關(guān)揚揚，鄭淑心，劉向陽，王召軍，張洪映，崔 紅，閆筱筱

河南農(nóng)業(yè)大學煙草學院，鄭州市文化路95 號 450002

干旱是農(nóng)作物種植過程中常發(fā)生的非生物脅迫之一。干旱脅迫會導致植物生長緩慢、光合色素降解、細胞膜受損、活性氧（ROS）量增加以及細胞含水率下降等，使植物生長發(fā)育受到顯著抑制［1］。煙草作為一種特殊的葉用經(jīng)濟作物，維持其正常生長就需要在整個大田種植期保持50%以上的土壤相對含水率［2］。尤其在我國北方一些缺乏灌溉條件的煙葉產(chǎn)區(qū)，每年煙株生長發(fā)育受阻的現(xiàn)象頻繁發(fā)生。干旱可降低煙葉產(chǎn)量和品質(zhì)，是煙草生產(chǎn)的主要限制因素之一。因此提高煙草自身的抗旱能力至關(guān)重要［3］。

近年來，植物腺毛在抵御病蟲害、抵抗逆境脅迫和次生代謝產(chǎn)物的合成等方面發(fā)揮著重要作用。葉面腺毛能夠減少葉面蒸騰，有效抵抗干旱等［4］非生物脅迫。在番茄的抗旱試驗中，表皮毛尤其是非腺體毛數(shù)量豐富的品種，其儲水能力更強，抗旱效果更好［5］。煙田土壤水分的豐缺也會影響煙草腺毛類型、密度、分泌物成分等［6］。張華等［7］試驗表明，煙草腺毛內(nèi)部的超微結(jié)構(gòu)會因水分豐缺而有較大改變，嚴重缺水會導致葉片中腺頭細胞的細胞質(zhì)和細胞器急劇減少，甚至會造成腺頭細胞內(nèi)部成分降解。齊永杰等［8］研究發(fā)現(xiàn)，輕度干旱會延長煙草成熟期，且煙葉表面的腺毛會因干旱而密度有所增加。孟盈等［9］試驗提出，煙草K326 中NtCycB2基因過表達會造成煙草分泌型和非分泌型腺毛數(shù)量顯著減少，葉片存留少量的短柄分泌型腺毛，而該基因敲除會使腺毛密度顯著增加，尤其是長柄分泌型腺毛。本課題組前期通過RT-PCR 分析發(fā)現(xiàn)，NtCycB2對干旱、低溫、鹽害等逆境脅迫具有應答反應［9］。NtCycB2敲除后煙草葉面化學成分合成和分泌能力提高，并且烤后煙葉的香氣成分總量增加，這在提高煙葉品質(zhì)方面有著積極作用［10］。但目前關(guān)于NtCycB2敲除的多腺毛株系和NtCycB2過表達的少腺毛株系對逆境脅迫的研究還鮮見報道。為此，以K326 為對照，設置NtCycB2參與調(diào)控不同腺毛密度的轉(zhuǎn)基因株系對干旱脅迫的反應試驗，旨在為煙草耐旱新品種的選育提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以栽培煙草品種K326 為對照，以及K326 為材料的NtCycB2敲除株系ko（NtCycB2-ko）和NtCycB2過表達株系oe［9］。

1.2 試驗方法

采用漂浮育苗，待煙苗生長至5 葉1 心時，從苗盤中選取長勢一致的oe、ko 和K326 株系幼苗進行干旱脅迫處理。首先，在流水下漂去根系上的泥土，再用蒸餾水沖洗3 次后將煙苗放入裝有質(zhì)量體積分數(shù)為0、5%、10%和15%PEG-6000 的Hoagland 營養(yǎng)液的試管中，分別處理0、3、6 和9 h時，觀察并記錄煙苗的形態(tài)變化，并取煙草相同部位葉片測定氣孔開度，重復3 次。同時在漂浮育苗盤中進行干旱脅迫試驗，干旱7 d 后復水1 d。煙苗干旱處理7 d 后取煙草相同部位葉片分別測定生物量、葉綠素含量（質(zhì)量分數(shù)）、死細胞數(shù)量和活性氧狀況、超氧化物歧化酶（SOD）活性、過氧化物酶（POD）活性、丙二醛（MDA）含量、脯氨酸（Pro）含量、離體葉片失水率和煙草抗旱相關(guān)基因表達量，并采集和保存0 d 和7 d 的煙草葉片于-80 ℃冰箱中備用。重復3 次。

