劉 梅，原居林，倪 蒙，練青平，郭愛環(huán)，顧志敏

(浙江省淡水水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水漁業(yè)健康養(yǎng)殖重點實驗室，浙江省淡水水產(chǎn)遺傳育種重點實驗室，浙江 湖州 313001)

在凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)養(yǎng)殖過程中，作為養(yǎng)殖水體的初級生產(chǎn)者，有益藻相的穩(wěn)定不僅與水質(zhì)的好壞息息相關(guān)，還能有效提高養(yǎng)殖對蝦的免疫抗病能力，作為生物餌料，其對于維持養(yǎng)殖的健康持續(xù)發(fā)展至關(guān)重要[1-3]。劉梅等[4]發(fā)現(xiàn)，蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)和隱藻(Cryptomonasobovata)對凡納濱對蝦養(yǎng)殖尾水中的亞硝態(tài)氮具有較好的去除效果，且隱藻去除效果較持久；銅綠微囊藻(Microcystisaeruginosa)和衣藻(Chlamydomonassp.)具有較好的硝態(tài)氮去除效果；衣藻對氨氮具有較快且持久的去除率，去除率可達100%。劉盼等[5]發(fā)現(xiàn)，蛋白核小球藻在高質(zhì)量濃度的硝態(tài)氮和氨氮中擴繁速度更快，而斜生柵藻(Scenedesmusobliquus)在低質(zhì)量濃度的硝態(tài)氮和氨氮中更易繁殖。因此，近些年，通過接種有益藻種，培養(yǎng)優(yōu)勢種是目前對蝦養(yǎng)殖過程中常用的水環(huán)境調(diào)控措施之一[6-7]。

生產(chǎn)中養(yǎng)殖水體常處于富營養(yǎng)化狀態(tài)，接種有益藻種，其成為優(yōu)勢種后，極易過度繁殖，影響水體透明度，易發(fā)生“倒藻”，水環(huán)境穩(wěn)定性差，引起蝦類應激反應等[8-9]。因此，如何有效地控制對蝦高密度養(yǎng)殖過程中的良好水質(zhì)，并保持有益藻相穩(wěn)定，是目前對蝦養(yǎng)殖面臨的主要挑戰(zhàn)之一。在池塘生態(tài)系統(tǒng)中，浮游植物的生長不僅受到光照、水溫、營養(yǎng)鹽等環(huán)境因子的影響，而且宜受到生物因素的控制[10-11]。因此，通過生物操縱即利用浮游動物牧食浮游植物來控制其密度，而養(yǎng)殖對象進一步攝食浮游動物，從而維持藻相長久穩(wěn)定具有一定可行性，相關(guān)研究已有報道[12-14]。大型溞(Daphniamagna)是養(yǎng)殖池塘最常見的大型浮游動物之一，其生長繁殖力強，優(yōu)勢種時間長，對浮游植物具有較高的牧食壓力，可以改善水質(zhì),被認為是進行生物操縱的關(guān)鍵種[15-16]。但迄今為止，仍缺乏關(guān)于藻—溞組合系統(tǒng)對凡納濱對蝦養(yǎng)殖水體凈化效果及相互生長影響的系統(tǒng)研究。

鑒于此，筆者選取前期篩選的蛋白核小球藻、衣藻和隱藻作為試驗微藻，選取大型溞作為浮游動物，設(shè)計和研究不同藻—溞微生態(tài)系統(tǒng)對凡納濱對蝦養(yǎng)殖水體的凈化作用及這些藻類和大型溞的生長特征，以期建立一套穩(wěn)定凡納濱對蝦養(yǎng)殖池塘中有益藻相的調(diào)控技術(shù)，為凡納濱對蝦的健康養(yǎng)殖提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗藻種：3株藻種分別為綠藻門中的蛋白核小球藻(FACHB-5)、衣藻(FACHB-715)和隱藻門中的隱藻(FACHB-1301)，均購于中國科學院水生生物研究所藻種庫(武漢)。試驗前，將保存的藻種轉(zhuǎn)移到250 mL三角燒瓶(內(nèi)有100 mL液體培養(yǎng)基)中，進行擴大和馴化培養(yǎng)：用藍綠(BG-11)培養(yǎng)液培養(yǎng)蛋白核小球藻，亞硒酸(SE)培養(yǎng)液培養(yǎng)衣藻，AF-6培養(yǎng)液培養(yǎng)隱藻。每3 d轉(zhuǎn)接1次，共轉(zhuǎn)接2～3次，當達到同步生長時，即可作為試驗藻種液，鏡檢初始密度約1.0×108個/mL。

