樊文哲，孫雪梅，吳德全

（哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 普通外科，黑龍江 哈爾濱 150086）

肝細(xì)胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC，簡稱肝癌）是一種常見惡性腫瘤，因為肝癌細(xì)胞增殖能力強(qiáng)、侵襲轉(zhuǎn)移發(fā)生早，多數(shù)患者確診時已屬于晚期并發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，即使能夠手術(shù)者，其術(shù)后復(fù)發(fā)率也較高。所以，肝癌已成為僅次于肺癌的全球癌癥相關(guān)死亡第二大原因[1]。腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移是一個既涉及腫瘤細(xì)胞從原發(fā)灶向周邊擴(kuò)散，又涉及腫瘤細(xì)胞穿過血管內(nèi)皮和趨化性通過鄰近胞外基質(zhì)的多環(huán)節(jié)多步驟的復(fù)雜過程?；|(zhì)硬度是細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的重要物理屬性，大量基質(zhì)蛋白沉積和交聯(lián)可導(dǎo)致基質(zhì)硬度增加。越來越多的研究表明，胞外固態(tài)基質(zhì)不僅在腫瘤生長中起到結(jié)構(gòu)支撐作用，更可作為腫瘤微環(huán)境的重要組成成分，參與癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移過程的調(diào)控。因此，基質(zhì)硬度等物理信號的變化，對腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲轉(zhuǎn)移調(diào)控的研究逐漸受到重視。本文將分別從基質(zhì)硬度如何通過參與細(xì)胞遷移運動、血管生成與血管表型、上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、干細(xì)胞性及糖代謝等途徑影響肝癌細(xì)胞增殖及侵襲轉(zhuǎn)移進(jìn)行綜述。

1 基質(zhì)硬度與細(xì)胞遷移運動

細(xì)胞遷移是腫瘤細(xì)胞離開原發(fā)病灶向臨近組織侵襲的起始步驟，腫瘤細(xì)胞在轉(zhuǎn)移過程中有多種遷移方式，如間充質(zhì)樣遷移或阿米巴樣遷移，但無論哪種遷移方式都依賴于腫瘤細(xì)胞和ECM之間的特殊理化作用。不同硬度基質(zhì)上培養(yǎng)的細(xì)胞，形態(tài)特征和運動能力明顯不同。細(xì)胞外基質(zhì)硬度的改變可以破壞細(xì)胞間連接、影響水解酶的活性和黏附斑的形成，并改變整合素和細(xì)胞外基質(zhì)成分之間的相互作用。普遍的觀點認(rèn)為硬度高的基質(zhì)促進(jìn)細(xì)胞遷移，即細(xì)胞遷移有趨硬性，這在多種類型的細(xì)胞中如成纖維細(xì)胞、白細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等均有證實[2-3]。所以，細(xì)胞外基質(zhì)的硬度是影響細(xì)胞遷移的一個重要因素。

間充質(zhì)樣遷移需要激活整合素以利于黏附，并招募蛋白水解酶聚集，蛋白水解酶與ECM相互作用，促使基質(zhì)纖維降解和重組，從而降低基質(zhì)對細(xì)胞的阻力以利于細(xì)胞移動。阿米巴樣遷移是一種非蛋白酶依賴的遷移方式，通過收縮擠壓自身變形來促使細(xì)胞穿過胞外基質(zhì)間隙。譚喬燕等[4]發(fā)現(xiàn)硬基質(zhì)可通過促進(jìn)應(yīng)力纖維的發(fā)育、促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）的分泌和整合素的表達(dá)等來促進(jìn)細(xì)胞間充質(zhì)樣遷移。而軟基質(zhì)則可以通過增強(qiáng)細(xì)胞的柔韌性、形成環(huán)狀排列的骨架纖維、減少MMPs的分泌和整合素的表達(dá)來誘導(dǎo)細(xì)胞阿米巴樣的遷移。腫瘤細(xì)胞侵襲過程中，可以根據(jù)基質(zhì)硬度的不同而隨時變換遷移方式，以適應(yīng)周圍環(huán)境的變化，從而大大增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞的遷移能力。