1.3 測定項目與方法

用質(zhì)量體積分數(shù)1%碘-碘化鉀溶液染色并利用生物顯微鏡（N-117M，中國寧波永新公司）觀察葉片氣孔開度［11］。隨機觀測3 個視野，每個視野下隨機選擇10 個氣孔進行測定。隨后用ImageJ軟件測量氣孔的長軸和短軸，并計算氣孔開度［12］。

采用烘干法測定生物量［13］。參照鄒琦［14］的方法，使用質(zhì)量分數(shù)為80%丙酮浸提測定葉綠素含量（質(zhì)量分數(shù)）。采用臺盼藍（Trypan Blue）和硝基四氮唑藍（NBT）染色，并置于超景深顯微鏡（VHR-5000，日本基恩士公司）下觀察死細胞數(shù)量和活性氧狀況［15-16］。采用氮藍四唑法測定SOD 活性［17］，愈創(chuàng)木酚比色法測定POD 活性［17］，硫代巴比妥酸法測定MDA 含量［17］，酸性茚三酮法測定Pro 含量［17］。參照徐志文［18］的方法計算離體葉片失水率。

采用Trizol 法提取煙草樣品RNA，再使用試劑盒（M-MLV Reverse Transcriptase，美國Invitrogen 公司）合成cDNA 第一鏈。煙草抗旱相關(guān)基因的引物序列見表1，RT-PCR 反應體系和程序均參照孟盈等［9］的方法，最后采用2-ΔΔCT法計算基因表達量。

表1 相關(guān)基因的引物序列Tab.1 Sequences of primers for related genes

1.4 數(shù)據(jù)處理

通過EXCEL 和SigmaPlot 10.0 軟件進行數(shù)據(jù)整理，用SPSS 20.0 軟件采用單因素方差分析（One-way ANOVA）法進行數(shù)據(jù)處理、最小顯著差數(shù)（LSD）法進行數(shù)據(jù)間差異的顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度PEG-6000 處理對轉(zhuǎn)基因株系形態(tài)的影響

從圖1 可以看出，隨著PEG-6000 濃度的增加和處理時間的延長，煙苗受干旱脅迫的程度越來越大。在PEG-6000 處理3 h 時，10%和15%PEG-6000處理的oe 株系葉片均開始出現(xiàn)萎蔫，而此時ko 和K326 株系葉片并未出現(xiàn)明顯變化。PEG-6000 處理6 h 時，10%和15%PEG-6000 處理的oe 株系葉片萎蔫程度進一步加重，K326 株系葉片也開始出現(xiàn)萎蔫，而ko 株系葉片狀態(tài)依然良好。在PEG-6000處理9 h 時，5%PEG-6000 處理的oe 和K326 株系葉片均開始出現(xiàn)萎蔫，ko 葉片無明顯變化，此時10%和15%PEG-6000 處理oe 株系葉片呈現(xiàn)重度萎蔫的枯死狀態(tài)，K326 株系葉片也表現(xiàn)出嚴重的失水情況，而ko 株系失水程度則較輕，其萎蔫程度低于K326。這表明oe 株系的抗旱能力低于K326，而ko株系對干旱的抗性最強。

圖1 不同濃度PEG-6000 處理oe、ko 和K326 株系的煙苗形態(tài)比較Fig.1 Morphological comparison among oe，ko and K326 treated with PEG-6000 of different concentrations