試驗大型溞：取自凡納濱對蝦養(yǎng)殖塘，實驗室內(nèi)進行純化培養(yǎng)，試驗前在20 ℃、光照度3000 lx和光暗比14L∶10D下馴化。試驗中使用同一母體繁殖3代以上2 d左右的成熟大型溞。

試驗水樣：取自寧波慈溪灘涂養(yǎng)殖場，為養(yǎng)殖第92天時的養(yǎng)殖水體，鹽度為5，經(jīng)高壓滅菌后用于本試驗，其水質(zhì)指標見表1。

1.2 試驗設(shè)計

試驗組共設(shè)10組，分別為蛋白核小球藻組(C1)、蛋白核小球藻+大型溞組(C2)、衣藻組(C3)、衣藻+大型溞組(C4)、隱藻組(C5)、隱藻+大型溞組(C6)、蛋白核小球藻+衣藻組(C7)、蛋白核小球藻+衣藻+大型溞組(C8)、衣藻+隱藻組(C9)、衣藻+隱藻+大型溞組(C10)，每個處理組設(shè)3個平行。取5000 mL滅菌后的對蝦養(yǎng)殖尾水于5000 mL的經(jīng)過高壓滅菌的燒杯中，燒杯瓶口覆蓋保鮮膜以防止水分流失，同時保鮮膜中間開一約1 cm的小口，以保持水面與大氣相通。為了達到一致的每種藻類初始密度5×105個/mL，分別接種初始密度為1×108個/mL各藻種原始藻液25 mL于養(yǎng)殖尾水中，大型溞投放密度為1個/L，即含有大型溞的處理組投放5個。

1.3 培養(yǎng)條件及水質(zhì)測定

燒杯置于溫度25 ℃、光照度3000 lx和光暗比14L∶10D的光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。培養(yǎng)期間，光照條件下每隔3 h人工搖動一次。每間隔3 d的10:00測定溶液的pH、溶解氧，所有樣品測定完畢，取50 mL水樣檢測總氮、氨氮、硝態(tài)氮、亞硝態(tài)氮、總磷、葉綠素a等水質(zhì)指標。pH和溶解氧水平采用哈希HQ40D便攜式溶解氧/pH測定儀測定；硝態(tài)氮含量采用酚二磺酸分光光度法測定，氨氮含量測定采用納氏試劑分光光度法測定，亞硝態(tài)氮含量采用N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法測定，所用紫外分光光度計為UV-2802型。

氮、磷的去除率(R,%)按下式計算：

R=(ρ0-ρt)/ρ0×100%

式中，ρ0和ρt分別為初始氮磷質(zhì)量濃度(mg/L)和培養(yǎng)td后的質(zhì)量濃度(mg/L)。

1.4 微藻和大型溞生長監(jiān)測

藻密度通過取一定量的藻種在顯微鏡下用血球計數(shù)板計數(shù)，并按一定的稀釋倍數(shù)逐級進行稀釋，得到相應藻細胞密度，再將所得到的系列藻液用UV-2802分光光度計測定680 nm波長下藻類光密度值，得到藻密度—光密度值標準曲線。結(jié)果表明，藻細胞密度與藻光密度值具有很好的線性關(guān)系，r2均達到0.91以上，可較為準確測定藻密度，測定藻密度后并計算相對生長率(K)。大型溞采用肉眼計數(shù)法測定。

K=(lnNt-lnN0)/t×100%

式中，N0為培養(yǎng)初始藻細胞密度(個/mL)，Nt為經(jīng)過t時間后培養(yǎng)液中的藻細胞密度(個/mL)，t為培養(yǎng)時間(d)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

