姜 芬，丁 坤，李紹先，徐 軍，徐艷麗

2019新型冠狀病毒肺炎（coronavirus disease 2019,COVID-19）疫情在全球200多個國家和地區(qū)持續(xù)暴發(fā)[1-2]，病原體為嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2），屬β冠狀病毒[3]。是繼中東呼吸綜合征冠狀病毒和嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒之后的第三種引起人類嚴(yán)重呼吸道疾病的人畜共患病冠狀病毒，也是近20年來第一種引發(fā)全球大流行的冠狀病毒。

對潛伏期患者、無癥狀感染者SARS-CoV-2脫落和播散的研究[4-5]以及從糞便中持續(xù)檢出SARSCoV-2的報道引發(fā)了相關(guān)研究者對該感染性疾病管理控制的廣泛關(guān)注[6-7]。某些COVID-19患者病毒核酸檢測出現(xiàn)復(fù)陽現(xiàn)象，盡管大多推測與檢測靈敏度有關(guān)[8]，但亦可能與病毒載量低或病毒脫落規(guī)律不同有關(guān)。據(jù)統(tǒng)計，在出院患者中病毒核酸檢測在短暫連續(xù)2次或以上陰性后復(fù)陽的患者數(shù)占出院患者總數(shù)的21.4%[9]；此外，超過20.0%的患者在呼吸道標(biāo)本病毒核酸轉(zhuǎn)陰后，其糞便標(biāo)本的病毒核酸檢測仍呈陽性[10]，部分出院患者胃腸道標(biāo)本中病毒核酸檢測持續(xù)陽性[11]。推測SARSCoV-2可能通過糞-口途徑傳播，增加了二次傳播的風(fēng)險，也解釋了醫(yī)院感染的原因，如何根據(jù)各類患者特征進行針對性管理和預(yù)防控制尤為重要。本研究對COVID-19出院患者鼻咽拭子和糞便標(biāo)本病毒脫落時間進行隨訪，以評價復(fù)陽患者的臨床特征和病毒轉(zhuǎn)陰時間，以期為COVID-19患者管理控制提供針對性指導(dǎo)意見。

1 對象和方法

1.1 對象 收集2019年1月15日—2020年2月10日煙臺市奇山醫(yī)院收治的43例COVID-19確診患者為研究對象。根據(jù)住院期間是否出現(xiàn)鼻咽拭子或痰液標(biāo)本病毒核酸檢測復(fù)陽，將患者分為復(fù)陽組（n=15）與未復(fù)陽組（n=28）。出院后隔離期間每4～7 d復(fù)查鼻咽拭子和糞便標(biāo)本病毒核酸，因患者咳痰癥狀均已消失，遂出院隨訪未采集痰液標(biāo)本。本研究符合1975年赫爾斯基宣言并經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會審查同意。

1.2 方法 收集所有研究對象的一般資料及臨床特征、實驗室檢查結(jié)果、治療措施（包括抗病毒、免疫調(diào)節(jié)劑、呼吸支持、抗生素治療等）、流行病學(xué)史資料以及病毒核酸檢測結(jié)果。所有患者均按照國家衛(wèi)生健康委員會發(fā)布的《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第七版）》[12]進行診斷和治療；采用實時熒光反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcriptase-polymerase chain reaction,RT-PCR）進行SARS-CoV-2核酸檢測。

1.3 相關(guān)定義及標(biāo)準(zhǔn) 患者出院標(biāo)準(zhǔn)：①體溫恢復(fù)正常3 d以上（不使用皮質(zhì)類固醇或退熱劑）；②呼吸道癥狀明顯好轉(zhuǎn)；③肺部影像學(xué)顯示炎癥明顯吸收；④連續(xù)2次呼吸道標(biāo)本SARS-CoV-2核酸檢測陰性（采樣時間間隔≥24 h）。初始病毒核酸轉(zhuǎn)陰時間：SARS-CoV-2核酸檢測至少2次連續(xù)陰性結(jié)果中首次陰性的時間。病毒核酸復(fù)陽患者：在至少連續(xù)3次病毒核酸檢測陰性后（采樣時間間隔＞24 h），再次出現(xiàn)病毒核酸陽性者。病毒最長脫落時間：從發(fā)病之日起至連續(xù)2次病毒核酸檢測陰性之日為止，且在至少2周的隨訪期間未出現(xiàn)核酸檢測陽性結(jié)果。其中，對于病毒核酸復(fù)陽患者，病毒最長脫落時間為從發(fā)病之日起至隨訪期間最后一次SARS-CoV-2核酸檢測呈陽性之日。間斷陰性狀態(tài)：連續(xù)2次或以上病毒核酸RT-PCR檢測為陰性后病毒核酸復(fù)陽之前的狀態(tài)，時間計算為從第1 d核酸檢測為陰性到連續(xù)陰性檢測結(jié)束。實驗室檢測指標(biāo)正常參考值：白細胞計數(shù)（3.5～9.5）×109/L、中性粒細胞計數(shù)（1.8～6.3）×109/L、淋巴細胞計數(shù)（1.1～3.2）×109/L、血小板計數(shù)（125～ 350）×109/L、CRP 0～5 mg/L、血清淀粉樣蛋白A（serum amyloid A,SAA）＜10 mg/L。

