王 燕，周化嵐，梁營(yíng)芳，王 鋒，施沁怡

(上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093)

妥布霉素是一種氨基糖苷類抗生素，主要用于治療人和獸的細(xì)菌感染，妥布霉素過(guò)量使用會(huì)對(duì)人體造成嚴(yán)重的不可逆副作用，如腎毒性、神經(jīng)肌肉阻滯和超敏反應(yīng)等[1]。由于妥布霉素價(jià)格較低，目前其已經(jīng)被廣泛用于畜牧業(yè)，這極大導(dǎo)致了牛奶、雞蛋和肉類等動(dòng)物源性食品中可能的潛在抗生素殘留。食品中抗生素殘留量測(cè)定主要依靠?jī)x器分析法，如薄層色譜法、氣相色譜法、離子色譜法和高效液相色譜法以及色譜-質(zhì)譜法等[2]，然而這些方法存在樣品前處理復(fù)雜、耗時(shí)、需要訓(xùn)練有素的技術(shù)人員等缺點(diǎn)，難以實(shí)現(xiàn)快速、簡(jiǎn)捷、高通量及現(xiàn)場(chǎng)測(cè)定，靠實(shí)驗(yàn)室測(cè)定方法很難及時(shí)、快速而全面地從源頭監(jiān)控食品安全狀況[3]。

適體主要是寡核苷酸，即單鏈脫氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)，其具有合成簡(jiǎn)單、標(biāo)記容易、穩(wěn)定性好、適用性廣等優(yōu)點(diǎn)[4]。由于寡核苷酸與目標(biāo)分子的高度親和力和特異性，其被廣泛用于分子識(shí)別，成為食品分析、疾病診斷、新藥篩選等領(lǐng)域非常有前途的識(shí)別探針[5-6]。

金納米粒子(Au NPs)由于具有較好的穩(wěn)定性、良好的生物相容性和獨(dú)特的光學(xué)性質(zhì)，在免疫分析、生物學(xué)標(biāo)記及測(cè)定技術(shù)中得到了廣泛的應(yīng)用[7]，目前以金納米粒子為載體的測(cè)定平臺(tái)主要有光度法、熒光法、光譜法和電化學(xué)法[8]。

本工作以適體修飾的Au NPs為測(cè)定手段，開(kāi)發(fā)一種簡(jiǎn)單、快速的測(cè)定妥布霉素的比色傳感器，希望為相關(guān)部門提供一種便捷的抗生素現(xiàn)場(chǎng)測(cè)定工具，以提高食品安全水平。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

UV-1200 型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)；TU-1901型雙光束紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)；81-2型恒溫磁力攪拌器；XW-80A 型微型渦旋混合器；Sigmal-14型高速離心機(jī)；Spinplus-6 型低速離心機(jī)；PHS-3C 型p H 計(jì)；JEOL JEM-2100F型透射電子顯微鏡。

妥布霉素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:0.1 mmol·L－1，以水為溶劑。

妥布霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液:1 000 nmol·L－1，移取適量的0.1 mmol·L－1妥布霉素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液用水稀釋而成，使用時(shí)用水稀釋至所需濃度。

適體Hp:AAAAAAGACTAGGCACTAGTCAAAAAACCCCGATCCTAGT CTTTCCC[9]。

鹽酸、硝酸、氯金酸、檸檬酸鈉、氯化鈉、三氯乙酸、妥布霉素、鏈霉素、四環(huán)素、氟苯尼考均為分析純；牛血清白蛋白為分子生物級(jí)；試驗(yàn)用水為純水。

1.2 測(cè)定妥布霉素的原理

Au NPs比色傳感器主要依賴于納米粒子間距離相關(guān)的表面等離子體共振，Au NPs在溶液中的不同狀態(tài)將表現(xiàn)出不同的顏色[10]。溶液中分散良好的Au NPs在波長(zhǎng)約520 nm 處具有最大吸收，呈紅色；當(dāng)Au NPs聚集時(shí)，表面等離子體帶從可見(jiàn)區(qū)域向近紅外區(qū)域移動(dòng)，溶液顏色由紅色變?yōu)樗{(lán)色。比色傳感器測(cè)定妥布霉素(TOB)的原理圖見(jiàn)圖1。