根據(jù)觀察結(jié)果編制生命表，凈生殖率(R0)、平均世代周期(T，d)、內(nèi)稟增長率(rm)按下式計算：

∑T=∑xlxRx/∑lxRx

R0=∑lxRx

rm=lnR0/T

式中，x為日齡(d)；lx為x齡的存活率(%)；Rx為x齡的生殖率(%)。

結(jié)果以平均值±標準差表示，采用SPSS 18.0軟件進行方差分析，其中P<0.05表示差異顯著，采用Microsoft Excel 2010和Origin 9.0繪圖。其中差異顯著性與否用小寫字母標注，字母相同表示差異不顯著(P>0.05)，字母不同則表示差異顯著(P<0.05)。

2 結(jié) 果

2.1 不同組合系統(tǒng)微藻和大型溞的生長特征

不同組合系統(tǒng)中3種微藻的生長見圖1。在20 d的培養(yǎng)期中，相對平均生長速率由高至低依次為：蛋白核小球藻>衣藻>隱藻。在培養(yǎng)的第8天時，除蛋白核小球藻+大型溞組合外，其他各組合系統(tǒng)的相對生長速率達到最高，顯著大于其后各時間段(P<0.05)，在第8天后，各處理組平均生長速率迅速下降，至培養(yǎng)結(jié)束時均小于10%。另外，加入大型溞組合的各微藻其相對生長速率在前8 d均大于未加入大型溞的組合，而第8天后則基本小于未加入大型溞的組合。而加入兩種微藻的組合的相對生長速率基本上小于單一藻的處理組。

圖1 不同處理組微藻在凡納濱對蝦養(yǎng)殖水中的生長性能Fig.1 Growth performance of different microalgae in water of Pacific white shrimp L.vannamei cultureC1.蛋白核小球藻；C2.蛋白核小球藻+大型溞；C3.衣藻；C4.衣藻+大型溞；C5.隱藻；C6.隱藻+大型溞；C7.蛋白核小球藻+衣藻；C8.蛋白核小球藻+衣藻+大型溞；C9.衣藻+隱藻；C10.衣藻+隱藻+大型溞；下同.C1.C.pyrenoidosa；C2.C.pyrenoidosa+D.magna；C3.Chlamydomonas sp.；C4.Chlamydomonas sp.+D.magna；C5.C.obovata；C6.C.obovata+D.magna；C7.C.pyrenoidosa+Chlamydomonas sp.；C8.C.pyrenoidosa + Chlamydomonas sp.+D.magna；C9.Chlamydomonas sp.+C.obovata；C10.Chlamydomonas sp.+ C.obovata+D.magna；et sequentia.

大型溞的生長特征見表2。各組大型溞的相對生長速率為蛋白核小球藻+大型溞>衣藻+大型溞>蛋白核小球藻+衣藻+大型溞>隱藻+衣藻+大型溞>隱藻+大型溞，平均世代周期依次為蛋白核小球藻+大型溞<蛋白核小球藻+衣藻+大型溞<衣藻+大型溞<隱藻+衣藻+大型溞<隱藻+大型溞，而內(nèi)稟增長率則是小球藻+大型溞組合最大，達到0.152，其次為衣藻+大型溞，其值為0.144，最低值是隱藻+大型溞，僅為0.102。

表2 不同組合系統(tǒng)下大型溞的生活史特征參數(shù)Tab.2 Characteristic parameters of life cycle of water fleas D.magna in different combined systems

2.2 不同組合系統(tǒng)大型溞和微藻的攝食關(guān)系

試驗前8 d，蛋白核小球藻、隱藻和衣藻細胞密度均低于各自添加了大型溞的處理組的細胞密度(圖2)，主要是前期大型溞繁殖數(shù)目較少，均小于28個(表3)，對藻類的攝食能力有限，同時由于大型溞在試驗水體中不斷地游動或產(chǎn)生一些化合物，一定程度上減輕了藻類的沉積，促進了藻類的繁殖，而在第8天后藻類的快速增殖，導致細胞密度顯著增加(P<0.05)，以及藻—溞處理組由于大型溞的快速繁殖，增強了其攝食能力，導致藻細胞密度低于藻處理組。另外，同相對生長速率變化規(guī)律一致，單一藻處理組的細胞密度均高于混合藻處理組，說明在同一水體中不同藻之間存在競爭效應。