1.4 標(biāo)本采集 采集患者鼻咽拭子、痰和糞便標(biāo)本，并將樣本存放于2～8 ℃的病毒轉(zhuǎn)運介質(zhì)中。痰液標(biāo)本，鼓勵患者嚴(yán)重咳嗽，將痰液收集到一次性無菌旋轉(zhuǎn)蓋取樣杯中，加入2 ml蛋白酶K（1 g/L），30 min內(nèi)進行病毒核酸檢測；血清樣本收集于血清分離管中進行離心操作。

1.5 SARS-CoV-2核酸檢測 使用QIAamp病毒核酸迷你試劑盒試劑（德國凱杰）提取和純化核酸。使用SARS-CoV-2核酸檢測試劑盒（中山大學(xué)達安基因，中國廣州）進行RT-PCR檢測，針對SARS-CoV-2基因組的Orf1ab區(qū)域和N基因，使用QuantStudio 5 RT-PCR系統(tǒng)（美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）。陽性定義為2次獨立重復(fù)試驗至少1次成功擴增，周期閾值為40。中間陰性RT-PCR結(jié)果持續(xù)＜3 d或＜2次連續(xù)試驗視為無效或假陰性結(jié)果[9]?；颊呷朐汉?，每隔1 d采集鼻咽拭子標(biāo)本和痰標(biāo)本進行病毒核酸檢測，直至患者符合出院標(biāo)準(zhǔn)。出院后每4～7 d收集患者鼻咽拭子標(biāo)本和糞便標(biāo)本，進行病毒核酸檢測。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SAS 9.4軟件進行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計量資料用±s表示，組間差異比較采用t檢驗；非正態(tài)分布計量資料以中位數(shù)和四分位數(shù)[M（P25，P75）]表示，組間比較采用Mann-Whitney U檢驗。計數(shù)資料以例數(shù)（%）表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher精確檢驗。統(tǒng)計學(xué)檢驗均為雙側(cè)檢驗，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 一般特征 43例患者中男性22例（51.2%），女性21例（48.8%），中位年齡47.0（37.0，54.0）歲，入院時發(fā)病中位時間為3.0（2.0，6.0）d，住院中位時間為25.0（19.0，29.0） d，10例（23.3%）患者具有基礎(chǔ)疾病史（高血壓、糖尿病、支氣管哮喘、潰瘍性結(jié)腸炎、冠心病及貧血），5例（11.6%）患者為重癥患者。所有患者均接受抗病毒藥物（利托那韋/洛匹那韋）治療；21例（48.8%）患者接受經(jīng)驗性抗生素治療；41例（95.3%）患者從入院開始接受吸入IFN治療（8000 U，2噴/次，3次/d）；12例（27.9%）患者CD4淋巴細胞計數(shù)異常下降，接受胸腺肽皮下注射治療（1.6 mg，2次/周）；8例（18.6%）患者接受氧療；經(jīng)治療后所有患者均完全康復(fù)。復(fù)陽組和未復(fù)陽組在年齡、性別、入院時發(fā)病時間、基礎(chǔ)疾病史等方面差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P均＞0.05），復(fù)陽組患者住院時間更長（Z=0.425，P=0.016）。未復(fù)陽組患者接受抗生素治療比例高于復(fù)陽組（P＜0.05）。詳見表1。