2.2 不同濃度PEG-6000 處理對轉(zhuǎn)基因株系氣孔開度的影響

從圖2 可以看出，各株系葉片的氣孔開度隨著PEG-6000 濃度的遞增呈現(xiàn)降低趨勢。在不同濃度PEG-6000 脅迫下，oe、ko 和K326 株系表現(xiàn)不同，氣孔開度也存在差異。正常生長條件下各株系的氣孔開度大小一致，隨著PEG-6000 處理濃度的升高，oe 株系的氣孔開度高于K326，而ko 株系的氣孔開度始終低于K326。10% PEG-6000 處理的ko 株系氣孔開度為0.29，顯著低于K326，15%PEG-6000 處理的ko 株系氣孔開度也顯著低于K326。這表明ko 株系能夠通過降低氣孔開度來抵御干旱脅迫。

圖2 不同濃度PEG-6000 處理9 h 時oe、ko 和K326 株系的氣孔開度比較Fig.2 Comparison of stomatal aperture among oe，ko and K326 after treatment with PEG-6000 of different concentrations

2.3 干旱脅迫對轉(zhuǎn)基因株系生長狀況的影響

圖3 結(jié)果表明，干旱脅迫7 d 后（圖3B），oe、ko和K326 株系煙苗表現(xiàn)出明顯的形態(tài)差異。ko 株系煙苗生長勢良好，只有底部老葉片萎蔫，上部葉片仍保持挺立，萎蔫程度較輕。而oe 和K326 株系的葉片嚴重卷曲變黃，其中oe 株系萎蔫程度最大，整株呈現(xiàn)嚴重的缺水癥狀。復水后（圖3C），ko 株系煙苗能快速恢復正常生長，葉片挺直，而oe 和K326 株系煙苗仍呈萎蔫狀態(tài)。 這與PEG-6000 處理的試驗結(jié)果一致。表明ko 株系的耐旱能力高于K326，而oe 株系的耐旱能力較差。

生物量測定結(jié)果（圖3D）表明，正常生長條件下oe、ko 和K326 株系的煙苗生物量無明顯差異。干旱脅迫處理7 d 后，各株系的煙苗生物量均低于正常供水，其中ko 株系的煙苗生物量是K326 的1.43 倍，顯著高于K326，說明在干旱脅迫條件下ko 株系煙苗生長發(fā)育狀況明顯優(yōu)于K326。

干旱脅迫各株系葉綠素含量變化見圖3E。干旱脅迫處理7 d 后，各株系葉綠素含量均降低，其中ko 株系葉綠素含量顯著高于K326，為K326 的1.27 倍。表明ko 株系能維持較高的葉綠素含量以降低干旱脅迫對光合作用的影響。

圖3 干旱脅迫處理oe、ko 和K326 株系的生長情況比較Fig.3 Comparison of growing situation among oe，ko and K326 under drought stress

2.4 干旱脅迫對轉(zhuǎn)基因株系死細胞和活性氧的影響

對干旱處理后oe、ko 和K326 株系的葉片進行Trypan Blue 染色，見圖4。從圖中可以看出，oe 株系的染色顏色深于K326，而ko 株系的染色顏色較淺，說明ko 株系細胞受損傷的程度最輕，其死細胞含量最少，而oe 株系細胞受損傷的程度較重，產(chǎn)生的死細胞數(shù)量最多。干旱脅迫還能誘導植株產(chǎn)生大量的活性氧（ROS），可引起不同程度的氧化損傷。干旱處理后對oe、ko 和K326 株系的葉片進行NBT 染色，見圖4。從圖中看出，oe 株系染色程度比K326 更深，而ko 株系的染色顏色比K326淺，這說明oe 株系在干旱脅迫下產(chǎn)生大量的ROS，而ko 株系產(chǎn)生的ROS 較少，氧化損傷程度較低，因此表現(xiàn)出較強的抗旱性。

