毛夢菌，吳佳俊，高 倩

(衢州市衢江區(qū)畜牧獸醫(yī)站，浙江 衢州 324022)

哺乳動(dòng)物卵巢中含有大量的腔前卵泡，但是在發(fā)育到有腔卵泡前大約99.9%的卵泡都走向閉鎖、退化，這無疑是動(dòng)物繁殖領(lǐng)域內(nèi)巨大的浪費(fèi)。卵母細(xì)胞是體外受精、胚胎移植、動(dòng)物克隆和轉(zhuǎn)基因等胚胎生物技術(shù)研究和開發(fā)不可或缺的材料，然而卵母細(xì)胞來源十分匱乏成為其發(fā)展的一個(gè)制約性因素，無疑腔前卵泡的體外培養(yǎng)技術(shù)為其提供了一個(gè)有效途徑。

目前，在動(dòng)物卵泡體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中僅有小鼠的原始卵泡經(jīng)培養(yǎng)后，卵母細(xì)胞發(fā)育成熟并獲得了活體后代。在哺乳動(dòng)物的研究中，有報(bào)道從腔前卵泡培養(yǎng)后獲得的卵母細(xì)胞成熟后發(fā)育到囊胚期，但是至今還未有獲得活體后代的報(bào)道，所以在哺乳類動(dòng)物的卵泡體外培養(yǎng)研究中還有大量的研究工作要做。

褪黑素(MT)在生殖調(diào)控中具有重要作用，在人排卵前卵泡液中發(fā)現(xiàn)了高水平的褪黑素，提示有可能直接參與卵泡的生殖調(diào)控。在小鼠的次級卵泡體外培養(yǎng)中添加不同濃度的褪黑素，在100 μM水平的條件下觀察到雄激素和孕激素的合成量增加而雌激素的合成不受影響，試驗(yàn)表明褪黑素在膜細(xì)胞類固醇激素合成過程中發(fā)揮一定的作用[1]。同樣，在豬有腔卵泡培養(yǎng)體系中，在10、50和100 ng/mL濃度的褪黑素以及有無最佳濃度LH的培養(yǎng)基中培養(yǎng)30 h，發(fā)現(xiàn)在有無LH的情況下MT都能促進(jìn)孕激素的產(chǎn)生，在100 ng/mL時(shí)促進(jìn)雄激素的生成，但在LH存在時(shí)表現(xiàn)為抑制作用[2]。

體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)以及臨床應(yīng)用表明，MT對人肝癌H22細(xì)胞、人肺癌NCIH446細(xì)胞、人黑色素瘤SBQ細(xì)胞等均有明顯的抑制作用，主要表現(xiàn)為抑制增殖，促進(jìn)凋亡。此外還有研究表明，MT可抑制神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的增殖，促進(jìn)多種細(xì)胞分化及有助于幼稚細(xì)胞的分化成熟等[3]。因此，本實(shí)驗(yàn)為了探尋更高質(zhì)量的豬腔前卵泡培養(yǎng)體系，提高卵泡培養(yǎng)質(zhì)量，也試圖探討褪黑素對卵泡發(fā)育的作用，在卵泡培養(yǎng)液中添加不同濃度的褪黑素，觀察褪黑素對豬腔前卵泡的體外生長發(fā)育以及細(xì)胞凋亡水平的影響。

1 褪黑素的生物學(xué)特性

褪黑素(melatonin，MT)是主要由松果體分泌的一種神經(jīng)內(nèi)分泌激素，分泌具有明顯的光周期性變化(晝低夜高)。褪黑素由Lerner在1958年首次在松果體中分離出來，由于其能使一種產(chǎn)生黑色素(melanin)的細(xì)胞發(fā)亮，因而得名。其化學(xué)結(jié)構(gòu)為N-乙酰-5-甲氧基色胺，相對分子質(zhì)量232.27，熔點(diǎn)116～118 ℃，其純品為淡黃色葉片狀結(jié)晶[4]。褪黑素的分子式為C13H16N2O2。其生物合成與年齡具有很大關(guān)系，隨年齡的增大逐漸下降。褪黑素受體屬于G-蛋白偶聯(lián)受體家族，并被分為MT1、MT2、MT3等三種亞型[5]。