表1 43例COVID-19患者的一般資料Table 1 General information of 43 COVID-19 patients

2.2 臨床表現(xiàn)和實驗室檢查結(jié)果 43例患者最常見的癥狀為咳嗽（88.4%）、咳痰（79.1%）和發(fā)熱（76.7%），上述癥狀的中位持續(xù)時間分別為18.0（8.0，26.0） d、10.5（5.0，20.0） d和7.0（3.5，10.5） d；大約1/3的患者伴有胸痛、焦慮/失眠等癥狀。入院時實驗室檢查結(jié)果顯示25.6%患者白細胞計數(shù)減少，20.9%患者淋巴細胞計數(shù)下降，34.9%患者CRP水平升高，20.9%患者SAA水平升高。與未復(fù)陽組相比，復(fù)陽組患者均為普通型，最高體溫更低，咳痰持續(xù)時間更短，ESR、CRP、SAA水平更低（P均＜0.05）。詳見表2。

表2 43例COVID-19患者的臨床表現(xiàn)和實驗室檢查結(jié)果[例(%)]Table 2 Clinical manifestations and laboratory test results of 43 COVID-19 patients[cases(%)]

2.3 實驗室檢查

2.3.1 呼吸道標(biāo)本中SARS-CoV-2脫落時間 43例患者鼻咽拭子和痰液標(biāo)本中SARS-CoV-2核酸轉(zhuǎn)陰的中位時間分別為15.5（13.0，23.0）d和24.0（14.0，31.0）d，鼻咽拭子短于痰液樣本。雖然2組患者鼻咽拭子標(biāo)本病毒核酸初始轉(zhuǎn)陰時間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但復(fù)陽組鼻咽拭子標(biāo)本病毒最長脫落時間顯著延長，痰液標(biāo)本中病毒脫落時間較未復(fù)陽組也顯著延長，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義，詳見表3。住院期間復(fù)陽組患者中以鼻咽拭子標(biāo)本復(fù)陽比例較高為93.3%（14/15），痰液標(biāo)本病毒核酸較少出現(xiàn)復(fù)陽現(xiàn)象，僅1例。

表3 43例 COVID-19患者的病毒核酸檢測/持續(xù)時間（d）Table 3 Viral nucleic acid test/duration of 43 COVID-19 patients(d)

2.3.2 糞便標(biāo)本核酸檢測結(jié)果及出院后隨訪 本研究中共采集了10例患者住院期間的糞便標(biāo)本并進行SARS-CoV-2核酸檢測，其中4例顯示陽性，均為復(fù)陽組患者。更值得注意的是，這4例患者中，有3例在鼻咽拭子標(biāo)本核酸檢測結(jié)果轉(zhuǎn)陰后糞便標(biāo)本中仍能檢測到病毒核酸。為進一步研究復(fù)陽患者病毒脫落模式，對康復(fù)患者鼻咽拭子和糞便樣本病毒核酸進行追蹤檢測，發(fā)現(xiàn)共有7例患者治愈出院后經(jīng)隨訪檢測到病毒核酸陽性（5例糞便標(biāo)本病毒核酸陽性，3例鼻咽拭子病毒核酸陽性），其中1例鼻咽拭子和糞便標(biāo)本同時復(fù)陽。上述出院后隨訪病毒檢測陽性者均為住院期間鼻咽拭子病毒復(fù)陽組患者，且患者糞便標(biāo)本病毒核酸陽性持續(xù)時間最長可達出院后19 d。

2.4 胸部CT 典型COVID-19患者胸部CT表現(xiàn)呈雙肺多發(fā)斑片狀磨玻璃影。本研究中所有患者出院時胸部CT表現(xiàn)均有改善，而呼吸道標(biāo)本SARS-CoV-2核酸復(fù)陽和糞便標(biāo)本中病毒核酸持續(xù)陽性患者均未發(fā)現(xiàn)胸部CT較前改變。

