孫孟琪，劉浩然，劉小丹，王洪君，王 楠，高 陽，欒天浩，王立春，陳寶玉

(1.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部東北植物營養(yǎng)與農(nóng)業(yè)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長春 130033；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，吉林 長春 130118；3.白城市農(nóng)業(yè)機(jī)械化技術(shù)推廣站，吉林 白城 137000)

土壤微生物是農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，在土壤有機(jī)質(zhì)形成和轉(zhuǎn)化、土壤養(yǎng)分循環(huán)等方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[1].同時，土壤微生物群落組成及活性變化是衡量土壤質(zhì)量和肥力的一個關(guān)鍵性指標(biāo)[2]，而細(xì)菌作為土壤微生物中的重要類群，其多樣性以及群落結(jié)構(gòu)的變化更能夠反映土壤的質(zhì)量狀況[3].農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)在耕作措施和有機(jī)物料的輸入改變土壤理化性質(zhì)的同時，對土壤微生物多樣性及群落結(jié)構(gòu)也產(chǎn)生了不同的影響[4].研究不同秸稈還田方式下土壤微生物多樣性及群落結(jié)構(gòu)演替規(guī)律，對選擇合理的種植措施和改善土壤生態(tài)功能具有重要意義.

淡黑鈣土為吉林省西部的主要土壤類型，其主要特征為腐殖質(zhì)積累過程弱、含量低，因此其肥力效果相對較差[5].作為少數(shù)可受人為調(diào)控的農(nóng)田土壤培肥方式，秸稈還田越發(fā)受到重視.目前，秸稈還田也是該區(qū)域提升地力的有效手段之一，是土壤有機(jī)碳和養(yǎng)分的重要來源[6].大量研究表明，玉米秸稈還田可有效改善土壤有機(jī)質(zhì)下降以及養(yǎng)分過量消耗等問題，有助于提升土壤肥力、增加作物產(chǎn)量[7-8].特別是作物秸稈還田后，可供微生物生命活動的有機(jī)物顯著增加，促進(jìn)了土壤微生物(真菌、細(xì)菌等)的代謝繁殖.陸思旭等[9]研究發(fā)現(xiàn)，渭北地區(qū)旱地農(nóng)田土壤有機(jī)碳是影響微生物碳源代謝的主要因素，而免耕、深松、隔年輪耕為該區(qū)域適宜的耕作措施.李景等[10]對豫西保護(hù)性耕作土壤的研究發(fā)現(xiàn)，免耕、深松覆蓋可改善土壤團(tuán)聚體的狀況，提高土壤微生物的多樣性指數(shù).但針對吉林省西部半干旱區(qū)耕作措施對玉米農(nóng)田土壤微生態(tài)系統(tǒng)的影響尚缺乏認(rèn)識，土壤微生物與生態(tài)環(huán)境間的響應(yīng)機(jī)制仍需探討.

本研究針對不同玉米秸稈還田方式下，玉米農(nóng)田土壤化學(xué)性質(zhì)及酶活性變化特征，利用Illumina Miseq高通量測序技術(shù)，揭示了土壤微生物多樣性、群落結(jié)構(gòu)分布規(guī)律及其與關(guān)鍵環(huán)境因子間的關(guān)系，為進(jìn)一步探明土壤微生物對不同秸稈還田方式的響應(yīng)機(jī)制以及建立適宜該區(qū)域的耕作制度提供了理論支撐與參考依據(jù).

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)域概況

大田試驗(yàn)的地點(diǎn)位于吉林省白城市洮北區(qū)青山鎮(zhèn)生產(chǎn)村(N45°69′，E122°86′).研究區(qū)屬溫帶大陸性季風(fēng)氣候，年平均降水量為399.9 mm，年平均氣溫5.2℃，≥10℃活動積溫平均為2 996.2℃，無霜期平均為144 d，年平均日照時數(shù)為2 915 h.土壤類型為淡黑鈣土，基礎(chǔ)理化性質(zhì)為：土壤全氮含量1.04 g/kg，土壤全磷含量0.31 g/kg，土壤全鉀含量24.79 g/kg，土壤有機(jī)質(zhì)含量20.00 g/kg，pH=6.40.

