伊六喜，薩如拉，王樹彥，李志偉，斯欽巴特爾，李 強

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010019；2.內(nèi)蒙古科技大學(xué) 包頭醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014060；3.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031)

亞麻(LinumusitatissimumL.)屬于亞麻科亞麻屬，一年生或多年生草本植物，一般分為油用亞麻和纖維亞麻2種。亞麻籽中含有35%～45%的油脂，主要含油酸、亞油酸、亞麻酸的不飽和脂肪酸和硬脂酸、棕櫚酸的飽和脂肪酸，其中不飽和脂肪酸含量占85%以上[1]。亞麻除了較高的不飽和脂肪酸以外含有木酚素、亞麻膠、膳食纖維等多種有效營養(yǎng)成分，具有止痛、消腫、抗癌癥、解熱毒等藥用價值[2]。木酚素(Lignan)是植物代謝合成的一種雌激素，具有抗腫瘤、預(yù)防心血管疾病、糖尿病等功效，王榮等[3]研究表明，亞麻籽木酚素抑制大鼠高血脂癥狀。黨學(xué)良等[4]用亞麻籽木酚素喂糖尿病小鼠，結(jié)果表明能提高小鼠的學(xué)習(xí)記憶。Pan等[5]發(fā)現(xiàn)亞麻木酚素對前列腺患者康復(fù)有作用。目前，亞麻、谷類、水果、蔬菜中均發(fā)現(xiàn)了木酚素，其中亞麻籽木酚素含量最高，約為其他植物含量的75～800倍[6]。因此，亞麻木酚素含量的遺傳改良研究對亞麻籽功能性食品開發(fā)和藥用研究具有重要意義。

亞麻木酚素含量與亞麻品種、種植方式、氣候等因素有關(guān)，同類型亞麻不同環(huán)境下木酚素含量有顯著差異。因此，亞麻木酚素含量與許多重要農(nóng)藝性狀一樣屬于多基因控制的數(shù)量性狀，傳統(tǒng)育種很難短期選育出高木酚素含量的亞麻新品種。基于分子標(biāo)記的基因QTL(Quantitative trait loci)定位的標(biāo)記輔助選擇(MAS)，實現(xiàn)了直接對目標(biāo)性狀基因型的選擇，大幅度提高了育種的選擇效率，縮短了育種年限[7]。因此，表型和分子標(biāo)記關(guān)聯(lián)分析研究對亞麻木酚素含量的遺傳改良具有重要意義。本研究以220份亞麻種質(zhì)材料為研究對象，采用高效液相色譜法檢測亞麻籽木酚素含量，與SSR標(biāo)記基因型數(shù)據(jù)進行關(guān)聯(lián)分析，獲得亞麻木酚素含量顯著關(guān)聯(lián)位點，為亞麻木酚素含量遺傳改良和開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

來自11個國家的220份亞麻核心資源材料，包括國外資源材料105份(加拿大13份、美國17份、法國9份、阿根廷8份、荷蘭15份、俄羅斯5份、匈牙利17份、伊朗6份、巴基斯坦10份、波蘭5份)，國內(nèi)資源材料116份(寧夏12個、新疆8個、內(nèi)蒙古33個、河北15個、甘肅34個、山西14個)。

1.2 田間試驗及采樣

2018年種植于呼和浩特市和烏蘭察布市集寧區(qū)。物候條件、播種和收獲時間見表1。田間播種采用隨機區(qū)組設(shè)計，重復(fù)3次，3行種植，每行種400粒種子，行長2.0 m，行距20.0 cm。常規(guī)的田間管理方法進行管理。同時，在生育期內(nèi)對2個地區(qū)的氣溫、降水量和日照時數(shù)等氣象因子做記錄。出苗后，取0.10 g新鮮嫩葉子-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。種子成熟后用樣品研磨機磨碎，稱取1.00 g，密封備用。

表1 2個種植區(qū)的地理位置、氣候條件Tab.1 Geographical location and climatic conditions of the two growing areas