圖1 比色傳感器測(cè)定妥布霉素的原理圖Fig.1 Schematic diagram of TOB determination by colorimetric sensor

無(wú)規(guī)則卷曲的單鏈DNA 適體可以通過(guò)堿基的氮或氧與Au NPs之間的電荷吸引力、范德華力以及疏水相互作用吸附在Au NPs表面[11]。DNA 和Au NPs之間的靜電排斥增強(qiáng)了Au NPs抗鹽誘導(dǎo)聚集的穩(wěn)定性，使得溶液在一定含量的鹽中保持紅色。因此，試驗(yàn)采用一種基于單鏈DNA 適體修飾的Au NPs測(cè)定妥布霉素。在沒(méi)有妥布霉素的情況下，適體吸附在Au NPs表面，在適當(dāng)含量的鹽中保持Au NPs在溶液中均勻分布；而在妥布霉素的存在下，由于妥布霉素和適體之間的高度親和性，妥布霉素與適體結(jié)合，適體的構(gòu)象從卷曲結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)檎郫B剛性結(jié)構(gòu)并從Au NPs表面脫離，使得Au NPs表面裸露在高鹽環(huán)境中從而發(fā)生聚集，并導(dǎo)致溶液發(fā)生從紅色到藍(lán)紫色的顏色變化。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 Au NPs的制備

將玻璃器皿用鹽酸與硝酸以體積比3∶1組成的混合液浸泡24 h，再用水浸泡1 h后，洗滌烘干。采用Frens法通過(guò)檸檬酸鈉還原氯金酸反應(yīng)制備直徑約為13 nm 的Au NPs[12]。移取100 mL 的1 mmol·L－1氯金酸溶液，在劇烈攪拌下加熱回流，沸騰后迅速加入10 mL的38.8 mmol·L－1檸檬酸鈉溶液，在5 min內(nèi)混合液顏色從淡黃色變?yōu)楹谏?，最后變?yōu)榫萍t色，繼續(xù)回流15 min后，在攪拌下緩慢冷卻至室溫，即得到Au NPs溶液，于4 ℃保存。

1.3.2 Au NPs的表征

利用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)量Au NPs溶液的吸收光譜。將1 mL 制得的Au NPs溶液稀釋3倍后置于光程為1 cm 的比色皿中進(jìn)行紫外吸收掃描，根據(jù)朗伯-比爾定律，即公式(1)計(jì)算Au NPs 的濃度:

式中:A為吸光度；ε為摩爾吸光系數(shù)，L·mol－1·cm－1；b為光程，1 cm；c為Au NPs的濃度，mol·L－1。直徑約為13 nm 的Au NPs在波長(zhǎng)520 nm 處的ε為2.7×108L·mol－1·cm－1[13]。

將Au NPs溶液均勻分散在覆有碳膜的銅網(wǎng)上，自然干燥后利用透射電子顯微鏡觀察Au NPs的微觀形貌，加速電壓為200 k V，選取代表性部位進(jìn)行拍照分析。

1.3.3 妥布霉素的測(cè)定

在0.5 mL 的Au NPs溶液中加入0.25 mL 的1.5μmol·L－1適體Hp溶液，混合振蕩30 s，室溫孵育15 min后，調(diào)節(jié)p H 為7。加入0.25 mL 已去除蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的牛奶樣品溶液或妥布霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，混合振蕩30 s，室溫孵育15 min，加入0.1 mL的1.5 mol·L－1氯化鈉溶液并用水稀釋至2.5 mL。平衡5 min后使用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)在室溫下測(cè)量上述溶液在波長(zhǎng)520，620 nm 處的吸光度，分別記為A520，A620，計(jì)算A620/A520。

2 結(jié)果與討論

2.1 金納米粒子的表征

Au NPs溶液的紫外-可見(jiàn)光譜可以反映其分散程度，與不同物質(zhì)(氯化鈉、適體Hp、TOB)混合的Au NPs溶液的吸收光譜見(jiàn)圖2。

