段璽, 王珂, 蘇肖, 劉凱樂, 劉佳歡, 王娟, 韓立柱, 汪蕓蘭, 宋逍

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗科，陜西 咸陽 712000；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，陜西 咸陽 712046)

痛經(jīng)是指女性在月經(jīng)前后或月經(jīng)期間所表現(xiàn)出來的小腹及腰部疼痛甚至劇痛難忍，常伴有面色蒼白、頭面冷汗淋漓、嘔吐等癥狀，是婦科最常見的疾病之一[1]。全國婦女月經(jīng)生理常數(shù)協(xié)作組的報告顯示，女性痛經(jīng)的發(fā)生率為33%，國外資料用不同的統(tǒng)計方法發(fā)現(xiàn)青少年女性痛經(jīng)的發(fā)病率為20%～90%，其中15%有重度痛經(jīng)[2]。目前治療痛經(jīng)的西藥主要是非甾體類抗炎藥物，其通過阻斷環(huán)氧化酶通路、抑制前列腺素類物質(zhì)合成，達(dá)到鎮(zhèn)痛作用[3]，藥效持續(xù)時間短，長期服用易引起胃腸道等不良反應(yīng)，多數(shù)患者不能耐受[4]。中醫(yī)將痛經(jīng)分為氣滯血瘀、寒凝血瘀、濕熱蘊(yùn)結(jié)、氣血虛弱、腎氣虧損五種證型?！安煌▌t痛”、“不榮則痛”是痛經(jīng)的基本病機(jī)。原發(fā)性痛經(jīng)氣血虛弱證是臨床常見的證型之一，該類患者素體虛弱，氣血不足，或大病久病，耗傷氣血，或脾胃虛弱，化源不足，氣虛血少，經(jīng)行血泄，治法主要以益氣養(yǎng)血止痛、溫經(jīng)散寒、活血化瘀止痛為基本原則，臨床療效較為穩(wěn)定[5]。當(dāng)歸建中湯(Danggui Jianzhong Decoction, DGJZD)出自《宋·太平惠民和劑局方》，由當(dāng)歸、甘草、肉桂、白芍四味藥組成，當(dāng)歸補(bǔ)血養(yǎng)血活血，甘草偏于生津，肉桂辛酸溫通，白芍補(bǔ)血緩急，主治血氣虛損，痛引腰背，時自汗出，不思飲食，全方既補(bǔ)血又溫中補(bǔ)虛，在臨床上常用于氣血虛弱所致的痛經(jīng)，但目前關(guān)于當(dāng)歸建中湯的研究主要在藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和臨床病例研究，其治療痛經(jīng)的有效成分和作用機(jī)制需要進(jìn)一步探究。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)能夠從整體的角度探索藥物與疾病間的關(guān)聯(lián)性，通過構(gòu)建“藥物-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)，結(jié)合分子功能、生物學(xué)過程分析，對分子層面的作用機(jī)制進(jìn)行解釋，為藥物的研發(fā)提供新的策略[6]。目前有諸多研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究思路進(jìn)行中藥單味或復(fù)方的作用機(jī)制研究，并取得了豐富的研究成果[7]。李杰等[8]通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討了四物湯治療原發(fā)性痛經(jīng)的作用機(jī)制；韓彥琪等[9]基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對元胡止痛滴丸治療原發(fā)性痛經(jīng)的配伍合理性進(jìn)行研究；本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法，依據(jù)中醫(yī)整體觀，系統(tǒng)地對當(dāng)歸建中湯治療痛經(jīng)的作用機(jī)制進(jìn)行探討，并利用分子對接技術(shù)對當(dāng)歸建中湯中化合物和受體分子進(jìn)行虛擬結(jié)合，發(fā)現(xiàn)其作用靶點和結(jié)合位點，闡述當(dāng)歸建中湯多成分、多靶點、多通路的協(xié)同作用機(jī)制，為后續(xù)的深入研究提供相應(yīng)的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 藥物有效成分篩選

