胥秀英，趙 莎，李 游，劉華瓊

(重慶理工大學(xué) 藥學(xué)與生物工程學(xué)院，重慶 400054)

人參皂苷(ginsenoside)又名三萜皂苷，存在于人參屬植物中，是人參(panaxginsengC A Mey)的生物活性成分[1-2]，也是評價人參質(zhì)量的重要指標(biāo)。人參皂苷可分為極性皂苷和非極性皂苷[3]。研究表明：2種類型的人參皂苷均具有優(yōu)良的藥理作用，具有抗炎[4-6]、抗癌[7-8]、抗氧化[9-10]、保護(hù)神經(jīng)[11-13]、保護(hù)肝臟性能[14]、抗糖尿病活性[15-16]等功能。人參皂苷結(jié)構(gòu)復(fù)雜、功能強大，對于人參皂苷的分析檢測一直以來都是研究的熱點，本文對近幾年人參皂苷檢測的現(xiàn)代儀器及分析方法進(jìn)行了綜述。

1 色譜法及聯(lián)用技術(shù)在人參皂苷檢測中的應(yīng)用

分離檢測方法主要有色譜法、電泳法、色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析方法，每個分析方法的優(yōu)缺點各異，檢測者在應(yīng)用時可根據(jù)實際需求進(jìn)行選擇。色譜法具有分離效率高、分析速度快，可對幾種甚至幾十種人參皂苷同時進(jìn)行分離并準(zhǔn)確測定其含量等優(yōu)點，但定性能力較差，更適用于定量分析；電泳法在中藥檢測中側(cè)重于對有效成分的分離和定量測定；色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析法兼顧了色譜和質(zhì)譜兩者優(yōu)點，在分離檢測、定量分析、定性分析中均表現(xiàn)出更高優(yōu)勢，低檢出限、高選擇性、高靈敏度等。

1.1 色譜法在人參皂苷檢測中的應(yīng)用

色譜法是一種分離分析法，可以對不同性質(zhì)的有機化合物進(jìn)行定性、定量分析。在人參皂苷的檢測中主要使用的色譜法有薄層色譜法、高效液相色譜法、超臨界流體色譜法、親水相互作用色譜法和逆流色譜法。

1)薄層色譜法(TLC)：薄層色譜法是一種微量分離法，在中藥測定中主要用于定性鑒別，具有設(shè)備簡單、操作方便等優(yōu)勢，并能對無紫外吸收和不具有揮發(fā)性的成分進(jìn)行定性測定；但TLC所使用的展開劑毒性較大，實驗的重復(fù)性和穩(wěn)定性差，且檢測時間與高效液相色譜法(HPLC)所用時間相比較長，分析結(jié)果也沒有HPLC明顯[17]。鄭曉嬌[18]采用薄層色譜法對人參皂苷中三醇類皂苷成分進(jìn)行分離，結(jié)果表明人參總皂苷中大部分人參皂苷為Re、Rg1。張俏等[19]在復(fù)視明膠囊中對人參皂苷的Rb1和Re進(jìn)行定性鑒別，經(jīng)觀察陰性樣品在色譜對應(yīng)位置上無干擾，斑點明顯。崔業(yè)波等[20]用人參皂苷Re、Rg1、Rb1、Rf等作為對照品，用薄層色譜法對人參須藥材進(jìn)行定性鑒別。

2)高效液相色譜法(HPLC)：高效液相色譜法(HPLC)是近幾十年來分離和分析人參皂苷的主要方法，主要是對人參皂苷進(jìn)行定量分析。近幾年的研究表明，分析測定人參皂苷更加注重同時高效測定多種人參皂苷的研究，可以更加快速、高效、準(zhǔn)確測定且成本較低。楊艷文等[21]利用高效液相色譜法對存在于人參制劑中的20種人參皂苷(包括稀有皂苷)進(jìn)行含量測定。該實驗采用紫外檢測器、梯度洗脫程序，使20種人參皂苷完全分離并同時高效準(zhǔn)確測定其含量，該方法具有良好的線性關(guān)系且重復(fù)性好。彭修娟等[22]對高效液相色譜的流動相參數(shù)進(jìn)行優(yōu)選，建立專屬性強的HPLC法測定黃七膠囊中人參皂苷Rg1、Rb1及三七皂苷R1含量，所測樣品含量皆符合規(guī)定，平均測得含量為11.0 mg/粒。商曉慧等[23]采用高效液相色譜法對人參藥材中的6種人參皂苷同時進(jìn)行含量測定。Zhang等[24]利用高效液相色譜同時對人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rh1、Rg2進(jìn)行分離測定。王晶等[25]用3種不同的方法提取人參、西洋參和三七中的有效成分，并對不同提取物中的8種主要人參皂苷用反相高效液相色譜(RP-HPLC)進(jìn)行定量分析，分別得出3種藥材中的皂苷含量。