由圖2 可知:分散的Au NPs 溶液在波長(zhǎng)520 nm 處具有強(qiáng)吸光度(曲線1，曲線2)；聚集的Au NPs溶液在波長(zhǎng)520 nm 處的吸光度顯著降低(曲線3，曲線4)，在波長(zhǎng)620 nm 處出現(xiàn)一個(gè)新的寬峰。因此，試驗(yàn)以A620/A520作為Au NPs分散狀態(tài)的表征指標(biāo)，A620/A520隨Au NPs 聚集的增強(qiáng)而增大。

圖2 與不同物質(zhì)混合的Au NPs溶液的吸收光譜Fig.2 Absorption spectra of Au NPs solutions mixed with different substances

利用透射電子顯微鏡對(duì)Au NPs的聚集進(jìn)行了表征，與不同物質(zhì)(氯化鈉、適體Hp、TOB)混合的Au NPs溶液的透射電子顯微鏡圖像見(jiàn)圖3。

圖3 與不同物質(zhì)混合的Au NPs溶液的透射電子顯微鏡圖像Fig.3 Transmission electron microscope images of Au NPs solutions mixed with different substances

由圖3 可知:均勻分散的Au NPs具有光滑的球形形貌(a)；氯化鈉的加入使Au NPs完全聚集，Au NPs的形狀發(fā)生明顯變化(b)；在Au NPs溶液中加入適體Hp后，Au NPs表面被DNA 包覆，可以有效防止鹽誘導(dǎo)的聚集，因此在這種情況下，Au NPs隨著氯化鈉的加入而略微聚集(c)；妥布霉素的加入使得吸附的適體Hp 從Au NPs 分離，并導(dǎo)致Au NPs在氯化鈉存在下發(fā)生聚集(d)。

2.2 適體比色傳感器影響因素的選擇

2.2.1 適體孵育時(shí)間和妥布霉素孵育時(shí)間

在適體比色傳感器中，孵育時(shí)間是影響其效果的最重要因素之一。適體Hp孵育時(shí)間對(duì)反應(yīng)體系A(chǔ)620/A520的影響見(jiàn)圖4；妥布霉素孵育時(shí)間對(duì)反應(yīng)體系A(chǔ)620/A520的影響見(jiàn)圖5。

圖4 適體Hp孵育時(shí)間對(duì)反應(yīng)體系A(chǔ)620/A520的影響Fig.4 Effect of incubation time of aptamer Hp on A620/A520of the reaction system

圖5 妥布霉素孵育時(shí)間對(duì)反應(yīng)體系A(chǔ)620/A520的影響Fig.5 Effect of incubation time of TOB on A620/A520of the reaction system

由圖4 可知:隨著適體Hp 孵育時(shí)間的延長(zhǎng)，A620/A520明顯降低；當(dāng)適體Hp 孵育時(shí)間大于15 min時(shí)，A620/A520趨于平穩(wěn)。由圖5 可知:隨著妥布霉素孵育時(shí)間的延長(zhǎng)，A620/A520明顯增加；當(dāng)妥布霉素孵育時(shí)間大于15 min時(shí)，A620/A520趨于平穩(wěn)。試驗(yàn)選擇適體孵育時(shí)間和妥布霉素孵育時(shí)間均為15 min。

2.2.2 反應(yīng)體系的酸度

根據(jù)文獻(xiàn)[14]報(bào)道，反應(yīng)體系的酸度可能影響DNA 的吸附。試驗(yàn)考察了反應(yīng)體系的酸度(p H 依次為6，7，8)對(duì)A620/A520的影響，結(jié)果見(jiàn)圖6。

由圖6可知:p H 依次為6，7，8時(shí)，A620/A520與妥布霉素的濃度均呈線性關(guān)系；當(dāng)p H 為7 時(shí)，A620/A520隨妥布霉素濃度變化最顯著。試驗(yàn)選擇反應(yīng)體系的p H 為7。

圖6 反應(yīng)體系酸度對(duì)A620/A520的影響Fig.6 Effect of acidity of the reaction system on A620/A520

2.2.3 適體濃度和妥布霉素濃度

按試驗(yàn)方法考察了適體Hp 的濃度(0，0.25，0.50，1.0，1.5，2.0μmol·L－1)和氯化鈉濃度(0，0.50，1.0，1.5，2.0，2.5 mol·L－1)對(duì)反應(yīng)體系A(chǔ)620/A520的影響，結(jié)果見(jiàn)圖7。