通過TCMSP(http:∥lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)數(shù)據(jù)庫及查閱相關(guān)文獻(xiàn)篩選當(dāng)歸建中湯(當(dāng)歸、甘草、肉桂、白芍)的有效成分信息，并找出其作用靶點，在Uniport數(shù)據(jù)庫(https:∥www.uniprot.org/)中輸入靶點名稱并限定物種為人，對靶點進(jìn)行蛋白名稱標(biāo)準(zhǔn)化，得到藥物的潛在靶點。

1.2 疾病靶點的獲取

以“dysmenorrhea”為檢索詞在CTD(https:∥ctdbase.org/)，DisGeNET (https:∥www.disgenet.org/)，Drugbank(https:∥www.drugbank.ca/)數(shù)據(jù)庫中檢索相關(guān)靶點。

1.3 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析

利用Venny 2.1.0 繪制韋恩圖獲得當(dāng)歸建中湯與組分及痛經(jīng)靶點交集，即為當(dāng)歸建中湯治療痛經(jīng)的可能作用靶點，將交集靶點在生物分子功能注釋系統(tǒng)STRING(https:∥string-db.org/)數(shù)據(jù)庫中建立 PPI 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，并根據(jù)結(jié)果對其進(jìn)行分析。

1.4 功能富集分析與通路分析

采用R語言中clusterProfiler程序包對共有的靶標(biāo)進(jìn)行GO富集分析和 KEGG 通路分析，當(dāng)歸建中湯對應(yīng)的靶蛋白直接映射到通路上，藥物靶點富集的通路即藥物治療的通路，并繪制氣泡圖可視化。將藥材、活性化合物、靶點、通路用Cytoscape 3.7.0軟件，構(gòu)建“藥材-成分-靶點-通路”可視化網(wǎng)絡(luò)圖，探究當(dāng)歸建中湯活性成分的“多靶標(biāo)-多通路-多層次”的治療作用。

1.5 分子對接分析

在PubChem(https:∥pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫中得到當(dāng)歸建中湯中化合物的3D結(jié)構(gòu)；從RCSB PDB(http:∥www.rcsb.org/)數(shù)據(jù)庫中篩選得到核心靶蛋白的晶體結(jié)構(gòu)，去除水分子和配體小分子，分離出潛在蛋白的結(jié)構(gòu)。采用AutoDock 4.2.6軟件中遺傳算法進(jìn)行半柔性對接，盒子中心坐標(biāo)和大小根據(jù)蛋白質(zhì)分子的活性位點位置和其對配體小分子可能發(fā)生作用的區(qū)域進(jìn)行設(shè)定，其余參數(shù)保持默認(rèn)，對化合物和靶標(biāo)蛋白進(jìn)行分子對接分析。

2 結(jié)果

2.1 當(dāng)歸建中湯有效成分及靶點的篩選

運(yùn)用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(TCMSP)搜索關(guān)鍵詞“當(dāng)歸、甘草、白芍、肉桂”[10]，再根據(jù)OB，DL的取值篩選后得到110個有效成分，其中當(dāng)歸44個，肉桂12個，甘草41個，白芍13個，剔除重復(fù)后得到當(dāng)歸建中湯有效成分83個，見表1，在Uniport數(shù)據(jù)庫對靶點蛋白名稱標(biāo)準(zhǔn)化后得到藥材成分的潛在作用靶點184個。

表1 當(dāng)歸建中湯有效成分及靶點

續(xù)表1

2.2 當(dāng)歸建中湯靶點與痛經(jīng)靶點交集分析

通過CTD、DisGeNET、Drugbank數(shù)據(jù)庫檢索合并去重得到300個與痛經(jīng)相關(guān)的靶點，將藥材的靶點與疾病的靶點做交集，映射后獲得當(dāng)歸建中湯與痛經(jīng)的共有靶點29個，繪制韋恩圖，見圖1。