表3 藻—溞組合系統(tǒng)中大型溞個數(shù)統(tǒng)計Tab.3 The number of water fleas D.magna in the microalga-daphnia system

圖2 各處理組中藻細胞密度變化特征Fig.2 The changes in microalga cell density in each treatment group

各處理組中，大型溞的數(shù)量存在一定差異，其中加入蛋白核小球藻組的大型溞數(shù)量最高，至試驗結(jié)束時達到88個，其次是衣藻，至試驗結(jié)束時達到80個，隱藻最差，至試驗結(jié)束時僅有59個，說明大型溞更喜攝食小球藻，其次是衣藻。尤其是單一藻液培養(yǎng)的大型溞數(shù)量大于混合藻液，主要是由于混合藻液中小球藻和衣藻的細胞密度低于單一藻液，一定程度上影響了大型溞的繁殖。

2.3 不同組合系統(tǒng)養(yǎng)殖水體pH和溶解氧水平的變化情況

圖3 不同微藻在凡納濱對蝦養(yǎng)殖水體中pH和溶解氧水平的變化情況Fig.3 The changes in pH and DO levels for different microalgae strains in water of Pacific white shrimp L.vannamei culture

試驗期間，各組溶解氧水平顯著增加，均達到過飽和狀態(tài)，主要是由于藻類的快速繁殖，在光合作用下釋放氧氣，增加了養(yǎng)殖水體中溶解氧質(zhì)量濃度，改善水環(huán)境。小球藻、小球藻+衣藻組增加最為明顯，由初始6.01 mg/L分別快速增至24.12 mg/L和23.25 mg/L；其次為小球藻+大型溞組和小球藻+衣藻+大型溞組分別增至21.12 mg/L和20.54 mg/L；而隱藻和隱藻+大型溞組增加最為緩慢，試驗結(jié)束時分別增至14.81 mg/L和14.63 mg/L，主要是隱藻增殖率最慢，藻細胞密度較低，光合作用相對較低。

2.4 不同組合系統(tǒng)養(yǎng)殖水體硝態(tài)氮、氨氮和亞硝氮含量的變化情況

各組對凡納濱對蝦養(yǎng)殖水體中硝態(tài)氮、氨氮和亞硝態(tài)氮的去除效果見圖4。

圖4 不同處理組對養(yǎng)殖尾水硝態(tài)氮(a)、亞硝態(tài)氮(b)及氨氮(c)去除效果分析Fig.4 The removal rates of nitrate (a),nitrite(b) and ammonia(c) nitrogens in microalga-daphnia systems

各組亞硝態(tài)氮的去除效果不同，培養(yǎng)的第8天，硝態(tài)氮的去除效果僅達10%，至培養(yǎng)的第12天，去除率約達20%，培養(yǎng)第16天時則顯著增加，至試驗結(jié)束時，除隱藻和隱藻+大型溞組對硝態(tài)氮的平均去除率分別為44%和50%外，其他處理組均達到60%以上，其中混合藻對硝態(tài)氮的凈化效果較好，小球藻+衣藻+大型溞、小球藻+衣藻、衣藻+隱藻+大型溞和衣藻+隱藻組分別為82%、74%、71%和67%；值得注意的是，加入大型溞的處理組比未加入的處理效果要好，說明藻—溞組合系統(tǒng)具有較好的硝態(tài)氮去除效果，尤其是小球藻+衣藻+大型溞組。

混合藻液對亞硝態(tài)氮去除效果優(yōu)于單一藻處理組，而加入大型溞的去除率要低于未加入的對照組，但差異不顯著，與硝態(tài)氮去除效果相反。培養(yǎng)前16 d，各處理組對亞硝態(tài)氮的去除率增加較為緩慢，而至試驗結(jié)束時均顯著增加(P<0.05)，其中小球藻+衣藻+大型溞組、小球藻+衣藻組吸收凈化效果最好，分別達到77%和73%，其次則為含有隱藻的處理組，順序依次為隱藻+衣藻、隱藻+衣藻+大型溞、隱藻和隱藻+大型溞組，去除率分別為72%、71%、69%和67%；而小球藻+大型溞組和衣藻+大型溞組凈化效果較差，分別為56%和53%。結(jié)果說明隱藻具有相對較好的亞硝態(tài)氮去除效果。