圖7 適體Hp的濃度和氯化鈉濃度對(duì)反應(yīng)體系A(chǔ)620/A520的影響Fig.7 Effect of concentrations of aptamer Hp and sodium chloride on A620/A520of the reaction system

由圖7可知:當(dāng)適體Hp濃度大于1.0μmol·L－1時(shí)，適體Hp 可有效阻止鹽誘導(dǎo)的聚集；在0.50 mol·L－1氯化鈉溶液中，適體Hp 修飾的Au NPs幾乎都不聚集；在2.5 mol·L－1氯化鈉溶液中，適體Hp不能有效阻止鹽誘導(dǎo)的聚集?；诠?jié)省試劑的原則，試驗(yàn)選擇適體 Hp 的濃度為1.5μmol·L－1，氯化鈉的濃度為1.5 mol·L－1。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

按試驗(yàn)方法對(duì)妥布霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液系列進(jìn)行測(cè)定，以妥布霉素的濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的A620/A520為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明:妥布霉素的濃度在40.0～175 nmol·L－1內(nèi)與其對(duì)應(yīng)的A620/A520呈線性關(guān)系，線性回歸方程為y＝9.000×10－4x＋3.579×10－1，相關(guān)系數(shù)為0.995 9。

根據(jù)3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差除以標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率計(jì)算方法的檢出限(3s/k)，結(jié)果為13.3 nmol·L－1。所研制的適體比色傳感器可用于牛奶中妥布霉素的靈敏測(cè)定。

2.4 適體比色傳感器對(duì)妥布霉素測(cè)定的選擇性

將500 nmol·L－1的鏈霉素(STR)、四環(huán)素(TET)、氟苯尼考(FF)等抗生素，以及500 nmol·L－1的甘氨酸(Gly)、精氨酸(Arg)、牛血清白蛋白(BSA)按試驗(yàn)方法引入適體Hp修飾的Au NPs溶液中，并與500 nmol·L－1妥布霉素進(jìn)行比較，考察了該適體比色傳感器的選擇性。結(jié)果表明:除STR外，A620/A520沒(méi)有明顯變化；STR 和妥布霉素同屬于氨基糖苷類抗生素，結(jié)構(gòu)有部分相似，因此適體比色傳感器對(duì)STR 略有響應(yīng)。

2.5 樣品分析

為了評(píng)價(jià)適體比色傳感器的應(yīng)用價(jià)值，采用適體修飾的Au NPs作為探針，對(duì)牛奶樣品進(jìn)行分析。根據(jù)文獻(xiàn)[15]中方法對(duì)牛奶樣品進(jìn)行前處理以去除蛋白質(zhì)和脂質(zhì)，即在牛奶樣品中加入20 g·L－1三氯乙酸溶液，超聲30 min，再以4 500 r·min－1轉(zhuǎn)速離心30 min，上清液使用0.22μm 的聚偏二氟乙烯膜過(guò)濾，濾液于4 ℃保存。制得的樣品溶液稀釋100倍后制備成妥布霉素加標(biāo)樣品，按試驗(yàn)方法對(duì)空白牛奶加標(biāo)樣品進(jìn)行分析，計(jì)算回收率和測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 樣品分析結(jié)果(n＝6)Tab.1 Analytical results of the samples(n＝6)

由表1可知:回收率為96.4%～108%，RSD 為1.8%～3.0%。

本工作建立了一種基于核酸適體修飾的Au NPs快速測(cè)定妥布霉素的分光光度法。在沒(méi)有目標(biāo)物妥布霉素的情況下，DNA 適體包覆在Au NPs表面，有效地防止鹽誘導(dǎo)的聚集；而在妥布霉素存在的情況下，適體與妥布霉素結(jié)合并從Au NPs表面脫離，導(dǎo)致Au NPs在適當(dāng)含量的鹽中發(fā)生聚集，反應(yīng)體系顏色由紅色變?yōu)樗{(lán)紫色。該核酸適體比色傳感器操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、選擇性好，能成功地應(yīng)用于牛奶中妥布霉素的測(cè)定。