3)超高效液相色譜法(UPLC)：超高效液相色譜法(UPLC)與高效液相色譜法(HPLC)相比，具有分離能力更高效、靈敏度高、分離速度快且溶劑消耗更少等優(yōu)點[26]。蔡艷等[27]用超高效液相色譜法測定人參總皂苷提取物中人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rb2、Rc、Rd的含量，檢測結(jié)果在各自規(guī)定范圍內(nèi)均有良好的線性關(guān)系，且RSD值均符合要求。在分離鑒別中藥成分時，也可采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)進(jìn)行相似性分析。馮偉紅等[28]建立紅參的UPLC指紋圖譜，不僅可用于紅參與人參的鑒別，還用于紅參制備工藝的控制，該方法簡便、省時，對紅參中人參皂苷的分離具有特異性。王敏等[29]用超高效液相色譜法同時對人參花和人參葉中的6種人參皂苷含量進(jìn)行測定，該方法可應(yīng)用于人參花和人參葉樣品的質(zhì)量控制。楊林等[30]采用UPLC同時對參麥注射液中11個人參皂苷含量進(jìn)行測定，與HPLC相比，該方法更加高效、快速，可在45 min內(nèi)完成測定。

4)二維液相色譜法(2D-LC)：二維液相色譜(2D-LC)是由2支獨立且分離機理不同的色譜柱串聯(lián)構(gòu)成的分離系統(tǒng)，可用于復(fù)雜基質(zhì)的中藥復(fù)方制劑和中藥材的分析[31]。張艷海等[32]利用在線二維多中心切割液相色譜法在50 min內(nèi)同時測完人參、三七及其相關(guān)產(chǎn)品中8種人參皂苷的含量。

5)超臨界流體色譜(SFC)：超臨界流體色譜(SFC)是一種流動相為超臨界流體并具有正相分離性能的色譜方法，兼具液相色譜和氣相色譜的某些特征，具有分離性能高、分析時間短、有機溶劑消耗低、綠色環(huán)保等優(yōu)點[33-35]。肖夢琦等[36]用超臨界流體色譜法在12 min內(nèi)同時測量人參與三七中人參皂苷Rg1、Re、Rb1、三七皂苷R1的含量；2015年版中國藥典用HPLC分析測定人參與三七的4種皂苷至少需要70 min，且有較多廢液產(chǎn)生，相比之下，SFC不僅環(huán)保且快速，還可用作人參、三七的快速測定方法。

6)親水相互作用色譜(HILIC)：親水相互作用色譜(HILIC)，流動相為水-水溶性有機相，能夠?qū)悠啡芙舛仍诹鲃酉嗬锔纳芠37]。基于反相大孔吸附樹脂與HILIC的正交分離方法，可用于人參皂苷大規(guī)模的分離純化[38]。親水相互作用色譜法可選擇性分離同分異構(gòu)體皂苷。Guo等[39]以Click-XIon兩性離子固定相的親水相互作用色譜，在15～30 min完成對人參皂苷Rc(S1)、人參皂苷Rb2(S2)和人參皂苷Rb3(S3)3種同分異構(gòu)體皂苷的分離工作。Qu等[40]使用氨基柱和親水相互作用色譜快速高效地分離14種人參皂苷。

7)逆流色譜法(CCC)：逆流色譜法(CCC)是一種液-液色譜技術(shù)，在分離過程中不會造成樣品的變性、失活及沾染等問題[41]。Shehzad等[42]通過逆流色譜法從韓國白參中分離出8種人參皂苷，從紅參中分離出13種人參皂苷。