3 討 論

目前，SARS-CoV-2核酸檢測復(fù)陽現(xiàn)象被認為是RT-PCR檢測假陰性的結(jié)果[11]，但尚未排除其他可能性。牛衛(wèi)東等[13]的研究表明痰液標(biāo)本的SARS-CoV-2核酸陽性檢出率遠遠高于咽拭子標(biāo)本和鼻拭子標(biāo)本。病毒脫落通常被視作傳染性的標(biāo)志[14]，研究表明，非危重患者呼吸道標(biāo)本中SARS-CoV-2脫落中位時間約為18～20 d，下呼吸道比上呼吸道標(biāo)本病毒脫落時間更長[15-19]。另有報道稱約21.4%的患者在連續(xù)2次SARS-CoV-2核酸檢測結(jié)果轉(zhuǎn)陰后出現(xiàn)復(fù)陽，連續(xù)3次鼻咽拭子陰性的患者肺中仍然有SARS-CoV-2殘留[9]。本研究中34.9%的患者在短暫的病毒核酸檢測轉(zhuǎn)陰后又復(fù)陽，且與未復(fù)陽組患者相比，該類患者多表現(xiàn)為輕度感染、輕度發(fā)熱、咳痰時間短，痰液標(biāo)本中病毒脫落時間較上呼吸道標(biāo)本更長，糞便標(biāo)本病毒核酸陽性率更高，與上述研究結(jié)果吻合。有研究結(jié)果顯示，在患者腸道原位檢測到病毒復(fù)制信號[20]或腸道高表達SARS-CoV-2感染所需受體[21]。根據(jù)本研究中病毒核酸復(fù)陽患者不同部位采集標(biāo)本病毒清除時間、病毒持續(xù)脫落趨勢特征，推測胃腸道存在病毒受體的可能。有學(xué)者將患者病毒核酸檢測復(fù)陽現(xiàn)象歸因于取樣、RT-PCR檢測假陰性和核酸轉(zhuǎn)陰時間延長等因素，然而，病毒感染在某些靶細胞潛伏或與相應(yīng)受體反應(yīng)的可能性并沒有被排除，這須要進一步研究病毒載量、分離測序病毒株等。

有研究報道，較高病毒載量、上呼吸道較長的病毒脫落時間與疾病嚴(yán)重程度有關(guān)[14，16，22]。本研究尚未發(fā)現(xiàn)病毒脫落時間延長與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)的證據(jù)，恰恰相反，本研究中復(fù)陽組患者更多表現(xiàn)為輕癥，且5例重癥患者均未發(fā)生病毒核酸檢測結(jié)果復(fù)陽的現(xiàn)象?？紤]結(jié)論不一致的原因可能為多方面，首先，本研究中的復(fù)陽組并不能代表全部病毒清除延遲患者群體；其次，考慮慢性病毒脫落或病毒變異株產(chǎn)生[23-24]、機體適應(yīng)性免疫應(yīng)答變化等因素導(dǎo)致患者病毒核酸檢測復(fù)陽或病毒清除延遲，而與疾病嚴(yán)重程度無關(guān)。

最近從COVID-19患者糞便樣本中分離得到SARS-CoV-2的研究證實，該病毒可能通過胃腸道傳播[25-28]，其他研究也發(fā)現(xiàn)57.1%的病毒核酸檢測復(fù)陽患者在其糞便樣本中檢測出SARS-CoV-2核酸，且持續(xù)時間比呼吸道樣本更長，病毒載量峰值出現(xiàn)更晚[29-31]。本研究中也存在部分復(fù)陽患者在其呼吸道樣本中幾乎檢測不到病毒核酸的情況下，糞便標(biāo)本依然呈現(xiàn)持續(xù)病毒核酸陽性，且無臨床癥狀，與上述研究結(jié)果吻合，提示糞便標(biāo)本病毒檢測是判斷患者出院和解除隔離的另一種可行性指標(biāo)，特別是針對核酸檢測復(fù)陽患者。另外，本研究中未發(fā)現(xiàn)糞便標(biāo)本中病毒核酸檢出率和持續(xù)時間與疾病嚴(yán)重程度、疾病進展的關(guān)系，與既往研究一致[32]，考慮可能與宿主免疫應(yīng)答或胃腸道黏膜免疫有關(guān)[33]。

綜上所述，SARS-CoV-2核酸復(fù)陽患者更可能表現(xiàn)為輕癥感染，同時該類患者存在痰液標(biāo)本病毒脫落延遲和糞便標(biāo)本病毒核酸持續(xù)陽性的特點，因而對病毒核酸復(fù)陽患者應(yīng)給予特別關(guān)注和更長時間的醫(yī)學(xué)觀察，以預(yù)防和控制疫情的再次傳播。

當(dāng)然，本研究也存在一定局限性，首先，本研究樣本量較小，對COVID-19患者的治療方案是經(jīng)驗性的，實施的藥物干預(yù)特別是抗病毒藥物和免疫調(diào)節(jié)劑對病毒排出的影響尚未確定被排除；其次，本研究未進行病毒載量和活病毒顆粒分離，不能從病毒核酸痕跡中得出具體的傳染性結(jié)論；再次，未進行SARS-CoV-2的IgG或IgM抗體檢測來描述不同標(biāo)本陽性檢測的精確時間窗。COVID-19作為一種新發(fā)傳染病，我們對于SARSCoV-2在臨床特征等方面的認識尚有不足，仍須進一步持續(xù)跟蹤探究，用以指導(dǎo)臨床、預(yù)后判斷和和傳播控制。