性。Ruan等[27]發(fā)現(xiàn)，慢病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)染的BMP-2在體外能提高BMSCs活力，誘導(dǎo)成骨相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)成骨分化。肝細(xì)胞生長因子(HGF)能夠提高成骨相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)成骨分化，提高細(xì)胞歸巢效率[28-29]。此外，通過對BMSCs表面進(jìn)行修飾、靶向改造也能提高細(xì)胞的歸巢效率。這種方法主要利用酶修飾、化學(xué)偶聯(lián)或非共價(jià)相互作用、生物特異性識別(抗原抗體或配體受體)等。例如，CXCR4是趨化因子基質(zhì)細(xì)胞衍生因子的特異性受體，通過促進(jìn)細(xì)胞膜表面高表達(dá)CXCR4，能明顯促進(jìn)MSC的歸巢，提高移植細(xì)胞治療效果[30]；P-選擇素糖蛋白配體1(PSGL-1)重組的MSCs能夠促進(jìn)抗炎細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-10(IL-10)的靶向傳遞，提高BMSCs的歸巢效果[31-32]。相比于基因修飾，細(xì)胞表面修飾避免了細(xì)胞長期安全性和毒性問題，其主要通過增強(qiáng)MSC的粘附和植入，而不影響其存活能力、多能性、增殖和分化潛能[33-34]。

3.3 選擇合適植入途徑或聯(lián)合使用生物支架

BMSCs治療骨質(zhì)疏松主要通過干細(xì)胞移植方式，植入途徑主要可分為3種：局部植入(靶組織植入)、全身植入、聯(lián)合生物相容性支架植入。全身植入主要方式是血管內(nèi)給藥包括動脈給藥及靜脈給藥[35]。越來越多的證據(jù)表明，BMSCs的治療效果不僅和移植細(xì)胞的有效數(shù)量有關(guān)，和植入途徑也有很大關(guān)系，為了達(dá)到最佳的治療效果，有必要選擇合適的植入方式。血管內(nèi)給藥相比于局部植入，被認(rèn)為是一種微創(chuàng)途徑，能夠有效避免靶組織的創(chuàng)傷，但干細(xì)胞移植入體內(nèi)后會受到歸巢效應(yīng)的影響，治療效果不確切，首先是靜脈給藥，細(xì)胞通過靜脈輸注，隨著血液的流動，由于肺是第一個(gè)通過的器官，高比例的細(xì)胞可能滯留在肺部，其他器官包括肝、脾等也有可能因細(xì)胞滯留產(chǎn)生嚴(yán)重的影響循環(huán)的微栓子[36-37]。動脈給藥通常被認(rèn)為可以避免細(xì)胞滯留在肺部，并且動脈血流動更強(qiáng)勁有力，可以提高細(xì)胞歸巢比例，然而還是無法避免可能形成微栓子，造成諸如腦栓塞等血管閉塞的風(fēng)險(xiǎn)，這是一個(gè)必須考慮的重要安全問題[38-39]。局部植入是針對病變部位，直接將干細(xì)胞移植到相應(yīng)部位，局部療效滿意，但操作較為復(fù)雜，不可避免對靶組織造成人為損害。此外，還有肌肉注射、皮下注射及腹腔注射的給藥方式，肌肉注射被認(rèn)為是一種安全簡單的移植方式，并且可以提高細(xì)胞滯留時(shí)間，其發(fā)揮治療效果的機(jī)制與BMSCs的旁分泌作用有關(guān)[40-41]。此外，聯(lián)合應(yīng)用各種生物相容性支架，能進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞歸巢。這種支架由最初的羥基磷灰石和磷酸三鈣為材料發(fā)展到包括膠原材料、殼聚糖、海藻酸鹽、纖維素等多種新型材料組成，具有更高的生物相容性，這種移植方式能顯著提高移植細(xì)胞存活率[42-43]。