不同的色譜方法表現(xiàn)出不同的差異。在對無紫外吸收和不具有揮發(fā)性的成分進(jìn)行定性測定時，可用TLC測定，但該法又存在分離時間較長、展開劑毒性大且重復(fù)性低等缺點，則可考慮選用其他色譜法進(jìn)行分析。如HPLC、UPLC，具有分離速度快、靈敏度高、重復(fù)性好等優(yōu)勢，還可選用有機溶劑消耗低，具有綠色環(huán)保等優(yōu)點的SFC。

1.2 毛細(xì)管電泳技術(shù)在人參皂苷檢測中的應(yīng)用

毛細(xì)管電泳色譜(CE)是一種同時含有電泳與色譜功能的技術(shù)，在中藥領(lǐng)域主要用于對有效成分的分離和含量測定[43]。王淑美等[44]用膠束電動毛細(xì)管色譜法對人參中的人參皂苷Rg1、Re進(jìn)行分離分析。李佳等[45]用膠束電動毛細(xì)管色譜法在214 nm波長處對西洋參中所含的人參皂苷Rg1、Re及Rb1進(jìn)行同時分離測定，其測定結(jié)果與HPLC檢測結(jié)果進(jìn)行對比，情況相符。余麗雙等[46]采用混合膠束毛細(xì)管電動色譜法對片仔癀中的多種有效成分進(jìn)行同時測定，研究結(jié)果顯示人參皂苷Rg1、Rb1及牛磺膽酸鈉等5種有效成分的含量均符合標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析方法在人參皂苷檢測中的應(yīng)用

質(zhì)譜作為一種檢測系統(tǒng)，色譜作為一種分離系統(tǒng)，兩者聯(lián)用結(jié)合了色譜分離和定量分析及質(zhì)譜定性分析的優(yōu)點，具有檢出限低、選擇性高、靈敏度高及可提供相對分子質(zhì)量等優(yōu)勢。近幾年研究表明，目前使用色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方式主要有液相質(zhì)譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC-MS)、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC-MS)及其他聯(lián)用技術(shù)。對藥材中不同組織分離代謝產(chǎn)物進(jìn)行鑒定和表征時可選用GC-MS，對人參提取物質(zhì)量評價時則需選擇SFC-MS。

1)液相質(zhì)譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC-MS)：LC-MS和串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)技術(shù)因檢測動態(tài)范圍大、靈敏度高、特異性強，被廣泛應(yīng)用于人參皂苷的分析[47-51]。石婧婧等[52]采用超快速液相色譜-三重四極桿/線性離子阱質(zhì)譜(UFLC-QTRAP-MS/MS)，對處于不同貯藏條件下的紅參中人參皂苷Rc、Rb2、Rb1、Rd、Re、Rg1等17種皂苷類成分同時進(jìn)行含量測定，研究結(jié)果表明紅參適宜貯藏在-20 ℃的環(huán)境中，且須用紙箱包裝避光貯藏。Yang等[47]采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(UPLC-MS/MS)對參附湯和獨腎湯中12種人參皂苷同時進(jìn)行含量測定，結(jié)果顯示參附湯中除Rg1和Rb1外，其余人參皂苷含量均高于對照組，該法獲得了良好的線性關(guān)系(r>0.991 5)、重復(fù)性(RSD<9.58%)和精密度等。李娜等[53]采用液相色譜/離子阱質(zhì)譜聯(lián)用儀(LC-MS/MS)對人參莖葉提取液人參皂苷Rg1、Re的降解產(chǎn)物展開分析，研究結(jié)果表明該提取液人參皂苷Rg1、Re在本實驗所處pH環(huán)境中加熱，會發(fā)生環(huán)合、脫糖、脫羥基等反應(yīng)，可生成多種降解產(chǎn)物。Razgonova等[54]采用超臨界CO2萃取法從朝鮮開城和俄羅斯濱海地區(qū)種植的人參中提取人參根、人參，利用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)對提取物進(jìn)行鑒定，研究結(jié)果表明，2種人參皂苷的光譜與其他小類群有較大的差異；與以前類似的研究相比，使用40 MPa或更高的壓力可提高人參皂苷的產(chǎn)量。

2)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC-MS)

