董魯浩，李曉慧，宋語(yǔ)寧，王 賀，李興國(guó)，別曉敏

（1山東農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/作物生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東泰安271018；2山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/作物生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東泰安271018)

0 引言

DNA甲基化是一種重要的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制，在染色體完整、基因組印跡、X染色體失活、轉(zhuǎn)座子和逆轉(zhuǎn)錄病毒的抑制以及基因表達(dá)等方面起著重要作用[1-2]。在真核生物中，5-氮雜胞嘧啶核苷(5-azacytidine,5-azaC)通過(guò)抑制DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶活性維持基因組DNA的低甲基化水平[3]。

前人研究表明，低甲基化水平和高甲基化水平的平衡是植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生的關(guān)鍵所在[4-5]。在培養(yǎng)基中添加5-azaC可改變多種植物愈傷組織的甲基化水平，進(jìn)而影響胚性愈傷組織的形成和再生頻率[6]?？煽蓸?shù)(Theobroma cacaogenotype EET 103)外植體在添加5-azaC培養(yǎng)基中可阻止體細(xì)胞胚胎發(fā)生數(shù)量的下降，20 μmol/L 濃度處理最為有效[7]。劉艷等[8]將20.0 μmol/L 5-azaC加入水曲柳(Fraxinus mandshurica)愈傷組織的培養(yǎng)基中，第l天加入可明顯的抑制體細(xì)胞胚胎發(fā)生，第15～21天時(shí)加入則顯著促進(jìn)的體細(xì)胞胚胎發(fā)生。5-azaC濃度為100 μmol/L時(shí)改變雜交落葉松hybrid larch(Larix×eurolepis)胚性愈傷組織的DNA甲基化狀態(tài)，顯著降低相對(duì)生長(zhǎng)速率和胚性潛能[9]。Santos等[10]選擇不同體細(xì)胞胚胎發(fā)生能力的蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)為材料，發(fā)現(xiàn)100 μmol/L 5-azaC阻礙了胚性能力強(qiáng)的株系體細(xì)胞胚胎的產(chǎn)生和胚性能力弱的株系愈傷組織的生長(zhǎng)。在菊花(Dendranthema×grandiflorum)離體材料培養(yǎng)過(guò)程中，5-azaC在100μmol/L以上可抑制生長(zhǎng)發(fā)育，500 μmol/L以上有致死效應(yīng)，所處理材料中基因組DNA甲基化水平明顯降低[11]。Solís等[12]發(fā)現(xiàn)5-azaC通過(guò)降低整體DNA甲基化來(lái)促進(jìn)油菜(Brassica napusL.cv.Topas)和大麥(Hordeum vulgareL.cv.Igri)的小孢子胚胎發(fā)生，2.5 μmol/L處理4天可增加胚胎誘導(dǎo)數(shù)，但隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)胚胎誘導(dǎo)數(shù)下降。

作為全球第一大口糧作物，小麥(Triticum aestivumL.)為世界35%～40%的人提供口糧[13-14]。隨著全球人口數(shù)量的增加和人們對(duì)高品質(zhì)生活的追求，利用基因工程方法和分子育種手段對(duì)小麥產(chǎn)量和品質(zhì)等農(nóng)藝性狀進(jìn)行改良已成為重要趨勢(shì)[15-16]。小麥組織培養(yǎng)的再生頻率是影響遺傳轉(zhuǎn)化的重要因素[17-18]。通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)基組分來(lái)提高植物再生頻率是常用手段之一[19-20]。目前5-azaC已應(yīng)用于多種植物胚性愈傷組織的誘導(dǎo)，但在小麥成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)中的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)在培養(yǎng)基中添加5-azaC來(lái)分析其對(duì)小麥成熟胚再生效率的影響，為進(jìn)一步優(yōu)化小麥成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)和分化的組織培養(yǎng)體系提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料種植與保存

CB037、Fielder和中國(guó)春(Chinese Spring，CS)為本研究所用的3種小麥材料。供試的小麥材料春播于山東農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)站農(nóng)場(chǎng)，收獲成熟種子進(jìn)行成熟胚培養(yǎng)。