3.4 聯(lián)合藥物或物理刺激

聯(lián)合使用一些藥物或者物理刺激手段，能起到增強(qiáng)BMSCs治療效果的作用。甲狀旁腺激素類似物PTH(1-34)是唯一一種促進(jìn)成骨的臨床藥物，研究發(fā)現(xiàn)PTH通過多種細(xì)胞因子及(SDF-1)/(CXCR4)軸調(diào)控骨骼代謝，影響B(tài)MSCs的動員，間歇性小劑量使用PTH(1-34)，起到促進(jìn)BMSCs的增殖和成骨分化的作用[44-45]。張媛等[46]發(fā)現(xiàn)，臨床常用的藥物骨肽原液，通過上調(diào)ALP、Runx2、OCN、OPN等成骨相關(guān)基因，促進(jìn)Runx2、OCN等成骨相關(guān)蛋白的表達(dá)，發(fā)揮促進(jìn)BMSCs成骨活性的作用。一些中藥提取物、中藥含藥血清也起到促進(jìn)BMSCs向成骨細(xì)胞分化的效果[47-49]。另外，一些物理刺激手段同樣能協(xié)同BMSCs的治療。Zhang等[50]通過采用不同劑量徑向沖擊波處理體外培養(yǎng)的MSCs，并移植到兔體內(nèi)觀察其對軟骨缺損的修復(fù)作用，結(jié)果表明，沖擊波能顯著促進(jìn)MSCs的增殖和自我更新，加速軟骨修復(fù)過程，顯示出良好的臨床效果。對靶組織行脈沖式聚焦超聲(pFUS)聯(lián)合靜脈注射MSC，能明顯促進(jìn)細(xì)胞歸巢，這可能由于脈沖聚焦超聲作用于靶組織引發(fā)上調(diào)了調(diào)節(jié)細(xì)胞歸巢的局部化學(xué)因子，改變了血管通透性，促進(jìn)MSCs向靶組織遷移[51-52]。

3.5 非細(xì)胞治療

研究表明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞主要通過旁分泌途徑，特別是通過分泌營養(yǎng)因子和細(xì)胞外小泡(EVs)的方式發(fā)揮治療作用，這種胞外小泡在骨代謝中扮演重要角色。Xie等[53]研究發(fā)現(xiàn)，MSCs來源的外泌體能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖，下調(diào)成骨細(xì)胞凋亡相關(guān)基因抑制細(xì)胞凋亡，改善骨質(zhì)疏松。Zhao等[54]發(fā)現(xiàn)，MSCs來源外泌體主要通過絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)途徑，上調(diào)該通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松的作用。干細(xì)胞來源性胞外小泡作為治療手段避免了體外培養(yǎng)細(xì)胞面臨衰老、凋亡，植入細(xì)胞引起免疫反應(yīng)，細(xì)胞存活率、歸巢率低等缺點(diǎn)，是一種潛在替代細(xì)胞治療的有效、安全、創(chuàng)新性的治療方法。

4 問題與展望

隨著再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展以及干細(xì)胞研究的深入，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為一種新的治療骨質(zhì)疏松癥的策略越來越受到研究者重視。移植BMSCs治療骨質(zhì)疏松癥雖被證實(shí)療效肯定，前景廣闊，但仍有不少挑戰(zhàn)，包括對細(xì)胞進(jìn)行修飾具有潛在的突變和致癌風(fēng)險(xiǎn)、移植相關(guān)的免疫排斥風(fēng)險(xiǎn)、人類病原體的傳播風(fēng)險(xiǎn)等；來源于BMSCs的分泌小泡如何作用于靶組織發(fā)揮治療作用，如何傳遞細(xì)胞因子及對細(xì)胞的激活、控制凋亡的途徑，相關(guān)的作用機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。值得肯定的是BMSCs應(yīng)用于治療多種疾病模型，特別是骨疾病方面，已顯示出其巨大潛力。相信隨著研究的深入以及材料科學(xué)的進(jìn)步，應(yīng)用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療骨質(zhì)疏松將不再是挑戰(zhàn)。