2 褪黑素的分泌、合成與代謝

2.1褪黑素的分泌 哺乳動(dòng)物松果體是分泌褪黑素的主要器官，除此之外，在腦區(qū)其他部位、視網(wǎng)膜、副淚腺、腸道、非脊椎動(dòng)物(如昆蟲和單細(xì)胞藻類)體內(nèi)、許多植物(核桃、香蕉、黃瓜、草莓)均含有褪黑素。褪黑素在松果體細(xì)胞合成的過程為：①色氨酸在色氨酸羥化酶(TPH)的作用下轉(zhuǎn)變成5-羥基色氨酸；②經(jīng)5-羥基色氨酸脫羧酶(5-HT-POC)催化生成5-羥色胺；③在N-乙酰轉(zhuǎn)移酶(NAT)和羥基吲哚氧位甲基轉(zhuǎn)移酶(HIMOT)作用下最終轉(zhuǎn)變成褪黑素(N-乙酰-5-甲氧基色胺)。MT經(jīng)松果體及其他組織合成后分泌進(jìn)入血液，并經(jīng)脈絡(luò)膜進(jìn)入腦脊液。在褪黑素合成路徑中，NAT是褪黑素合成限速酶，HIMOT是整個(gè)合成過程中的關(guān)鍵酶。

2.2褪黑素的合成 哺乳動(dòng)物的內(nèi)分泌活動(dòng)受光照周期的影響。光照信息通過以下途徑到達(dá)松果體：光照-視交叉-視交叉上核(SCN)-下丘腦室周區(qū)和結(jié)節(jié)區(qū)(經(jīng)后腦頂蓋背側(cè))-脊髓的胸段-脊髓節(jié)前交感神經(jīng)束-頸上神經(jīng)節(jié)-節(jié)后交感神經(jīng)纖維-松果體的實(shí)質(zhì)細(xì)胞。5-HT的濃度變化與日節(jié)律相反，即白天增多夜間急劇減少。羥基吲哚-氧-甲基轉(zhuǎn)移酶(HIO)是合成其的關(guān)鍵酶，該酶的活性在夜間黑暗條件下比白天高30～50倍。去甲腎上腺素(NE)可以使該酶活化，是通過cAMP而引起的酶蛋白合成增加所致。光照刺激可減少或抑制交感神經(jīng)(SNS)釋放去甲腎上腺素，因此，光的周期性變化通過SNS而使NE的含量也呈現(xiàn)周期性，從而使HIO的活性、5-HT和MT的量都呈現(xiàn)周期性的變化。由此產(chǎn)生的結(jié)果是：日周期性變化和季節(jié)性周期性變化。動(dòng)物MT分泌的晝夜、季節(jié)變化規(guī)律是生物與自然界環(huán)境和營養(yǎng)供應(yīng)變化相適應(yīng)的一種本能。

2.3褪黑素的代謝 褪黑素的半衰期約為10 min，肝臟是其主要的代謝器官。MT在肝微粒羥化酶的作用下，吲哚環(huán)的第6位發(fā)生羥基化，形成6-羥基-N-乙?；?5-甲氧基色胺。所有代謝的褪黑素中，70%～80%與硫酸結(jié)合；5%與葡萄糖醛酸結(jié)合，經(jīng)尿排出；20%經(jīng)脫乙?；兔摪被纬?-甲氧基吲哚乙酸；另外有約1%的MT經(jīng)尿直接排出[6]。

3 褪黑素的作用

MT是一種具有多種功能的光信號(hào)因子，同時(shí)又是一種自由基清除劑、抗氧化劑和細(xì)胞凋亡抑制劑，參與對中樞神經(jīng)、內(nèi)分泌、生殖、消化、免疫等系統(tǒng)的調(diào)節(jié)。具有高親脂性和部分的親水性，有高度彌散穿透能力，從而在細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中都能發(fā)揮抗氧化作用。

褪黑素對生殖系統(tǒng)的影響根據(jù)動(dòng)物的種類、生理狀況和季節(jié)環(huán)境的不同表現(xiàn)出促進(jìn)、抑制或無作用的多重性。經(jīng)研究證實(shí)：MT對人類和長日照動(dòng)物如牛、鼠類、禽類等的生殖系統(tǒng)具有抑制作用；對于短日照動(dòng)物如綿羊、鹿等動(dòng)物表現(xiàn)為促進(jìn)作用；而對于光不敏感動(dòng)物則無作用[7-9]。

MT通過兩條途徑影響生殖系統(tǒng)：一是與卵巢、睪丸和腎上腺細(xì)胞的-腎上腺受體結(jié)合直接調(diào)節(jié)性腺激素的合成和分泌，進(jìn)而控制生殖器官的發(fā)育與成熟；另一途徑是通過抑制下丘腦-垂體-性腺(HPG)軸功能來影響生殖系統(tǒng)，在下丘腦水平上調(diào)節(jié)促性腺激素的分泌[10]。

在人類的研究中表明，血液中高水平的MT伴隨著促黃體素(LH)的釋放增加[11]。在對婦女進(jìn)行外源性褪黑素添加處理時(shí)可以增加LH釋放的脈沖幅度[12],證實(shí)MT在調(diào)控LH釋放中的功能。培養(yǎng)人的顆粒細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明當(dāng)用MT處理時(shí)LH受體mRNA水平上調(diào)[13]。Li等(1997年)在對雄性大鼠的研究中發(fā)現(xiàn)MT對促性腺激素釋放激素(GnRH)有正性作用。MT對綿羊的GnRH/LH系統(tǒng)有明顯的影響作用。當(dāng)秋季日照逐漸縮短時(shí)，MT的分泌逐漸增加，進(jìn)而導(dǎo)致母羊生殖內(nèi)分泌活動(dòng)加強(qiáng)。