1.2 試驗(yàn)設(shè)計

試驗(yàn)布設(shè)從2018年開始，連續(xù)耕作兩年.試驗(yàn)采用秸稈全量還田方式，共設(shè)置4個處理：傳統(tǒng)耕作(NT，秸稈不還田+常規(guī)種植，作為對照CK)；覆蓋+秸稈還田(CS)；旋耕+秸稈還田(RS)；旋耕-覆蓋(CRS，第一年覆蓋+第二年旋耕)輪耕處理.采用小區(qū)試驗(yàn)，設(shè)3次重復(fù).每年各處理均于4月末播種，9月末收獲，常規(guī)田間管理.種植品種為翔玉998，播種密度70 000株/hm2，播種前施用復(fù)合肥(m(N)∶m(P2O5)∶m(K2O)=28∶12∶14)作為基肥.

1.3 樣本采集與處理

為了評價連續(xù)兩個耕作季之后的土壤狀況，于2019年9月下旬玉米收獲后，在各處理樣地內(nèi)隨機(jī)取樣.每個處理設(shè)5個土壤采樣點(diǎn)，去除土壤表層植株，采集0～20 cm土壤樣品，用無菌袋收集.將每個處理所有樣品除去土壤中的根系、碎石及其他雜物，充分混勻后分成3份用于微生物多樣性研究.土壤樣本在凍存狀態(tài)下寄送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行測序.用于土壤酶活測定的樣品4℃保存，風(fēng)干樣品用于測定土壤理化性質(zhì).

1.4 土壤化學(xué)性質(zhì)及酶活性指標(biāo)測定

土壤pH值及養(yǎng)分(有機(jī)質(zhì)、全氮、全磷、全鉀、有效氮、速效磷以及速效鉀)含量采用常規(guī)方法進(jìn)行測定.土壤脲酶活性采用苯酚-次氯酸鈉比色法進(jìn)行測定，土壤磷酸酶活性采用磷酸苯二鈉比色法進(jìn)行測定，蔗糖酶活性采用3，5-二硝基水楊酸比色法進(jìn)行測定[11-12].

1.5 PCR擴(kuò)增及測序

利用 E.Z.N.A.? soil DNA Kit (Omega Bio-tek，Norcross，GA，U.S.)土壤試劑盒對供試樣品進(jìn)行土壤微生物總 DNA 的提取，采用細(xì)菌16S rRNA擴(kuò)增引物338F (5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′) 和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′) V3-V4高變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，進(jìn)一步純化后進(jìn)行雙端測序.PCR 反應(yīng)條件為：95℃初變性3 min；95℃變性 30 s，55℃退火 30 min，72℃ 45 s，35個循環(huán)；72℃延伸 10 min；4℃保溫.采用Illumina MiSeq PE300平臺(San Diego，CA，USA)進(jìn)行測序.原始測序序列使用Trimmlmatic軟件進(jìn)行質(zhì)控，使用FLASH軟件進(jìn)行拼接后去除質(zhì)控后長度低于50 bp的序列；去除模糊堿基；根據(jù)重疊堿基overlap將兩端序列進(jìn)行拼接.使用Uparse v7.1 (version 7.1 http：∥drive5.com/uparse/)軟件[13]對有效數(shù)據(jù)在97%相似度水平的OTU代表序列進(jìn)行聚類分析；使用UCHIME軟件剔除嵌合體.基于Silva (SSU123) 16S rRNA數(shù)據(jù)庫，采用RDP分類算法(http：∥rdp.cme.msu.edu/)對每個16S rRNA基因序列進(jìn)行分類分析，置信閾值為70%.根據(jù)測序結(jié)果分析各個水平上統(tǒng)計樣品的群落結(jié)構(gòu).