圖1 當(dāng)歸建中湯靶點與痛經(jīng)交集靶點

2.3 構(gòu)建當(dāng)歸建中湯“藥材-有效成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)

根據(jù)上述所得結(jié)果，利用 Cytoscape 軟件構(gòu)建“藥材-有效成分 -靶點”網(wǎng)絡(luò)，見圖2。該網(wǎng)絡(luò)圖中共包括116個節(jié)點,其中83個藥物活性成分節(jié)點、29個靶蛋白節(jié)點和4個藥材節(jié)點，每條邊表示單味藥與活性成分、活性成分與作用靶點之間的關(guān)系，其中藍(lán)色節(jié)點代表藥材，紫色代表活性成分，綠色代表作用靶點[11]。

2.4 構(gòu)建活性靶點PPI網(wǎng)絡(luò)

將交集靶點導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫中，設(shè)定物種為“Homo sapiens”，進(jìn)行蛋白質(zhì)互作分析，利用 Cytoscape 構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖，一個節(jié)點代表一個靶點，節(jié)點大小程度反映度值(Degree)的大小，邊代表靶點彼此的作用關(guān)系，最終得到PPI網(wǎng)絡(luò)分析圖[12]，見圖3。

圖2 當(dāng)歸建中湯“藥材-有效成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)

圖3 靶蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 靶點KEGG富集分析

KEGG數(shù)據(jù)庫包含了細(xì)胞和生物高級功能的注釋，包括KEGG路徑圖，BRITE層次結(jié)構(gòu)和KEGG模塊[13]。利用KEGG將當(dāng)歸建中湯對應(yīng)的靶蛋白映射到通路上，分析藥物活性、靶點和通路。其中信號通路主要包括代謝、細(xì)胞色素、壓力等方面，如細(xì)胞色素P450對異生物素的新陳代謝、藥物代謝-細(xì)胞色素P450、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化，糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路，其他通路如TNF信號通路、IL-7信號通路等。KEGG富集通路分析得到93條通路，排列前20個富集分析見圖4。

2.6 GO富集分析

GO描述了基因產(chǎn)品(蛋白質(zhì)或RNA)參與的生物學(xué)過程，分子功能和細(xì)胞組成[14]，并將概念粗細(xì)不同的功能概念組織成圖集進(jìn)行分析，根據(jù)P值排序，結(jié)果見圖5。圖中橫坐標(biāo)為富集基因的個數(shù)，柱的顏色代表P值的大小，顏色由藍(lán)到紅，P值由大變小，并將概念粗細(xì)不同的功能概念組織成圖集進(jìn)行分析。其過程主要集中在生物學(xué)過程，共有639個富集結(jié)果，主要涉及對氧化合物反應(yīng)、對脂質(zhì)反應(yīng)、對激素反應(yīng)、對化學(xué)物質(zhì)反應(yīng)、對有機(jī)物質(zhì)反應(yīng)、活性氧代謝正調(diào)控等方面；分子功能中共富集到70條結(jié)果，與氧化還原酶活性、木糖還原酶活性等酶活性方面有關(guān)；細(xì)胞組成有24條富集結(jié)果，其與細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞外區(qū)域外部分及參與細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)等有關(guān)。

2.7 藥材-成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)分析

利用Cytoscape 3.7.0中的Merge功能將藥材-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)合并，得到藥材-成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖，見圖6。網(wǎng)絡(luò)中有4個節(jié)點表示藥材，78個節(jié)點表示有效成分(去除沒有與靶點直接相連的成分)，24個節(jié)點代表與痛經(jīng)相關(guān)的疾病靶點(去除游離的蛋白點)，20個節(jié)點代表與痛經(jīng)靶點相關(guān)的通路。由網(wǎng)絡(luò)分析圖可知，有效成分中連接邊數(shù)較多的為山柰酚、芒柄花素、兒茶素和刺果甘草查耳酮；潛在靶點中PTGS2、GSK3B、ESR1、MAOB連接較多邊數(shù)；通路中如流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化、藥物代謝-細(xì)胞色素P450、腫瘤壞死因子素信號通路與潛在靶點有較多的連接。結(jié)合蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，對數(shù)據(jù)進(jìn)行拓?fù)浞治?，發(fā)現(xiàn)ESR1、PTGS2、GSK3B節(jié)點度值顯著高于其他靶點，預(yù)測ESR1、PTGS2、GSK3B可能是治療痛經(jīng)的核心靶點。