侵襲性偽足的形成是維持腫瘤細(xì)胞高遷移和高侵襲能力的關(guān)鍵，也是促進(jìn)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移進(jìn)程的重要分子事件之一。有報道顯示，基質(zhì)硬度的改變可影響腫瘤細(xì)胞侵襲性偽足形成及活性。Chakraborty等[5]發(fā)現(xiàn)，與正常肝細(xì)胞相比，肝癌細(xì)胞可過表達(dá)和分泌蛋白多糖Agrin，促進(jìn)Arp2/3復(fù)合物依賴性侵襲性偽足形成。進(jìn)一步研究顯示，基質(zhì)硬度增加促進(jìn)Agrin表達(dá)，Agrin經(jīng)整合素Lrp4/MuSK受體通路激活轉(zhuǎn)錄因子YAP，從而增強(qiáng)肝癌惡性表型[6]。由此可見，基質(zhì)硬度可能通過影響Agrin-YAP途徑調(diào)控肝癌細(xì)胞侵襲性偽足形成。另外，侵襲性偽足中信號蛋白Cas和FAK的磷酸化活躍，過表達(dá)Cas或FAK可增加硬基質(zhì)表面生長的細(xì)胞侵襲性偽足的活性，說明基質(zhì)硬度也可通過Cas/FAK信號通路調(diào)控侵襲性偽足的活性，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞遷移。

2 基質(zhì)硬度與血管生成及血管表型

血管生成是指從已有的毛細(xì)血管或毛細(xì)血管后靜脈發(fā)育形成新血管的過程。血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是影響血管生成的關(guān)鍵因素之一。VEGF與血管內(nèi)皮細(xì)胞受體結(jié)合后，受體發(fā)生自身磷酸化，觸發(fā)酪氨酸激酶的系列信號級聯(lián)反應(yīng)，從而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移，并最終分化為成熟血管。一般說來，腫瘤血管比正常組織的血管更畸形、更曲折、更易滲漏。腫瘤血管異常被認(rèn)為是由于VEGF表達(dá)上調(diào)導(dǎo)致血管生長混亂和未能建立成熟的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)所致。Dong等[7]發(fā)現(xiàn)胞外基質(zhì)硬度增加通過激活整合素β1-PI3K-AKT信號途徑上調(diào)肝癌細(xì)胞VEGF表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)血管新生。ECM硬度也影響VEGF受體（VEGFR）的表達(dá)和血管發(fā)育。GATA2和VEGFR2 的表達(dá)隨著底物硬度的增加而增加，其中GATA2 調(diào)節(jié)VEGFR2的表達(dá)[8]。VEGFR2 經(jīng)過快速誘導(dǎo)和核移位，進(jìn)行無需配體參與的磷酸化，引發(fā)MAPK、PI3K和AKT信號通路的激活，促進(jìn)血管生成[9]。增加基質(zhì)硬度還可以增強(qiáng)細(xì)胞與腫瘤微環(huán)境中可溶性因子間的反應(yīng)，在某些情況下，基質(zhì)硬度增加可以改變可溶性因子觸發(fā)的信號通路[10]?；|(zhì)硬度和可溶性因子之間的相互作用可能促進(jìn)血管生成并誘導(dǎo)甚至惡化腫瘤樣血管表型。

在血管生物學(xué)中，內(nèi)皮細(xì)胞毛細(xì)血管樣網(wǎng)絡(luò)的形成受基質(zhì)硬度的影響[11]。在血管生成過程中，MMP活化對ECM降解和基底膜重塑起重要作用，上調(diào)MMPs的活性，特別是膜型1 MMP（MT1-MMP）能夠增加血管表型的改變和血管生成反應(yīng)[12]。已有研究證實MT1-MMP的激活依賴于細(xì)胞的收縮和基質(zhì)硬化[13]。另外，基質(zhì)硬度增加可促進(jìn)肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cells，HSCs）活化，活化后的HSCs也可產(chǎn)生大量的血管生成因子，如VEGF和血管生成素1（Angpt1）或Angpt2，激活內(nèi)皮細(xì)胞的受體并增強(qiáng)其功能，從而促進(jìn)腫瘤血管生長[10，14]。

3 基質(zhì)硬度與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是一種細(xì)胞分化過程，極化的上皮細(xì)胞歷經(jīng)變化之后，失去細(xì)胞極性和細(xì)胞間黏附，獲得遷移能力、侵襲性和對凋亡的抵抗力，從而呈現(xiàn)間充質(zhì)表型。持續(xù)惡化的EMT可能會導(dǎo)致各種病理情況的發(fā)生，如轉(zhuǎn)移和組織纖維化。

EMT常發(fā)生于腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的起始過程中，可溶性因子、ECM成分和缺氧可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞從上皮狀態(tài)向間質(zhì)狀態(tài)轉(zhuǎn)化[15]。除此之外，基質(zhì)硬化與可溶性因子協(xié)同作用也可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，進(jìn)而推動轉(zhuǎn)移的進(jìn)展。已有研究表明[10]，轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factors-β，TGF-β）誘導(dǎo)的EMT依賴于基質(zhì)的機(jī)械特性，TGF-β可以在硬度較高的基質(zhì)表面誘導(dǎo)EMT，但在硬度較低的基質(zhì)表面則會誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。TGF-β1，被認(rèn)為是上皮細(xì)胞（包括肝細(xì)胞）中主要的EMT啟動子。胞外基質(zhì)硬度增加可通過激活Smad2/3獨立誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞EMT發(fā)生，TGF-β1刺激使癌細(xì)胞EMT更為完全[7]。