各處理組對氨氮的吸收效果差距較大，在培養(yǎng)的第8天，所有處理組的凈化效果均不理想，其中小球藻+衣藻處理效果最好，為51%；至第12天，含有小球藻的組合系統(tǒng)幾乎完全吸收氨氮，去除率顯著增加(P<0.05)，超過97%，其中小球藻+衣藻+大型溞組去除率為99%，其后基本保持不變，而含有衣藻的組合(衣藻、衣藻+大型溞、衣藻+隱藻和衣藻+隱藻+大型溞)去除率為63%～77%，至第16天時，則去除率快速增至89%以上，而隱藻和隱藻+大型溞組的去除效果最差，至試驗結(jié)束時僅達到67%和62%，顯著低于其他處理組(P<0.05)。說明加入適量大型溞并未顯著影響藻類對養(yǎng)殖水體氨氮的凈化。

3 討 論

3.1 不同組合系統(tǒng)對微藻生長性能的影響

同一養(yǎng)殖環(huán)境下，不同微藻生長特征存在較大差異，主要是由于不同微藻所需的最佳生長溫度、光照、營養(yǎng)鹽等環(huán)境因素不同引起的[11,17-18]，如硅藻適宜較低水溫(14～18 ℃)和氮磷比10∶1，綠藻則適宜相對較高溫度(20～25 ℃)和氮磷比16∶1[19]。本試驗中，培養(yǎng)溫度為25 ℃和氮磷比為18∶1，較適宜綠藻的生長繁殖，因此，蛋白核小球藻和衣藻具有相對較高的生長速率。不同微藻共培養(yǎng)時，兩者的藻細胞密度均低于單一藻處理組，但總細胞密度要高于單一藻，主要是由于在有限的資源條件下，兩種微藻對營養(yǎng)鹽及空間等存在競爭作用，這已被眾多研究者證實[20]。而藻—溞共培養(yǎng)時，培養(yǎng)初期大型溞密度較低，低密度的藻類增殖較快，而試驗后期由于大型溞攝食作用，高密度的藻類存在較高的牧食壓力，有效避免了“倒藻”的發(fā)生。主要是由于試驗初期大型溞的擾動作用一定程度上促進了藻類的繁殖，提高了氮的去除率，而當藻類大量繁殖時，大型溞這種促進作用逐漸減弱。這與楊洋等[21]發(fā)現(xiàn)的大型溞加入密度較小的藻液中，浮游植物的密度沒有下降反而上升結(jié)果一致；張曼等[22]學者亦提出隨著藻密度增加，大型溞繁殖率加快，其抑藻凈水的效果在后期更顯著。因此，在實際生產(chǎn)中，在對蝦養(yǎng)殖水體中接種濃縮蛋白核小球藻的同時，應及時接種大型溞，以預防小球藻的過度繁殖，維持養(yǎng)殖水體水環(huán)境的穩(wěn)定性，提高對蝦產(chǎn)量。

3.2 不同組合系統(tǒng)對大型溞生長特征的影響

藻—溞之間的影響是相互的，同樣大型溞對藻類的攝食具有選擇性，不同藻類因其適口性、形狀、藻粒徑大小和營養(yǎng)成分等因素均可顯著影響大型溞的生長繁殖[23]。蛋白核小球藻是單胞藻，呈球形或近球形，其粒徑為3～8 μm，細胞壁較薄且具有高蛋白特點，營養(yǎng)價值較高，非常適合大型溞的濾食，是大型溞的優(yōu)良適口餌料；衣藻是單胞藻，其粒徑約5～16 μm，細胞壁較厚，其蛋白含量低于小球藻；而隱藻粒徑一般大于20 μm，不利于大型溞的攝食，這與本試驗結(jié)果蛋白核小球藻+大型溞組具有最高生長速率，其次是衣藻+大型溞及隱藻+大型溞組生長最差的結(jié)果較一致。鑒于此，可定期接種蛋白核小球藻以促進大型溞的生長繁殖，提高池塘生態(tài)系統(tǒng)的生物多樣性，保持養(yǎng)殖環(huán)境的長久穩(wěn)定，同時為凡納濱對蝦提供天然生物餌料，增強免疫力，減少病害的發(fā)生。