圖4 干旱脅迫處理7 d oe、ko 和K326 株系的Trypan Blue 和NBT 染色比較Fig.4 Comparison of staining among oe，ko and K326 under drought stress by trypan blue and NBT

2.5 干旱脅迫對轉(zhuǎn)基因株系抗氧化酶活性的影響

由圖5 可知，正常生長條件下各株系的SOD和POD 活性基本一致。干旱脅迫處理后各株系SOD 和POD 抗氧化酶活性均升高，其中oe 株系SOD 和POD 活 性 均 顯 著 低 于K326，而ko 株 系SOD 活 性 是K326 的1.12 倍，POD 活 性 是K326 的1.33 倍。這表明ko 株系能夠通過提高酶促防御能力而響應干旱脅迫。

圖5 干旱脅迫處理oe、ko 和K326 株系的SOD 與POD 活性比較Fig.5 Comparison of SOD and POD activities among oe，ko and K326 under drought stress

2.6 干旱脅迫對轉(zhuǎn)基因株系MDA 與Pro 含量的影響

由圖6 可見，正常生長時各株系的MDA 和Pro含量無明顯差異。干旱處理后各株系MDA 和Pro含量均有所增加，其中oe 株系MDA 含量是K326的1.28 倍，而ko 株系MDA 含量極顯著低于K326，說明ko 株系膜質(zhì)受損程度輕于K326。此外，oe 株系中Pro 含量極顯著低于K326，而ko 株系Pro 含量較高，是K326 的1.29 倍，表明ko 株系葉片細胞能維持較好的細胞滲透平衡。

2.7 干旱脅迫對轉(zhuǎn)基因株系離體葉片失水率的影響

oe、ko 和K326 株系的離體葉片失水率計算結(jié)果（圖7）表明，隨干旱時間的增加，煙草幼苗葉片失水率不斷增大。干旱2 h 時，oe 株系失水率為21.81%，顯著高于K326。在干旱處理6～24 h 期間，oe 株系失水率變化幅度最大，其中干旱處理24 h 時的失水率達47.26%，是K326 的1.21 倍。而ko 株系的失水率始終低于K326，干旱處理2～24 h 期間，ko 株系失水率處于較平緩狀態(tài)，其中干旱處理24 h 時失水率為25.32%，極顯著低于K326，表明ko 株系離體葉片的保水能力較強，而oe 株系離體葉片的保水能力較差。

2.8 干旱脅迫對相關(guān)基因表達量的影響

oe、ko 和K326 株系中抗旱相關(guān)基因NtPR1a、NtDREB2C和NtNCED5表達量見圖8。干旱脅迫7 d 時NtPR1a、NtDREB2C和NtNCED5基因表達量均升高，其中，oe 株系的3 個基因表達量均顯著低于K326，而ko 株系中NtPR1a、NtDREB2C和NtNCED5基因表達量均極顯著高于K326，分別提高4.59、1.43 和1.30 倍。這表明NtCycB2基因敲除后的煙草株系能夠通過提高抗旱相關(guān)基因的表達量而響應干旱脅迫。

圖6 干旱脅迫處理oe、ko 和K326 株系MDA 與Pro 含量比較Fig.6 Comparison of MDA and Pro contents among oe，ko and K326 under drought stress

圖7 oe、ko 和K326 株系離體葉片的失水率變化Fig.7 Dehydration rate of detached leaves of oe，ko and K326

圖8 干旱脅迫處理oe、ko 和K326 株系抗旱相關(guān)基因表達模式分析Fig.8 Expression patterns of drought-resistant genes in oe，ko and K326 under drought stress