1.2 材料培養(yǎng)及5-azaC濃度設(shè)置

選擇飽滿的小麥成熟種子消毒，先將成熟胚刮碎后接種于預(yù)培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)7天，再轉(zhuǎn)移到胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基暗培養(yǎng)14天，最終轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基上光照培養(yǎng)（16 h光照/8 h黑暗），所有試驗(yàn)材料置于25℃培養(yǎng)箱[21]。培養(yǎng)基成分見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)所用培養(yǎng)基

在小麥成熟胚胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，5-azaC分別設(shè)置0 μmol/L（對(duì)照）、10 μmol/L和50 μmol/L 3個(gè)濃度處理。每個(gè)濃度取材3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)接種30個(gè)小麥成熟胚。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

小麥成熟胚在預(yù)培養(yǎng)基培養(yǎng)7天時(shí)統(tǒng)計(jì)接種外植體數(shù)目，在胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)14天統(tǒng)計(jì)胚性愈傷組織誘導(dǎo)數(shù)目，在分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)21天統(tǒng)計(jì)成熟胚的愈傷組織分化數(shù)目和綠芽誘導(dǎo)數(shù)目，并計(jì)算胚性愈傷組織誘導(dǎo)率、愈傷組織分化率和綠芽誘導(dǎo)率，見(jiàn)公式(1)，公式(2)和公式(3)。利用6.85版DPS中LSD法進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度的5-azaC顯著降低小麥胚性愈傷組織誘導(dǎo)率

小麥成熟胚在胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)14天時(shí)，統(tǒng)計(jì)和分析了胚性愈傷組織誘導(dǎo)率。結(jié)果表明，5-azaC處理可降低CB037、Fielder和CS的胚性愈傷組織誘導(dǎo)率（圖1）。CB037和CS胚性愈傷組織誘導(dǎo)率，在50 μmol/L 5-azaC濃度處理下分別為59.43%和23.89%，與對(duì)照相比，下降水平達(dá)到顯著性差異；在10 μmol/L濃度處理下，胚性愈傷組織誘導(dǎo)率與對(duì)照相比無(wú)顯著性差異。Fielder在5-azaC 10 μmol/L和50 μmol/L濃度處理下，胚性愈傷組織誘導(dǎo)率分別為39.13%和35.71%，與對(duì)照相比，下降程度均具有顯著性差異。

圖1 不同濃度5-azaC處理降低CB037、Fielder和CS胚性愈傷組織誘導(dǎo)率

2.2 添加5-azaC降低CB037、Fielder和CS的愈傷組織分化率

為明確5-azaC對(duì)小麥成熟胚愈傷組織分化率的影響，在分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)21天時(shí)統(tǒng)計(jì)長(zhǎng)芽愈傷組織數(shù)目。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，5-azaC的添加對(duì)CB037愈傷組織誘導(dǎo)率的影響最為顯著，10 μmol/L濃度時(shí)愈傷組織誘導(dǎo)率為 40.60%，50 μmol/L時(shí)降至 32.08%，與對(duì)照47.46%相比，二者下降水平均達(dá)到極顯著性差異（圖2，圖3A-C）。Fielder在50 μmol/L濃度處理時(shí)，與對(duì)照相比，具有顯著性水平下降（圖2，圖3D-E）。對(duì)于CS愈傷組織誘導(dǎo)率而言，5-azaC的添加無(wú)明顯影響（圖2，圖3F-G）?？傮w來(lái)說(shuō)，5-azaC對(duì)小麥愈傷組織分化率的影響有濃度和基因型的差異。

圖2 不同濃度5-azaC處理降低CB037、Fielder和CS愈傷組織分化率

圖3 不同濃度5-azaC降低不同小麥成熟胚愈傷組織分化率

2.3 添加5-azaC降低小麥成熟胚綠芽誘導(dǎo)率

為分析5-azaC的添加對(duì)小麥成熟胚綠芽誘導(dǎo)率的影響，統(tǒng)計(jì)了成熟胚綠芽數(shù)目。結(jié)果表明，10 μmol/L 5-azaC可降低Fielder的綠芽誘導(dǎo)率，并達(dá)到顯著性差異水平，而對(duì)CB037和CS無(wú)明顯影響。50 μmol/L 5-azaC可降低CB037的綠芽誘導(dǎo)率，由對(duì)照的79.62%降至54.72%，與對(duì)照相比，達(dá)到極顯著差異水平；同時(shí)，亦降低Fielder的綠芽誘導(dǎo)率，由對(duì)照的31.15%降至27.14%，與對(duì)照相比，具有顯著性差異；CS對(duì)5-azaC的添加不敏感，綠芽誘導(dǎo)率無(wú)顯著變化（圖4）。