NADPH氧化酶（NOX）是一種位于細(xì)胞膜上的酶，能產(chǎn)生與EMT相關(guān)的活性氧（reactive oxygen species，ROS）[16]。研究顯示，較高的基質(zhì)硬度加強(qiáng)了偽足蛋白S100A11與NOX亞基p67phox和p47phox的相互作用，并促進(jìn)了NOX的聚集。S100A11上調(diào)促進(jìn)了ROS的產(chǎn)生和Snail的表達(dá)，這有助于EMT在HCC細(xì)胞中發(fā)生[17]。另一個偽足蛋白eIF4E也參與肝細(xì)胞癌基質(zhì)硬度誘導(dǎo)的EMT，eIF4E在多種人類惡性腫瘤中高表達(dá)，并與癌癥的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)[18]。在較高硬度的基質(zhì)刺激下，HCC細(xì)胞中Raf1和eIF4E的磷酸化水平以及Snail的表達(dá)顯著增加。Raf1-elF4E通路調(diào)節(jié)Snail和MMP-3的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控EMT發(fā)生[19]。另外，miRNAs的抑制或增強(qiáng)總是發(fā)生在EMT增加的腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移中[20]。較高的基質(zhì)硬度通過減少miRNA24-3p的表達(dá)，促進(jìn)了TGF-β1的自分泌，并與Snail的高表達(dá)和肝癌細(xì)胞內(nèi)EMT的發(fā)生有關(guān)[17]。

4 基質(zhì)硬度與干細(xì)胞特性

癌細(xì)胞的干細(xì)胞特性主要表現(xiàn)為干性標(biāo)志物表達(dá)、干性相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)、化療耐藥及自我更新能力增強(qiáng)等，與癌細(xì)胞侵襲性增加和腫瘤患者臨床預(yù)后不良有關(guān)。Schrader等[21]將Huh7 和HepG2細(xì)胞株培養(yǎng)在基質(zhì)硬度為1 KPa和12 KPa的培養(yǎng)基上發(fā)現(xiàn)，與低硬度基質(zhì)相比，生長于高硬度基質(zhì)表面的肝癌細(xì)胞干性標(biāo)志物的表達(dá)明顯減少，但其對順鉑更耐受，說明高硬度基質(zhì)可減弱肝癌細(xì)胞的干細(xì)胞性并增加其耐藥性。而另外一項研究得出的結(jié)論有所不同，You等[22]將HuH7和Hep3B細(xì)胞株分別培養(yǎng)在底物硬度為6 KPa、10 KPa、16 KPa的培養(yǎng)基上，結(jié)果表明，不但肝癌細(xì)胞對奧沙利鉑的耐藥性隨著基質(zhì)硬度的增加而增加，并且CD133（+）/EpCAM（+）細(xì)胞比例、干性相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)、自我更新能力也隨著基質(zhì)硬度的增加而增加。因此其認(rèn)為，較高的基質(zhì)硬度可誘導(dǎo)和增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的化療耐藥性和干性特征。但Tian等[23]將MHCC97H細(xì)胞株分別培養(yǎng)在5.9 KPa、24.8 KPa及48.1 KPa的培養(yǎng)基上發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞在軟基質(zhì)上呈現(xiàn)小而圓表型、干性標(biāo)志物表達(dá)增加、細(xì)胞成球能力增強(qiáng)，表明生長在軟基質(zhì)上的肝癌細(xì)胞增強(qiáng)了干細(xì)胞特性。另外，生長在軟基質(zhì)上的肝癌細(xì)胞表現(xiàn)出對5-氟尿嘧啶更強(qiáng)的耐受性。顯然，這一結(jié)果與以上的兩個報道又不完全相同。由于目前基質(zhì)硬度對肝癌干細(xì)胞性的研究報道較少，尚無法確認(rèn)產(chǎn)生差異的具體原因，但我們分析認(rèn)為出現(xiàn)上述差異的因素可能有以下幾個方面：一是實驗所選細(xì)胞株不同，可能每種細(xì)胞株對基質(zhì)硬度的響應(yīng)能力具有差異性。二是所選化療藥物不同，不同細(xì)胞可能對不同化療藥物的敏感性不同。總而言之，雖然現(xiàn)有的研究顯示基質(zhì)硬度對腫瘤干細(xì)胞特性誘導(dǎo)結(jié)果不完全一致，但是依然反映了基質(zhì)硬度對腫瘤干細(xì)胞性具有一定的影響，其具體的作用和機(jī)制值得進(jìn)一步深入研究。