MT除對GnRH/LH系統(tǒng)的調(diào)控作用外，對催乳素(PRL)的分泌也有顯著的影響。將山羊飼養(yǎng)在人工控制的日照時(shí)間為16 h的室內(nèi)，每日在天黑前飼喂MT，連續(xù)飼喂23 d后，檢測發(fā)現(xiàn)血液中PRL含量下降大約50%[14]。

在豬卵泡體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)研究中得出，MT在膜細(xì)胞中通過類固醇激素合成酶基因的表達(dá)影響性腺激素的生物合成[15]。在體外培養(yǎng)的人顆粒黃體細(xì)胞中添加生理濃度的MT(200 pg/mL)能顯著增加孕激素的產(chǎn)量[16]。

研究證實(shí)在男性的下丘腦視上核、垂體前葉腺結(jié)節(jié)及睪丸等部位均有MT受體的存在[17]。在對雄性大鼠的研究中發(fā)現(xiàn)MT可對GnRH有促進(jìn)作用，在成年大鼠中給予切除松果體3周后GnRH濃度下降35%，而在注射MT 4 h后，GnRH mRNA的濃度增加了15%，從而表明MT對GnRH基因有激活作用。

MT與PRL、LH、FSH等之間有特殊的關(guān)系，對后者具有重要的調(diào)節(jié)作用。在對短光照、黑暗、致盲倉鼠激素水平的研究表明，垂體分泌的三種激素水平下降，以PRL下降最為明顯，特別是在性腺萎縮以前更明顯。外源性MT對生殖功能的調(diào)節(jié)作用與動(dòng)物的年齡大小、給予褪黑素的時(shí)間長短、光照周期及月經(jīng)周期等因素有關(guān)。MT可使卵巢、子宮萎縮，抑制下丘腦促性腺激素釋放，延緩未成年動(dòng)物的性成熟，降低促性腺激素的誘發(fā)排卵效應(yīng)和阻斷絨毛膜促性腺激素引起的排卵與子宮增重反應(yīng)，縮短黃體壽命、降低孕酮含量，其作用的機(jī)理有實(shí)驗(yàn)研究表明為通過下丘腦-垂體-性腺軸發(fā)揮抑制作用[18]。也有文獻(xiàn)報(bào)道發(fā)現(xiàn)了雌性動(dòng)物卵巢中MT受體的存在，從而說明MT很有可能也可以直接作用于卵巢來發(fā)揮作用[19]。

Ianas等首先證實(shí)MT是一種抗氧化劑，主要清除羥自由基(-OH)，一分子的MT可以清除二分子的-OH和H2O2[20]。MT除了能直接清除-OH外，還具有比維生素E更有效的清除多聚不飽和脂肪酸(PUFA)氧化過程中產(chǎn)生的過氧化自由基LOO-的作用。MT的高度脂溶性，使其廣泛分布于細(xì)胞膜中，并能插入細(xì)胞膜中脂肪酸的極性頭部之間。這種作用被認(rèn)為是MT保護(hù)細(xì)胞膜抵抗氧化應(yīng)激的另一種方式。MT具有膜受體和核受體，因此能與細(xì)胞核接近而清除DNA附近的ROS。MT還能通過激活DNA的修復(fù)機(jī)制，使DNA免遭各種ROS引起的損傷。MT是目前已知的抗氧化作用最強(qiáng)的內(nèi)源性自由基清除劑，其自由基清除能力是維生素E的2倍、谷胱甘肽的4倍、甘露醇的14倍[21]。

研究表明：MT是一種非酶類抗氧化劑，可以從兩個(gè)方面發(fā)揮抗氧化作用，其分別為：一是可以與自由基結(jié)合，阻止自由基氧化的連鎖反應(yīng)；二是減少自由基的產(chǎn)生。

動(dòng)物機(jī)體內(nèi)伴隨著酶促反應(yīng)和非酶促反應(yīng)可以產(chǎn)生自由基，后者包括氧自由基、羥自由基、過氧自由基和單氧自由基等。MT可以及時(shí)的清除產(chǎn)生的自由基[22]。其清除的機(jī)制可能有：1.通過向缺電子自由基供給電子及清除負(fù)電子O2-,從而為生物大分子提供有效的抗氧化保護(hù)；2.MT代謝產(chǎn)物級聯(lián)抗氧化作用；3.通過調(diào)節(jié)抗氧化酶的表達(dá)間接發(fā)揮抗氧化作用[23]。