GC-MS可了解人參中人參皂苷積累期間發(fā)生的動態(tài)代謝變化的信息。Liu等[55]利用GC-MS對不同生長階段的人參中的不同組織分離代謝產(chǎn)物進(jìn)行鑒定和表征，結(jié)果表明鑒定出的30、16、20、36和31種代謝產(chǎn)物，分別參與葉、莖、葉柄、側(cè)根和主根的不同發(fā)育階段；此外，組織在氨基酸代謝、糖代謝和能量代謝方面表現(xiàn)出顯著的差異；該實驗將有助于進(jìn)一步剖析人參不同發(fā)育階段或不同組織中人參皂苷積累的代謝通量調(diào)控。

3)其他聯(lián)用技術(shù)：迄今為止，很少有分析方法能同時分析人參提取物中核堿基、核苷和人參皂苷這三類極性不同的化合物。Huang等[56]采用超臨界流體色譜-單四極桿質(zhì)譜(SFC-MS)，成功建立了一種簡單有效且能同時分離人參提取物中17種核苷、核苷和人參皂苷的分析方法；通過對14批不同產(chǎn)地的人參提取物進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)該方法可用于對人參提取物的質(zhì)量評價。此外，聯(lián)用技術(shù)在中藥注射劑和其他分析科學(xué)領(lǐng)域的樣品中也有很大的應(yīng)用潛力。Li等[57]采用深共晶溶劑雙水相萃取-HPLC-UV/二極管陣列檢測器測定康艾注射液中8種常見人參皂苷的高效提取和含量測定，其實驗結(jié)果顯示分析物的回收率為92.7%～110.8%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.2%～3.9%；該方法簡便、快速、有效，可用于注射液中常見人參皂苷的含量測定。

2 在人參皂苷檢測中的其他技術(shù)

常用的檢測方法還有光譜法、免疫分析法、比色法。比色法僅能用于定量分析，而光譜法與免疫分析法不但可以進(jìn)行定性、定量分析，還有各自的優(yōu)勢。當(dāng)需要對未知化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定、檢測小分子藥物之間的相互作用時，可采用光譜法；涉及抗原與抗體時應(yīng)用免疫分析法。

2.1 光譜法在人參皂苷檢測中的應(yīng)用

光譜法可對人參皂苷進(jìn)行定性、定量測定，對皂苷類化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，對人參皂苷與蛋白質(zhì)之間的相互作用進(jìn)行研究。常用的分析方法有近紅外光譜法、紫外-可見吸收光譜法、核磁共振譜法及熒光光譜法。

1)近紅外光譜法(NIRS)：近紅外光譜法分析速度快、高效、準(zhǔn)確、成本低，具有對樣品無破壞、綠色環(huán)保等優(yōu)點，在中藥領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用于有效成分的測定。閆珂巍等[58]采用近紅外光譜法對72批三七藥材里的三七皂苷R1和人參皂苷Rg1、Rb1建立定量分析模型進(jìn)行測定，3種皂苷總量不少于5.0%，研究表明，對三七藥材進(jìn)行質(zhì)量檢查時可采用該法。朱捷強等[59]同樣采用近紅外光譜測定法對三七藥材里5種皂苷含量進(jìn)行測定。NIRS不需對樣品進(jìn)行前處理，與HPLC相比更加快速，可以對中藥提取液進(jìn)行實時檢測。呂尚等[60]采用近紅外光譜對西洋參提取液中人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd含量進(jìn)行快速檢測，經(jīng)研究表明，建立的定量校正模型相關(guān)系數(shù)r及內(nèi)部交叉驗證均方差RMSECV，均獲得了較好的預(yù)測精度。

2)紫外-可見吸收光譜法(UV-vis)：紫外-可見分光光度法又稱紫外-可見吸收光譜法，根據(jù)物質(zhì)對紫外和可見光區(qū)不同波長光的吸收程度進(jìn)行定量、定性分析。田健等[61]以人參皂苷Re為對照品采用紫外-可見分光光度法對人參中總皂苷的含量進(jìn)行測定，研究表明：在540 nm吸收波長處，人參皂苷Re在規(guī)定范圍內(nèi)線性關(guān)系較好，且精密度、平均回收率及重復(fù)性均達(dá)標(biāo)。蒲翔等[62]用人參皂苷Re作為對照品，在560 nm吸收波長處測定丹眠顆粒的吸光度，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算丹眠顆粒中總皂苷的含量，經(jīng)研究顯示其平均含量為6.68 mg。

