王晨儒，安 然，2??，梁興國(guó)，2

(1．中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003； 2．青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室 海洋藥物與生物制品功能實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266237)

滾環(huán)擴(kuò)增(Rolling circle amplification，RCA)是指以環(huán)狀DNA為擴(kuò)增模板，在具有鏈置換活性的DNA聚合酶作用下，擴(kuò)增產(chǎn)生具有重復(fù)序列長(zhǎng)鏈DNA的一種等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)[1-2]。RCA具有等溫反應(yīng)、擴(kuò)增效率高、可進(jìn)行原位擴(kuò)增和易與其他技術(shù)聯(lián)合等優(yōu)勢(shì)，適合應(yīng)用于微生物的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和高通量初篩[3-4]。近年來(lái)，隨著RCA技術(shù)的快速發(fā)展，研究者們已開(kāi)發(fā)了針對(duì)miRNA[5-6]、病原菌[7-8]、蛋白質(zhì)[9-10]、毒素[11]甚至重金屬[12-13]等多種物質(zhì)的RCA檢測(cè)技術(shù)。此外，RCA還被用于DNA納米結(jié)構(gòu)的構(gòu)建、藥物載體的制備[14-16]和生化分析等領(lǐng)域[17-19]。

為使RCA可檢測(cè)線(xiàn)性DNA靶標(biāo)，大多RCA技術(shù)通過(guò)鎖式探針將線(xiàn)性靶標(biāo)轉(zhuǎn)化為環(huán)狀模板。鎖式探針兩端分別與靶標(biāo)片段互補(bǔ)配對(duì)，并在靶標(biāo)的輔助下環(huán)化，然后DNA聚合酶以環(huán)化的鎖式探針為模板進(jìn)行擴(kuò)增[3,8]。然而，這種方法的實(shí)質(zhì)是對(duì)人為加入的鎖式探針進(jìn)行擴(kuò)增，并非真正擴(kuò)增靶標(biāo)片段，因此存在特異性較差、假陽(yáng)性率高等問(wèn)題。針對(duì)此問(wèn)題，Wang等[18,20]建立了一種將靶標(biāo)環(huán)化的新型RCA技術(shù)，稱(chēng)為靶標(biāo)自環(huán)化滾環(huán)擴(kuò)增(Target-circularization RCA，TC-RCA)。具體原理是通過(guò)IIS型限制性?xún)?nèi)切酶(產(chǎn)生隨機(jī)黏性末端)切割目標(biāo)基因，產(chǎn)生兩端具有不同黏性末端的靶標(biāo)片段；再利用可與靶標(biāo)黏性末端互補(bǔ)配對(duì)的特異性接頭(兩條部分互補(bǔ)的單鏈DNA雜交形成的帶有黏性末端的接頭)捕獲靶標(biāo)片段，并在連接酶的作用下使靶標(biāo)環(huán)化為帶有缺口(Gap)的雙鏈環(huán)狀DNA；最后以此缺口的3’端為引物進(jìn)行RCA(見(jiàn)圖1a)。TC-RCA是直接對(duì)靶標(biāo)片段的擴(kuò)增，特異性得到顯著提高，并可用于全基因組擴(kuò)增、基因測(cè)序等領(lǐng)域。

然而，TC-RCA在均相體系中的檢測(cè)靈敏度僅為6×106copies/μL，難以進(jìn)一步提高。分析原因如下：為使接頭在大量背景基因中快速捕獲微量靶標(biāo)，通常接頭的加入量是靶標(biāo)的102～109倍[18]；因此，過(guò)量的雙鏈接頭極易同時(shí)雜交于靶標(biāo)兩端，導(dǎo)致大部分靶標(biāo)片段無(wú)法環(huán)化為環(huán)狀模板，大大降低了RCA效率(見(jiàn)圖1b)。

為確定TC-RCA靈敏度低的原因并提高檢測(cè)效率，本研究構(gòu)建了一種帶有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)接頭(18 nt)，使接頭的兩端產(chǎn)生連接活性差異，通過(guò)發(fā)卡接頭打開(kāi)與閉合的動(dòng)態(tài)平衡抑制靶標(biāo)兩端雙鏈接頭的同時(shí)連接。通過(guò)研究發(fā)卡動(dòng)態(tài)接頭的環(huán)化效率以及發(fā)卡的穩(wěn)定性和磷酸化對(duì)連接的影響，揭示了TC-RCA靈敏度低的根本原因。在此基礎(chǔ)上，本研究采用了一種10 nt的短鏈動(dòng)態(tài)接頭進(jìn)一步提高了環(huán)化效率，實(shí)現(xiàn)TC-RCA靶標(biāo)的高靈敏度環(huán)化。新型動(dòng)態(tài)接頭的構(gòu)建為T(mén)C-RCA中接頭的設(shè)計(jì)提供了新思路，可大大提高TC-RCA的檢測(cè)靈敏度；同時(shí)可為雙鏈DNA環(huán)化機(jī)理研究提供重要參考。

(a：靶標(biāo)自環(huán)化RCA(TC-RCA)技術(shù)；b：兩接頭同時(shí)連接于靶標(biāo)兩側(cè)，導(dǎo)致靶標(biāo)無(wú)法環(huán)化，繼而無(wú)法進(jìn)行RCA。a: the principle of target-circularization RCA (TC-RCA). b: the problem that two adaptors are connected, resulting in the failure of cyclization as well as RCA.)