5 基質(zhì)硬度與糖代謝

癌細(xì)胞的生長速度異常增快，這需要更高的ATP水平來支持碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸的生物合成。Tilghman等[24]研究發(fā)現(xiàn)，生長在較硬基質(zhì)上的細(xì)胞表現(xiàn)出較短的細(xì)胞周期，細(xì)胞代謝活性增強(qiáng)，細(xì)胞內(nèi)ATP水平升高，而腫瘤細(xì)胞ATP供應(yīng)率和細(xì)胞增殖率成正比，這一現(xiàn)象提示ECM硬度不僅能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，還可能調(diào)控其代謝活性。劉秋萍等[25]研究也發(fā)現(xiàn)，隨著基質(zhì)硬度增加，HepG2細(xì)胞增殖能力、葡萄糖攝取和Glut1（HepG2葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白1）表達(dá)都顯著增加。由此可見，肝癌細(xì)胞所處力學(xué)微環(huán)境對其增殖有重要影響，較高的基質(zhì)硬度可能通過調(diào)控糖代謝途徑促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖。

腫瘤ECM硬化和腫瘤細(xì)胞代謝重組是腫瘤進(jìn)展的兩個基本過程[26]。有證據(jù)表明，代謝方式變化發(fā)生在機(jī)械信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活之后[27-28]。有氧糖酵解是包括肝癌細(xì)胞在內(nèi)的大多數(shù)癌細(xì)胞的代謝標(biāo)志，其特征是過度消耗葡萄糖和大量產(chǎn)生乳酸。在硬度較高的基質(zhì)上培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞葡萄糖消耗和乳酸產(chǎn)生都增加。因為癌細(xì)胞一般通過優(yōu)先表達(dá)葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白（例如Glut1）[29]和關(guān)鍵的糖酵解酶（例如HK II和LDHA）[30-31]來加速有氧糖酵解，如在硬度較高基質(zhì)上培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞系中觀察到Glut1，HK II和LADH顯著上調(diào)。一直以來，癌基因和抑癌基因的突變被認(rèn)為可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)多個信號通路的改變，這些信號通路影響腫瘤細(xì)胞的新陳代謝，并促進(jìn)腫瘤生存和生長。并且，許多致瘤信號通路可因基質(zhì)硬度增加而激活[32]。例如，PI3K/AKT是調(diào)控腫瘤的有氧糖酵解的重要途徑，并影響細(xì)胞增殖。而ECM的硬度增加會激活PI3K途徑[33]。除了激活mTOR介導(dǎo)的信號外，PI3K通路還調(diào)節(jié)葡萄糖的吸收和利用。在不依賴胰島素的組織中，PI3K信號可通過AKT調(diào)節(jié)葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白Glut1和Glut4的表達(dá)，從而刺激磷酸果糖激酶活化并增加葡萄糖攝取[34]，這對增強(qiáng)有氧糖酵解至關(guān)重要。因此，PI3K調(diào)節(jié)PIP3以及隨后激活A(yù)KT和mTOR，代表了基質(zhì)硬度和ECM沉積的增加影響細(xì)胞新陳代謝。Liu等[35]發(fā)現(xiàn)，基質(zhì)硬度作為MAPK信號軸的上游，激活MAPK的磷酸化，進(jìn)而觸發(fā)YAP的活化，從而調(diào)節(jié)糖酵解。Hu等[36]研究發(fā)現(xiàn)，基質(zhì)硬度也可能通過影響p53基因來調(diào)節(jié)新陳代謝，因為AKT通過MDM2驅(qū)動p53基因的降解。

6 小結(jié)與展望

隨著不同基質(zhì)硬度體外平臺的建立，生物力學(xué)得到了明顯的發(fā)展，基質(zhì)硬度對肝癌的影響越來越受到重視。但是，有些研究的結(jié)果出現(xiàn)明顯差異，甚至是相互矛盾。因此，需要建立并完善更加符合生理環(huán)境的三維培養(yǎng)平臺，制定更加優(yōu)化和標(biāo)準(zhǔn)化的實驗方法來研究基質(zhì)硬度對肝癌細(xì)胞增殖及侵襲和轉(zhuǎn)移的影響。隨著研究的進(jìn)一步深入，未來基質(zhì)硬度可能有望成為判斷肝癌預(yù)后的指標(biāo)甚至成為有效的治療靶點。