3)核磁共振譜法(NMR)：核磁共振譜法可對未知的皂苷類化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。楊佳美等[63]從人參皂苷酶轉(zhuǎn)化產(chǎn)物里分離純化得到人參皂苷20(R)-25-OH-Rg3，則是采用核磁共振譜法對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定并命名。孟軍等[64]采用MS和核磁共振譜法對人參葉里分離得到的5個未知微量化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，得知其分別為人參皂苷Rg6、Rk1、Rk3、Rh4和Rh5。

4)熒光光譜法：熒光光譜法比UV-vis靈敏度高，檢測的信息量較大，可以檢測一些UV-vis檢測不到的時間過程。通常小分子對蛋白質(zhì)熒光的猝滅分為靜態(tài)和動態(tài)2種方式[65]。鞠東等[65]采用熒光光譜法得知人參皂苷Rb1與Aβ(1～42)之間為靜態(tài)相互作用。楊潔等[66]采用熒光光譜法對24(R)-擬人參皂苷元DQ與牛血清白蛋白(BSA)的相互作用進(jìn)行研究，研究結(jié)果顯示兩者之間為靜態(tài)猝滅方式，主要作用力為范德華力與氫鍵。

不同的光譜法存在不同的優(yōu)勢。檢測樣品有紫外吸收時，可采用UV-vis，而熒光光譜法可以檢測UV-vis無法檢測的時間過程；NIRS可以對中藥提取液進(jìn)行實時檢測，可得到較好的預(yù)測精度，具有綠色環(huán)保等優(yōu)勢。

2.2 免疫分析法在人參皂苷檢測中的應(yīng)用

免疫分析法(IA)是一種基于抗原與抗體特異性結(jié)合的定性、定量分析技術(shù)[67]。酶聯(lián)免疫吸附分析法(ELISA)與HPLC相比具有更加高效、準(zhǔn)確、樣品前處理簡單等特點，免疫親和層析柱的制備可敲除復(fù)方或中藥提取液中的物質(zhì)[68-70]。賽佳洋[68]采用ELISA對制備的人參皂苷Re單克隆抗體進(jìn)行方法學(xué)考察，研究結(jié)果顯示ELISA的測定結(jié)果均符合標(biāo)準(zhǔn)，可用于分析人參皂苷Re含量。王艷[69]采用ELISA檢測法對抗人參皂苷Rg2、Rh1單克隆抗體進(jìn)行測定。單文超[70]對人參皂苷Rh1、Re單克隆抗體采用免疫親和色譜一步法分別對S型與R型人參皂苷Rg2、Rh1進(jìn)行分離。

2.3 比色法在人參皂苷檢測中的應(yīng)用

比色法作為一種定量分析的方法，在人參皂苷含量測定中常用的是香草醛-冰醋酸-高氯酸比色法[71]。杜金鳳等[72]以香草醛-硫酸溶液作為顯色劑，采用比色法對人參保健飲料中所含人參總皂苷的含量進(jìn)行測定。韋貴云等[73]以5%香草醛-冰醋酸-高氯酸為顯色體系，用比色法對巴西人參中齊墩果酸型皂苷的含量進(jìn)行測定，研究結(jié)果顯示皂苷比色法和苷元比色法均可用于此次含量測定，但皂苷比色法更合理、準(zhǔn)確。

3 結(jié)論

人參皂苷的檢測方法較多，根據(jù)檢測目的、分析成本及適用范圍的不同，采用的檢測方法也不同。在選用檢測方式時，需充分考慮檢測樣本所含人參皂苷的性質(zhì)、結(jié)構(gòu)等因素?，F(xiàn)有文獻(xiàn)主要采用色譜法與質(zhì)譜法，檢測到人參皂苷有30余種。為進(jìn)一步提升對人參的檢測，后續(xù)研究可采用更為高效環(huán)保的分析手段，如SFC、LC-MS、UPLC等，以提升人參相關(guān)制劑的質(zhì)量。