粉色：藥材；綠色：藥材有效成分；藍(lán)色：通路；橙色：作用靶點

2.8 分子對接結(jié)果

分子對接是模擬配體小分子和受體生物大分子之間的相互作用，得到其最佳結(jié)合位置和結(jié)合強(qiáng)度，預(yù)測其親和力。根據(jù)當(dāng)歸建中湯“藥材-成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)中靶點與成分連接的度值，藥材成分中芒柄花素、山柰酚和兒茶素與痛經(jīng)的潛在靶點ESR1、PTGS2、GSK3B進(jìn)行分子對接分析，分子之間結(jié)合能量較低的構(gòu)象則較為穩(wěn)定，篩選對接結(jié)果中結(jié)合能低的分子構(gòu)象即為最優(yōu)對接結(jié)果，并分析其結(jié)合位點，見表2和圖7。對接結(jié)果顯示，芒柄花素與三個受體大分子都能夠較好的結(jié)合，與PTGS2中氨基酸殘基Asn382和Trp387結(jié)合能分別為-3.219 kcal·mol-1和-3.259 kcal·mol-1，表明其具有良好的親和力。ESR1與兒茶素和芒柄花素之間能夠形成氫鍵，具有穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。

表2 兒茶素、芒柄花素和山柰酚與痛經(jīng)潛在靶點結(jié)合能

A：兒茶素和ESR1；B：兒茶素和PTGS2；C：芒柄花素和PTGS2；D：芒柄花素和GSK3B；E：芒柄花素和ESR1；F：山奈酚和PTGS2

3 討論

中醫(yī)藥是利用辯證和整體的思維模式來治療疾病，中藥或中藥復(fù)方具有多組分，能夠通過多途徑、多靶點、多環(huán)節(jié)發(fā)揮整體調(diào)節(jié)作用[15]。本文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接的方法，對當(dāng)歸建中湯治療痛經(jīng)進(jìn)行了較系統(tǒng)的預(yù)測分析，其中PTGS2具有擴(kuò)張小血管、增加微血管通透性與其他炎性介質(zhì)協(xié)同作用多種致炎機(jī)制，研究表明，痛經(jīng)的根本原因為前列腺素含量的改變。孕激素可促進(jìn)雌二醇轉(zhuǎn)化為無活性的雌酮，使前列腺素的生成受到抑制，舒張子宮平滑肌而緩解痛經(jīng)[16]。ESR1(雌激素受體)和類固醇激素受體均為核受體，核受體與相應(yīng)的配體及其輔調(diào)節(jié)因子相互作用參與調(diào)控真核細(xì)胞基因的表達(dá)，影響靶細(xì)胞的增殖和分化。血液循環(huán)中的雌激素可靶向作用于單核細(xì)胞譜系、減輕相應(yīng)的免疫反應(yīng)。相關(guān)研究報道雌激素含量增加會間接促進(jìn)PGF2α的合成和釋放，導(dǎo)致子宮收縮、血供不足引起痛經(jīng)[17]。AKR1C3可以使活性雄激素、雌激素和孕激素與它們的同源無活性代謝物相互轉(zhuǎn)化，雄激素、雌激素和孕激素相互作用，增強(qiáng)機(jī)體耐經(jīng)期疼痛能力。經(jīng)期機(jī)體代謝能力增強(qiáng)，機(jī)體內(nèi)脂消耗速率加快，但是在月經(jīng)期間胃部可能會積食，CYP1A2通過蛋白激酶發(fā)出的信號導(dǎo)致Jak激酶活化，Jak激酶的活化可以減少由胃部帶來的疼痛。經(jīng)期與孕激素受體(PGR)相關(guān)，如果孕激素活化、分泌多，會減少由激素帶來的不適，而且類固醇激素及其受體參與真核基因表達(dá)的調(diào)節(jié)，并影響靶組織中的細(xì)胞增殖和分化。F2為凝血酶原，凝血酶將纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為纖維蛋白，激活因子Ⅴ、Ⅶ、Ⅷ、與凝血酶調(diào)節(jié)蛋白配合，對多種凝血因子具有水解作用，蛋白C在血液穩(wěn)態(tài)、炎癥和傷口愈合中發(fā)揮作用。單胺氧化酶B(MAOB)存在于神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞及血小板中，可催化生物胺和異生物胺的氧化脫氨，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周組織的神經(jīng)活性及血管活性胺的代謝中發(fā)揮重要作用。由此推測，當(dāng)歸建中湯治療痛經(jīng)的作用機(jī)制可能與炎癥反應(yīng)、激素調(diào)節(jié)、細(xì)胞生長及中樞神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)相關(guān)。