圖4 不同濃度5-azaC處理降低CB037、Fielder和CS綠芽誘導(dǎo)率

3 討論

體細(xì)胞胚胎發(fā)生的誘導(dǎo)和產(chǎn)生需要一定程度的DNA甲基化水平，5-azaC可以通過(guò)促進(jìn)表觀遺傳變異來(lái)調(diào)節(jié)植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生[10,12]。Grzybkowska等[22]以10 μmol/L 5-azaC處理擬南芥表現(xiàn)為強(qiáng)烈地抑制體細(xì)胞胚胎發(fā)生，同時(shí)外植體產(chǎn)生大量非胚性愈傷組織，而未處理的外植體則快速高效的形成體細(xì)胞胚胎。短柄草在5-azaC 50 μmol/L濃度處理時(shí)，胚性愈傷組織的誘導(dǎo)受到抑制[23]。本研究發(fā)現(xiàn)在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加不同濃度的5-azaC可降低小麥成熟胚再生頻率，且隨著添加濃度的升高，降低效果越明顯。該結(jié)果與前人研究結(jié)果基本一致。

在本研究中，5-azaC添加濃度為50 μmol/L時(shí)，顯著降低CB037再生效率，胚性愈傷組織誘導(dǎo)率與對(duì)照相比，達(dá)到顯著性差異水平；愈傷組織分化率和綠芽誘導(dǎo)率與對(duì)照相比，具有極顯著性差異。Fielder胚性愈傷組織誘導(dǎo)率和綠芽誘導(dǎo)率與對(duì)照相比，在10 μmol/L和50 μmol/L時(shí)均有顯著性差異的下降。而CS在50 μmol/L濃度時(shí)，僅胚性愈傷組織誘導(dǎo)率與對(duì)照相比有顯著性差異的下降，在較低濃度時(shí)再生頻率不受5-azaC的影響。由以上結(jié)果可知，5-azaC對(duì)小麥組織培養(yǎng)再生頻率的影響有基因型的差異，且再生效率高的基因型所受抑制程度高于再生頻率低的基因型，這可能與不同小麥基因型DNA甲基化水平不同有關(guān)系[24-25]。

前人研究發(fā)現(xiàn)5-azaC對(duì)離體叢生芽的抑制具有時(shí)間和劑量的累加效應(yīng)，處理材料基因組DNA甲基化水平明顯降低，且去處理后的繼代過(guò)程中仍有部分位點(diǎn)保持低甲基化狀態(tài)[11]。5-azaC在材料培養(yǎng)的第l天加入可明顯抑制水曲柳體細(xì)胞胚胎發(fā)生，而第15～21天時(shí)加入則顯著促進(jìn)體細(xì)胞胚胎發(fā)生[8]。在油菜和大麥中，5-azaC通過(guò)降低整體甲基化水平促進(jìn)小孢子胚胎誘導(dǎo)的起始，但同時(shí)也阻礙了愈傷組織分化時(shí)所需的重新DNA甲基化，導(dǎo)致處理時(shí)間延長(zhǎng)后反而降低誘導(dǎo)率[12]。由此可見(jiàn)，外植體中甲基化水平與其再生頻率具有重要關(guān)系，甲基化抑制劑添加的濃度與時(shí)間會(huì)影響外植體的再生頻率。

4 結(jié)論

本研究在小麥成熟胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加5-azaC，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CB037、Fielder和CS的再生頻率降低。而且添加10 μmol/L 5-azaC對(duì)胚性愈傷組織誘導(dǎo)率、愈傷組織分化率和綠芽分化率的抑制要低于50 μmol/L。此外，5-azaC對(duì)小麥再生頻率的影響有基因型差異，再生效率較高的CB037和Fielder所受抑制程度高于再生頻率低的CS。植物組織培養(yǎng)所用外植體的甲基化水平影響再生頻率，不同基因型DNA甲基化水平有差異，因此我們可以利用甲基化抑制劑優(yōu)化培養(yǎng)基，提高不同基因型小麥的再生頻率。