1.6 數(shù)據(jù)處理

土壤化學(xué)性質(zhì)及酶活性數(shù)據(jù)利用DPS及Microsoft Excel 2017軟件進(jìn)行完全隨機(jī)分析.測序數(shù)據(jù)利用Mothur軟件[14]對序列進(jìn)行抽平，并計算Shannon，Simpson多樣性指數(shù)和Chao1豐富度指數(shù).利用R(v.4.0.3)軟件(R Development CoreTeam，2006) 對不同耕作條件下細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成的變化特征和其主要驅(qū)動因子進(jìn)行熱圖(heatmap)、非度量多維尺度和聚類分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理土壤化學(xué)性質(zhì)的比較

不同處理土壤化學(xué)性質(zhì)的結(jié)果見表1.由表1可見，與CK相比各處理土壤養(yǎng)分含量均存在差異.各處理pH均為中性，且變化并不顯著，其中RS處理土壤pH最低、CRS則最高.從水解性氮含量來看，CS處理模式為最高，較CK提升了38.47%，而RS和CRS處理較CK分別提升了15.39%和7.70%.CS模式顯著提升了土壤有機(jī)質(zhì)含量，較CK提升32.08%，而CRS處理卻降低了12.5%.綜合分析結(jié)果，不同秸稈還田處理中，CS處理對土壤全氮/磷/鉀、速效鉀、有效氮及有機(jī)質(zhì)含量均具有明顯的提升作用；CRS處理模式則不同程度降低了相關(guān)指標(biāo).

表1 不同還田方式下土壤化學(xué)性質(zhì)

已有的研究表明，秸稈以不同方式還于土壤(覆蓋、旋混)，使其被微生物分解的機(jī)會大大增加，可促進(jìn)土壤養(yǎng)分積累；秸稈在腐解的過程中，也會激活土壤中氮、磷和鉀等養(yǎng)分，進(jìn)而提高速效性養(yǎng)分[15-17].本研究中，旋混還田和免耕覆蓋還田方式不但有效增加了土壤有機(jī)碳含量，還改善了土壤pH，有利于植物生長；對比不同處理方式，免耕覆蓋秸稈還田模式對土壤養(yǎng)分總體提升更為顯著.

2.2 不同處理對土壤酶活性的影響

由表2可見，不同耕作措施結(jié)合秸稈還田后，均不同程度地改變了土壤的活性.在土壤蔗糖酶活性方面，CK處理為最高，其次為CS處理，CRS處理為最低；CS處理較CK略有降低，但未達(dá)到顯著水平.土壤脲酶活性則為CS處理最高，較CK處理提升了29.28%，RS次之；CRS處理活性最低，較CK降低5.88%.土壤酸性磷酸酶活性分析結(jié)果顯示，RS>CS>CK>CRS；RS處理較CK活性提升了31.33%，CS提升了20.62%.對比3種方式，CS、RS兩個處理均能夠顯著提高土壤脲酶酸性磷酸酶活性，輪耕模式(CRS)則極顯著降低了蔗糖酶活性，同時脲酶和酸性磷酸酶活性也大大下降.

表2 不同處理土壤酶活性 U/g

土壤酶活性與土壤化學(xué)性質(zhì)、養(yǎng)分含量和耕作方式有著緊密的聯(lián)系，也是評價土壤肥力的關(guān)鍵因素[18-20].秸稈還田后，可以增加土壤氮和碳的供應(yīng)，從而導(dǎo)致脲酶和蔗糖酶活性均相應(yīng)改變.本研究中，不同秸稈還田方式下，免耕覆蓋還田和旋混還田均顯著提高了土壤蔗糖酶及脲酶活性，這主要是由于外源有機(jī)碳(秸稈)的添加，帶來了新的養(yǎng)分，通過微生物作用固存到土壤中.而輪耕模式則使酶活均呈下降趨勢，這主要是由于耕作方式的改變，導(dǎo)致土壤物理性狀發(fā)生改變，進(jìn)一步改變了土壤水、熱、氣的綜合作用效果，使整體酶活性較常規(guī)種植降低.