1.3 亞麻木酚素含量測定

取出1.00 g的亞麻粉，用無水乙醚浸泡16 h，室溫放置6 h，烘干1 h，冷卻至室溫，倒入50 mL的離心管，加入30 mL的60%的乙醇，在50 ℃條件振蕩裂解40 min，以8 000 r/min離心5 min，取上清液加入5 mL 3.6 mol/L氫氧化鈉溶液，在40 ℃條件振蕩裂解20 min，用6 mol/L鹽酸溶液調(diào)pH值為5，移入茄形瓶中，49 ℃真空濃縮至干，用40%的甲醇溶液溶解定容至100 mL，取出20 mL，過濾上機分析。色譜柱：C18柱，250.0 mm×4.6 mm，柱填料粒徑5 μm。檢測波長為290 nm，柱箱溫度為35 ℃，進樣量為20 μL。亞麻木酚素標(biāo)準(zhǔn)品購自上海源葉生物科技有限公司。用SPSS 19.0軟件統(tǒng)計分析木酚素含量表型數(shù)據(jù)[8]。

1.4 亞麻基因組DNA提取及SSR基因型檢測

取出-80 ℃保存的樣品，用已備冷凍玻璃棒破碎，參照Stewart等[9]提出的CTAB法提取基因組DNA，用瓊脂糖凝膠和核酸測定儀檢測DNA的純度和濃度。NCBI下載亞麻全基因組序列信息(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCA_000224295.2)和亞麻EST-SSR信息，利用MISA軟件和SSR IT軟件[10]檢測亞麻SSR引物信息。共得到81 369對SSR引物，利用Primer Primier 5.0軟件默認(rèn)參數(shù)(長度120～300 bp，Tm值57～65 ℃，引物長度20～25 bp)進行引物設(shè)計，在設(shè)計結(jié)果中選擇150對SSR引物(金斯瑞生物科技有限公司合成)，其中篩選出30對條帶清晰，重復(fù)性好的引物(表2)，對供試材料進行基因型檢測。PCR反應(yīng)體系為25.0 μL(TaqMaster Mix：12.5 μL、10 μmol/L引物共1.0 μL、40 ng DNA模板3.0 μL、超純水8.5 μL)，擴增程序為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，56 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min，4 ℃保存[11]。產(chǎn)物用6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，恒功率70 W電泳1.5 h，采用銀染法顯色[12]。通過DNA Marker1500，統(tǒng)計DNA差異條帶，標(biāo)記為“0”或“1”。

1.5 關(guān)聯(lián)分析

用TASSEL軟件[13]的廣義線性模型(GLM)混合線性模型(MLM)對表型數(shù)據(jù)和基因型數(shù)據(jù)進行關(guān)聯(lián)分析。將30對引物所獲得的203個多態(tài)性位點與220份亞麻種質(zhì)的木酚素含量數(shù)據(jù)合并，得到各位點的顯著性水平及其對表型變異的解釋率。本研究選擇顯著性水平為P<0.01。

表2 SSR引物名稱與序列信息Tab.2 SSR primer name and sequence information

2 結(jié)果與分析

2.1 亞麻木酚素含量的統(tǒng)計分析

用高效液相色譜法對亞麻種質(zhì)木酚素含量進行2 a 2點的重復(fù)檢測，獲得了精準(zhǔn)亞麻木酚素含量的表型數(shù)據(jù)(表3)。統(tǒng)計結(jié)果表明，220份亞麻種質(zhì)木酚素含量均值7.37 mg/g，變幅為3.24～11.76 mg/g，變異系數(shù)為20.34%，廣義遺傳率61.03%。2017年，呼和浩特地區(qū)木酚素含量較高的品種分別為PAKISTAN161(12.15 mg/g)和RuSSIA5(13.25 mg/g)，2018年，集寧地區(qū)木酚素含量較高的品種分別為CFRESBR94(11.81 mg/g)和RuSSIA5(13.33 mg/g)，其中RuSSIA5品種在集寧地區(qū)2 a的木酚素含量均最高，表明此品種木酚素含量較高且穩(wěn)定。以上3個品種均是國外引進品種。國內(nèi)品種(系)中木酚素含量較高的品種是壩亞11號(11.79 mg/g)、壩亞6號(11.11 mg/g)、同亞9號(11.41 mg/g)、烏41號(9.63 mg/g)等4個品種。對2 a 2個環(huán)境條件下檢測的亞麻籽木酚素含量進行正態(tài)分布檢驗，結(jié)果表明，均有正態(tài)分布趨勢(圖1)，表明亞麻木酚素含量是受環(huán)境影響的數(shù)量性狀。