3 討論

干旱對植物造成傷害的主要方式為滲透脅迫和氧化損傷［19］。使用PEG-6000 處理可造成滲透脅迫，降低水勢而導致植物缺水［20］。在本研究中，利用不同濃度的PEG-6000 處理轉(zhuǎn)基因株系（oe 和ko），與K326 相比，隨著PEG-6000 濃度的增加和脅迫時間的延長，各株系表現(xiàn)出不同程度的萎蔫狀況，其中，多腺毛ko 株系生長狀況較好，抗旱性較強，其氣孔開度明顯低于K326，這與姚靜遠等［21］和李波等［22］的研究結(jié)果相似，即較高的腺毛密度和較小的氣孔開度可促進植物更好地適應干旱環(huán)境。ko 株系的生物量和葉綠素含量在干旱脅迫下都能保持較高水平，這與Jimenez 等［23］和霍勇錦等［24］的研究結(jié)果一致，即抗旱性較強的品種能夠維持較高的生物量和葉綠素含量。

另外，干旱脅迫下植物細胞內(nèi)ROS 產(chǎn)生與清除之間的平衡受到破壞，ROS 大量產(chǎn)生與積累會誘導氧化應激反應，也可導致細胞死亡［25-27］。本研究中使用Trypan Blue 和NBT 染色分別對死細胞和活性氧進行定性觀察，發(fā)現(xiàn)ko 株系的染色顏色均較淺。有研究表明多種抗氧化酶等物質(zhì)含量可反映出干旱脅迫后細胞脂質(zhì)氧化程度，其中，MDA 作為一種脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，其含量高低代表著膜受損程度［28］，而Pro 作為一種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，也對細胞的滲透調(diào)節(jié)起著關(guān)鍵作用［29］。本研究中發(fā)現(xiàn)，ko 株系中死細胞數(shù)量較少且活性氧積累水平較低，其抗氧化酶活性和Pro 含量較高，而MDA含量較低，表明ko 株系具有較強的ROS 清除能力和產(chǎn)生抗性小分子物質(zhì)等維持細胞滲透平衡，這與丁丹陽等［30］的研究結(jié)果一致，即抗旱性較強的品種氧化損傷相對較小。此外，植物表皮毛對葉面蒸騰作用具有一定調(diào)節(jié)作用，并改變?nèi)~片的含水率［22］。本研究中發(fā)現(xiàn)，ko 株系離體葉片的失水速率較為平緩，失水率低于K326，這與宋海慧［5］的研究結(jié)果一致，證實了高密度腺毛葉片具有較強的保水能力。

本研究中對相關(guān)抗旱基因的表達分析發(fā)現(xiàn)，NtPR1a轉(zhuǎn)錄會誘導其他抗性相關(guān)基因大量表達，從而有利于提高煙草的抗性［31］。DREB 類轉(zhuǎn)錄因子與DRE 順式作用元件相結(jié)合，能夠調(diào)節(jié)抗旱相關(guān)功能基因的表達，使植株的抗旱能力顯著提高［32］。NCED通常作為脫落酸（ABA）生物合成的重要指標［33］，能夠參與植物響應多種非生物脅迫的應答反應。RT-PCR 結(jié)果表明，NtCycB2敲除后均能顯著提高NtPR1a、NtDREB2C和NtNCED5的表達量，與李涵哲等［34］的研究結(jié)果相似，這表明NtCycB2可通過負調(diào)控相關(guān)抗性基因的表達來提高煙株抗旱性。本研究中僅在幼苗期進行試驗，而其整個生育期的實際抗旱性能仍需要進一步驗證。此外，對于NtCycB2敲除株系的其他抗性以及性狀表現(xiàn)是否優(yōu)良尚不清楚，還有待進一步研究。

4 結(jié)論

NtCycB2具有負調(diào)控煙草抗旱性的生物學功能。NtCycB2敲除后的多腺毛株系ko 的抗旱性增強，ko 株系能較好地維持生長狀態(tài)，其生物量和葉綠素含量均較高，相關(guān)抗氧化酶活性較強，且該株系在受到干旱脅迫后能顯著降低氣孔開度，多個抗性相關(guān)基因的表達量也顯著提高。因此NtCycB2可通過影響煙草株系的一系列生理生化反應及相關(guān)基因表達來提高煙草的抗旱能力。