2.3 不同處理對微生物多樣性的影響

通過16SrRNA基因高通量測序，在97%相似度下降序列聚類分析物種分類單元(OTU)，統(tǒng)計各OTU在不同樣品中的豐度信息并進(jìn)行α-多樣性分析[21-23]，結(jié)果見表3.其中：Sobs指數(shù)是指實(shí)際觀測到的OTU數(shù)目；Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)主要用來衡量物種的多樣性情況；Chao1指數(shù)主要用來衡量物種的豐富度；Coverage指數(shù)主要用來檢測測序?qū)ξ锓N的覆蓋度.根據(jù)多樣性指數(shù)可以看出，所有樣品的覆蓋度均在95%以上，說明取樣合理，所測結(jié)果有效可靠，可真實(shí)反映不同處理?xiàng)l件下土壤中的細(xì)菌群落組成[24-25].由表3可以看出，Shannon以及Chao1指數(shù)為CK>CRS>RS>CS，說明秸稈還田下的3種耕作方式(CS、RS、CRS)土壤群落物種多樣性均略低于常規(guī)種植(CK)方式.而Simpson指數(shù)在4種耕作條件下變化較低，說明秸稈還田耕作方式對細(xì)菌的均勻性起到的作用有限.通過秸稈還田結(jié)合免耕覆蓋、旋混旋耕等耕作措施，土壤的Shannon和Chao1指數(shù)均低于傳統(tǒng)耕作，而Simpson指數(shù)變化有限.這個結(jié)果側(cè)面說明本研究所設(shè)3種耕作措施可在一定程度上富集可分解秸稈的特定微生物種群，導(dǎo)致整體微生物群落發(fā)生改變.

表3 不同處理土壤細(xì)菌多樣性指數(shù)

2.4 不同秸稈還田方式對土壤細(xì)菌群落的影響

2.3.1 土壤細(xì)菌綱水平上的比較

各處理土壤細(xì)菌群落在綱水平上占主要數(shù)量的優(yōu)勢物種基本相同，前4位綱分別為Alphaproteobacteria(15.84%～20.64%)，Actinobacteria(11.15%～14.95%)，Gammaproteobacteria(12.39%～14.09%)以及Blastocatellia Subgroup_4(8.26%～12.24%) (見圖1).與CK(NT)比較發(fā)現(xiàn)，在綱水平上，所占比率較低的Bacteroidia(CK 4.70%，其他5.30%±0.35%)、Saccharimonadia(CK 1.16%，其他2.71%±1.18%)、Verrucomicrobiae(CK 2.08%，其他2.56%±0.33%)占比一致增加，而Holophagae (CK 1.18%，其他0.56%±0.11%)占比一致減少，說明耕作措施以及秸稈還田對土壤細(xì)菌群落在綱水平上有一定影響.Holophagae在CK中所占比率分別高于RS 2.84倍和CRS 2.04倍，Acidobacteriia在CK中所占比率分別低于RS 0.59倍和CRS 0.52倍，說明這兩種綱受到旋混耕作措施的影響顯著.然而，Saccharimonadia在CS和RS中所占比率分別低于CK處理0.44倍和0.28倍，說明Saccharimonadia對不同秸稈還田方式的響應(yīng)更為顯著.