表3 亞麻木酚素含量的統(tǒng)計分析Tab.3 Statistical analysis of linseed lignans content

2.2 SSR引物多態(tài)性分析

由表4可知，對150對SSR引物進行PCR擴增，篩選出了30對多態(tài)性好、穩(wěn)定的引物，共擴增出371個位點，其中203個多態(tài)性位點，平均擴增率為56.28%，Lu_291和Lu_83b引物擴增的多態(tài)性位點最多(10個)，Lu_511引物的多態(tài)性位點百分率最高(80.00%)。有效等位基因數(shù)1.19～1.82，平均為1.41。引物多態(tài)性含量為0.27～0.63，平均值0.43，Lu_a37引物PIC值最大(0.63)。Lu_661引物的29份亞麻種質(zhì)上擴增結(jié)果見圖2。

表4 30對SSR引物組合對220份亞麻品種的擴增結(jié)果Tab.4 Amplification of 220 flax cultivars using 30 pairs of SSR primer

2.3 群體結(jié)構(gòu)分析

采用Admixture軟件[14]構(gòu)建群體遺傳結(jié)構(gòu)和群體世系信息。將220份品種的群體結(jié)構(gòu)的分群數(shù)K值設(shè)置為2～10，進行Structure分析。根據(jù)種質(zhì)之間的交叉驗證錯誤率CV最小時K=4，表明最佳分群K值為4，即220份品種(系)分為4個群(圖3)。第1個群共有49個種質(zhì)，其中32個種質(zhì)材料的遺傳背景較純，其他17份材料含有多種遺傳成分，屬于混合型；第2個群共有61個品種(系)，其中28份材料遺傳背景較純，其他33份品種均為混合型。第4個群體有53個品種，其中遺傳背景較純的品種40份，其余的均為混合型；第4個群共57個品種(系)，其中34個種質(zhì)材料的遺傳背景較純，其他23份材料含有多種遺傳成分。220份亞麻資源材料中134份種質(zhì)的遺傳背景比較純，占關(guān)聯(lián)群體材料的60.90%，86份種質(zhì)材料含有不同程度的其他遺傳成分，占關(guān)聯(lián)群體材料的39.10%。按地理來源看，第1個和第2個群中主要分布國外種質(zhì)(共64份)，占第1和第2群種質(zhì)的58.18%；第3個和第4個群中主要分布國內(nèi)品種(82份)，占第3和第4群種質(zhì)的74.54%(圖4)。表明國內(nèi)外品種基本能分開，遺傳差異較大。

2.4 基于SSR標(biāo)記的關(guān)聯(lián)分析

30對SSR引物對220份亞麻材料擴增出343個多態(tài)性位點，與2 a 2個環(huán)境條件下檢測的亞麻木酚素含量進行廣義線性模型(GLM)和混合線性模型(MLM)的關(guān)聯(lián)分析，GLM模型分析共檢測到18個SSR位點，其中2017年檢測到9個位點(呼和浩特4個位點、集寧5個位點)，2018年檢測到9個位點(呼和浩特6個位點、集寧3個位點)，表型解釋率為2.07%～13.18%。MLM模型分析共檢測到16個位點，表型解釋率為3.06%～15.03%，LU_83b位點在GLM(13.18%)和MLM(15.03%)下表型解釋率均較高。LU_203標(biāo)記在2017年2個環(huán)境下共同檢測到，表型解釋率呼和浩特地區(qū)3.61%(GLM)和3.06(MLM)，集寧地區(qū)12.51%(GLM)和11.29%(MLM)。LU_661標(biāo)記在呼和浩特(2017年)和集寧(2018年)地區(qū)共同檢測到，表型解釋率呼和浩特地區(qū)4.84%(GLM)和4.58%(MLM)，集寧地區(qū)6.95%(GLM)和5.11%(MLM)。LU_330標(biāo)記在集寧地區(qū)2 a均檢測到，2017，2018年表型解釋率分別為4.92%(GLM)，3.18%(MLM)和10.84%(GLM)，11.87%(MLM)。表明LU_203、LU_661和LU_330標(biāo)記在不同的環(huán)境條件下均檢測到，穩(wěn)定性好(表5)，進一步驗證可以開發(fā)實用性分子標(biāo)記。