對靶點相關(guān)的信號通路分析可知，SELE、HSP90AA1、GSTM2、GSTM1、NF、VCAM1、EDN1可作用于流體剪切應(yīng)力和動脈粥樣硬化通路，在流體剪切應(yīng)力降低的情況下，血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的縮血管活性物質(zhì)、血小板源性生長因子、炎癥介質(zhì)、促血管內(nèi)皮細(xì)胞增生和凋亡的活性物質(zhì)可促進(jìn)細(xì)胞增生和血細(xì)胞黏附，進(jìn)而導(dǎo)致動脈粥樣硬化的發(fā)生[18]。雌激素信號通路，孕烯醇酮和黃體酮是三類固醇的原料，糖皮質(zhì)激素和鹽皮質(zhì)激素的C21類固醇，雄激素的C19類固醇和雌激素的C18類固醇，有相關(guān)文獻(xiàn)報道，痛經(jīng)與月經(jīng)周期中的性激素變化密切相關(guān)[19]。胰島素抵抗和血管內(nèi)皮功能障礙二者之間相互影響、相互促進(jìn)，形成惡性循環(huán)，造成動脈粥樣硬化、炎癥性血管疾病，月經(jīng)期間疼痛加劇，經(jīng)期血塊堆積[20]。胰島素抵抗使胰島素促進(jìn)葡萄糖攝取和利用的效率下降，機(jī)體代償性地分泌過多，能夠引起高胰島素血癥，造成過度肥胖，會引起月經(jīng)紊亂、不孕不育、痤瘡等癥狀[21]。進(jìn)一步通過GO功能富集分析，可以發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸建中湯治療痛經(jīng)的作用機(jī)制涉及多個生物學(xué)過程，主要集中在物質(zhì)氧化代謝、酶活性、激素調(diào)節(jié)等方面。

綜上，當(dāng)歸建中湯治療痛經(jīng)不僅抑制前列腺素的生成，而且調(diào)節(jié)其他與痛經(jīng)相關(guān)的病理過程，如血小板聚集、血管相關(guān)因子及炎癥因子的表達(dá)，從而抑制血栓形成，促進(jìn)組織修復(fù)，調(diào)節(jié)子宮的收縮性，溫補(bǔ)氣血，達(dá)到緩解痛經(jīng)的目的。本研究基于當(dāng)歸建中湯中藥材的化學(xué)成分及靶點對其作用機(jī)制進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析及分子對接分析，為當(dāng)歸建中湯治療痛經(jīng)的作用機(jī)制提供理論依據(jù)。