圖1 不同處理樣本綱水平細(xì)菌群落組成

2.3.2 土壤細(xì)菌科水平上的比較

在科分類水平上，共檢測到土壤細(xì)菌362科，其中，CK有324科，CS有309 科，RS和CRS有302科.進(jìn)一步對任意一個樣品豐度高于1.0%的物種在科水平進(jìn)行熱圖(heatmap)分析，結(jié)果(見圖2)表明，前3種豐度最高的科為Pyrinomonadaceae(CK 9.38%，CS 8.73%，RS 5.72%，CRS 7.88%)，Sphingomonadaceae(CK 8.04%，CS 7.24%，RS 9.76%，CRS 7.54%)以及Acidobacteria Subgroup_6(CK 7.69%，CS 9.33%，RS 5.22%，CRS 6.30%)，在不同處理的土壤細(xì)菌群落所占比率為20.69%～25.31%.與CK比較，Pyrinomonadaceae，Burkholderiaceae，Holophagae Subgroup_7，Actinobacteria IMCC26256，Xanthomonadaceae等5科通過秸稈覆蓋還田、旋混還田等處理措施之后豐度一致減少，而Solibacteraceae，Blastocatellaceae，Rhodanobacteraceae，Saccharimonadales，Pedosphaeraceae，Rhizobiaceae，Micropepsaceae豐度一致增加.此外，與CK相比較，Acidobacteria Subgroup_6和Xanthobacteraceae僅在旋混還田處理中分別增加了32%和30%，而Rokubacteriales減少了51%.這些結(jié)果說明本研究中所設(shè)的3種不同秸稈還田結(jié)合耕作措施處理顯著改變了土壤細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu).

圖2 不同處理樣本科水平豐度前30的群落熱圖(heatmap)

已有研究表明，Rhodanobacteraceae細(xì)菌可以利用不同的碳基作為碳源，而Saccharimonadales細(xì)菌可促進(jìn)植物自身及其衍生有機(jī)物的降解.此外，Blastocatellaceae細(xì)菌與聚合物的碳代謝有關(guān).由于秸稈還田可直接增加各處理土壤的有機(jī)物含量，而這些有機(jī)物可被微生物降解，進(jìn)而使有機(jī)質(zhì)及養(yǎng)分等物質(zhì)在秸稈還田的土壤中較常規(guī)種植土壤增加.

2.4 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化與環(huán)境因子的關(guān)系

基于各OTU的Bray-curtis聚類圖譜分析(見圖3)表明，在OTU水平上4種不同耕作處理間細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異顯著(最大差異為30%).與常規(guī)耕作比較，OTU水平上群落結(jié)構(gòu)變化為CRS>RS>CS，說明土壤中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)受到耕作措施的影響較大.

圖3 不同處理樣本細(xì)菌群落聚類分析

利用非度量多維尺度分析和聚類 (NMDS)結(jié)合環(huán)境因子進(jìn)行的相關(guān)性分析(見圖4)發(fā)現(xiàn)，土壤中pH、速鉀、全氮、有機(jī)質(zhì)含量以及土壤脲酶是細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化的主要驅(qū)動因子(P<0.01)，其中，土壤中有機(jī)質(zhì)和全氮含量對細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化貢獻(xiàn)度最大.

3 結(jié)論

本研究針對吉林省西部半干旱區(qū)典型淡黑鈣土地區(qū)農(nóng)田土壤，采用高通量測序方法，對不同耕作措施結(jié)合秸稈還田后土壤養(yǎng)分變化、土壤酶活性、微生物多樣性及群落結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行了研究，結(jié)果表明：(1)秸稈覆蓋還田與旋混還田均可提高土壤中氮、磷、鉀以及有機(jī)質(zhì)含量并降低土壤pH；(2)秸稈覆蓋還田與旋混還田均能夠有效地富集 Rhodanobacteraceae，Saccharimonadales，Solibacteraceae，Blastocatellaceae細(xì)菌；(3)pH、速鉀、全氮、有機(jī)質(zhì)含量以及土壤脲酶活性是細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化的主要驅(qū)動因子(P<0.01).以上研究為進(jìn)一步探明土壤微生態(tài)對秸稈還田的響應(yīng)機(jī)制，以及建立適宜吉林省西部半干旱區(qū)農(nóng)田的秸稈還田模式提供了理論支撐與科學(xué)依據(jù).