表5 亞麻木酚素含量與SSR標(biāo)記的關(guān)聯(lián)分析Tab.5 Correlation analysis between linseed lignans content and SSR Markers

表5(續(xù))

3 討論

亞麻木酚素是對人類健康效益諸多的有效成分，具有較高的保健功能。近幾年隨著色譜檢測技術(shù)的發(fā)展，植物有效成分含量的鑒定評價研究越來越多。國內(nèi)外學(xué)者對亞麻木酚素的理化性質(zhì)進行了大量研究，建立了提取方法和檢測體系。前人采用高效液相色譜法檢測亞麻籽木酚素含量，優(yōu)化構(gòu)建了亞麻木酚素檢測體系[15]。本研究在前人構(gòu)建的檢測體系的基礎(chǔ)上，對提取步驟略有改變。220份亞麻種質(zhì)木酚素含量變幅為3.24～11.76 mg/g，與馮小慧等[8]對7份亞麻品種的檢測數(shù)據(jù)(木酚素含量變幅為4.80～8.50 mg/g)基本吻合。因此，使用高效液相色譜法檢測亞麻木酚素含量可以獲得精準(zhǔn)的表型數(shù)據(jù)，能滿足分子標(biāo)記與表型性狀的關(guān)聯(lián)分析。

植物種質(zhì)資源表型分析對于提供多樣化育種親本、擴大品種遺傳基礎(chǔ)、挖掘有效等位基因等方面都是非常重要的。表型性狀能直接反映作物的生長發(fā)育情況，它是基因和環(huán)境的互作的表現(xiàn)形式。植物基因比較穩(wěn)定，因此，作物在不同自然環(huán)境中產(chǎn)生表型差異是主要環(huán)境差異導(dǎo)致的[16]。本研究中篩選出了7個高木酚素含量的亞麻品種，其中PAKISTAN161(12.15 mg/g)、CFRESBR94(11.81 mg/g)和RuSSIA5(13.25 mg/g)是國外引進品種，壩亞11號(11.79 mg/g)、壩亞6號(11.11 mg/g)、同亞9號(11.41 mg/g)和烏41號(9.63 mg/g)等4個品種是國內(nèi)品種。以上品種對高木酚素含量亞麻新品種選育提供遺傳資源。

亞麻籽是植物木酚素的主要來源，在人體內(nèi)可以轉(zhuǎn)變成植物雌激素化合物，可以抑制激素敏感型癌癥的發(fā)生和擴散，科學(xué)家們推薦每天食用2～4勺亞麻籽，能防止癌癥和腫瘤的發(fā)生。因此，市場上迫切需要高木酚素含量的亞麻品種，但常規(guī)育種選育新品種周期長，效率低。關(guān)聯(lián)分析是應(yīng)用基因組中分子遺傳標(biāo)記，進行基因水平上的對照分析或相關(guān)性分析，通過比對發(fā)現(xiàn)影響目標(biāo)性狀基因變異的一種新策略。近年，隨著亞麻參考基因組數(shù)據(jù)公布[17]，亞麻品質(zhì)和產(chǎn)量相關(guān)性狀關(guān)聯(lián)分析在國內(nèi)外已有報道[18]。但亞麻木酚素含量的SSR關(guān)聯(lián)分析未見報道。王蕾[19]對86份芝麻種質(zhì)的木酚素含量進行全基因組關(guān)聯(lián)分析獲得了172個SNP位點。亞麻課題組對269份亞麻種質(zhì)進行全基因組關(guān)聯(lián)分析獲得了13個顯著SNP位點和21個候選基因[20]。本研究通過亞麻木酚素含量與SSR標(biāo)記的關(guān)聯(lián)分析，獲得了木酚素含量顯著關(guān)聯(lián)的18個SSR位點，其中LU_203、LU_661和LU_330標(biāo)記不同環(huán)境條件下均檢測到，可以通過驗證開發(fā)實用性標(biāo)記，為高木酚素含量亞麻新品種選育提供基礎(chǔ)。以上研究對植物木酚素含量相關(guān)基因的挖掘以及高木酚素含量新品種選育提供依據(jù)。