另外，本試驗中蛋白核小球藻+衣藻+大型溞處理組中大型溞并未比衣藻+大型溞、蛋白核小球藻+大型溞處理組的生長繁殖快，說明單一藻比混合藻更適合大型溞的生長繁殖。這可能是由于混合藻液中藻細胞密度過大，細胞出現(xiàn)聚集現(xiàn)象，一定程度上影響了大型溞的運動及濾食能力。史文等[13]也發(fā)現(xiàn)，梅尼小環(huán)藻(Cyclotellameneghinana)和斜生柵藻在密度較高時均會出現(xiàn)團聚現(xiàn)象，顯著影響大型溞的生長繁殖。

3.3 不同組合系統(tǒng)對養(yǎng)殖水體水環(huán)境的影響

單一藻液凈化效果比較中，小球藻對養(yǎng)殖水體可溶性氮的吸收效果最好，其次是衣藻，隱藻最差，這與其相對生長速率相一致，即藻類繁殖越快，吸收利用營養(yǎng)物質(zhì)就越多；也說明該凡納濱對蝦養(yǎng)殖水體比較適合綠藻的生長繁殖，這與許多研究結(jié)果較一致[7,24]。加入大型溞的處理組比未加入的處理組具有較好的硝態(tài)氮去除效果，尤其是小球藻+衣藻+大型溞組，主要是由于試驗初期大型溞的擾動促進了藻類的繁殖，提高了對硝態(tài)氮的利用率，隨著大型溞繁殖數(shù)量的增多，對藻類攝食壓力增加，有效控制藻類過度繁殖而衰亡，避免營養(yǎng)物質(zhì)重新釋放到水體中。

不同藻類對養(yǎng)殖水體不同形態(tài)氮的利用不同。培養(yǎng)前4 d，所有組合系統(tǒng)優(yōu)先吸收利用氨氮，至12 d后氨氮幾乎被完全吸收，然后才開始大量吸收硝態(tài)氮，最后才開始利用亞硝態(tài)氮，這與前期試驗發(fā)現(xiàn)優(yōu)先利用硝態(tài)氮結(jié)果不一致[4]，這可能主要是由于本次養(yǎng)殖水體中氨氮初始質(zhì)量濃度(1.5 mg/L)在藻類吸收利用的理想范圍內(nèi)，藻類可以直接以氨氮作為合成氨基酸的底物，而硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮則要通過一系列酶先還原成亞硝態(tài)氮再還原成氨氮方能被利用。

本試驗結(jié)果表明，隱藻去除亞硝態(tài)氮的效果較好，對氨氮和硝態(tài)氮的去除效果較差，而小球藻和衣藻對3種形態(tài)的氮均具有較好的去除效果，這與眾多研究結(jié)果一致。如陳春云等[25]發(fā)現(xiàn)，蛋白核小球藻對養(yǎng)殖尾水的氨氮去除率達80%以上。尤其是小球藻+衣藻處理組，盡管由于競爭機制各自藻細胞密度低于單一藻液，但總藻細胞密度仍高于單一藻液，因此能夠吸收利用更多的氮，主要是由于藻類利用光合作用不斷吸收水體中的各種形態(tài)的氮，滿足自身生長營養(yǎng)需求[5]。

4 結(jié) 論

(1)藻—溞組合系統(tǒng)具有較好的水質(zhì)凈化調(diào)控效果，且各微藻及大型溞均可正常生長，其中蛋白核小球藻最有利于大型溞的生長繁殖，至培養(yǎng)后期，大型溞的牧食壓力能夠阻止藻密度過密，從而能夠長久維持有益藻相的穩(wěn)定。

(2)在本試驗研究條件下，接種蛋白核小球藻、衣藻以及大型溞最適于養(yǎng)殖水環(huán)境調(diào)控，維持藻相穩(wěn)定。