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 試劑與材料

DNA序列由金唯智(蘇州)合成(見(jiàn)表1)。TaqDNA連接酶、TspRI限制性?xún)?nèi)切酶及ATP購(gòu)自英國(guó)New England Biolabs(NEB)公司；Eva Green qPCR Mix(2×)購(gòu)自美國(guó)Biotium公司；T4 DNA ligase和瓊脂糖膠純化試劑盒等均購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 發(fā)卡動(dòng)態(tài)接頭連接線(xiàn)性靶標(biāo)(W或P)

1.2.1 發(fā)卡動(dòng)態(tài)接頭單側(cè)與靶標(biāo)連接 在含有0.1 μmol/L的線(xiàn)性靶標(biāo)W(或P)體系中添加其中一個(gè)發(fā)卡動(dòng)態(tài)接頭(Ha或Hb)0.1 μmol/L，8 UTaqDNA ligase，1×TaqDNA Buffer，總體積為10 μL。實(shí)驗(yàn)平行進(jìn)行2次以上。55 ℃溫育6 h。10%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)連接產(chǎn)物。

1.2.2 發(fā)卡動(dòng)態(tài)接頭雙側(cè)與靶標(biāo)連接 在含有線(xiàn)性靶標(biāo)W(0.2 μmol/L)和P(0.1 μmol/L)的體系中添加Ha(0.1 μmol/L)和Hb(0.2 μmol/L)發(fā)卡動(dòng)態(tài)接頭，8 UTaqDNA ligase，1×TaqDNA Buffer，總體積為10 μL。實(shí)驗(yàn)平行進(jìn)行2次以上。55 ℃溫育6 h。10%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)連接產(chǎn)物。

表1 寡核苷酸序列

1.3 發(fā)卡動(dòng)態(tài)接頭連接271 bp靶標(biāo)DNA

1.3.1 靶標(biāo)單側(cè)連接發(fā)卡接頭 在10 μL體系中，加入靶標(biāo)DNA(濃度可以為10 nmol/L～10 amol/L)，一對(duì)發(fā)卡動(dòng)態(tài)接頭(終濃度10 nmol/L)，8 UTaqDNA ligase，1×TaqDNA Buffer(10 mmol/L Tris-HCl，50 mmol/L KCl，1 mmol/L DTT，0.1 mmol/L EDTA，200 μg/mL BSA，50% Glycerol，pH=7.4, 25 ℃)。實(shí)驗(yàn)平行進(jìn)行3次。55 ℃溫育6 h。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)產(chǎn)物濃度。

1.3.2 靶標(biāo)雙側(cè)連接發(fā)卡接頭 在反應(yīng)體系中同時(shí)加入相同體積和濃度的兩對(duì)發(fā)卡接頭(H1a+H1b或H2a+H2b)，其余條件及操作與上述只有一對(duì)接頭單側(cè)連接相同。

1.4 短鏈動(dòng)態(tài)接頭環(huán)化558 bp靶標(biāo)

在含有558 bp靶標(biāo)DNA(10 nmol/L～10 amol/L)的10 μL反應(yīng)體系中添加一對(duì)短鏈接頭(10 nmol/L)，2.5 U T4 DNA ligase，1×T4 DNA Buffer。實(shí)驗(yàn)平行進(jìn)行3次。25 ℃溫育6 h。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)產(chǎn)物濃度。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析動(dòng)態(tài)接頭的連接產(chǎn)率

將1 μL連接產(chǎn)物加入含有0.4 μmol/L引物和1×Eva Green qPCR Mix的10 μL反應(yīng)體系中進(jìn)行熒光定量PCR。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，75 ℃ 1 min (30循環(huán))；75 ℃ 5 min終止延伸。

2 結(jié)果與討論

2.1 環(huán)化靶標(biāo)DNA的發(fā)卡動(dòng)態(tài)接頭設(shè)計(jì)

構(gòu)建的發(fā)卡動(dòng)態(tài)接頭如圖2a所示，雙鏈莖干區(qū)長(zhǎng)3 bp，帶有9 nt長(zhǎng)的3’端凸出末端。其特點(diǎn)是在溶液中處于打開(kāi)與閉合的動(dòng)態(tài)平衡：當(dāng)發(fā)卡形成時(shí)，可在連接酶作用下以黏性末端的方式連接到靶標(biāo)上，而且由于發(fā)卡結(jié)構(gòu)莖干區(qū)很短，其5’端不發(fā)生連接；當(dāng)發(fā)卡打開(kāi)為單鏈結(jié)構(gòu)時(shí)，也難以連接[21]。Yu等研究發(fā)現(xiàn)[21]，黏性末端的連接效率顯著高于同等長(zhǎng)度單鏈的連接。只有當(dāng)單鏈接頭分別連接到靶標(biāo)后，才能形成黏性末端(9 nt互補(bǔ))并完成環(huán)化。值得注意的是，未發(fā)生連接時(shí)，由于互補(bǔ)部分很短，在連接溫度下難以雜交，避免生成雙鏈接頭，造成兩端同時(shí)發(fā)生雙鏈連接。兩端單鏈連接后形成了9 nt的黏性末端，可在連接酶的輔助下雜交并連接。此外，環(huán)化是分子內(nèi)連接，連接效率大大高于形成二聚物的分子間連接。由于其中一個(gè)發(fā)卡接頭的5’端未進(jìn)行磷酸化，因此靶標(biāo)環(huán)化后形成一條鏈具有切口的雙鏈環(huán)狀DNA，聚合酶以此切口為引物進(jìn)行RCA反應(yīng)(見(jiàn)圖2b)。

為驗(yàn)證上述設(shè)計(jì)思路，即避免雙鏈接頭的形成與連接，本研究在Wang[18,20]等的研究結(jié)果基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)了發(fā)卡接頭用來(lái)環(huán)化TspRI酶切的靶標(biāo)[22]。為形成相對(duì)穩(wěn)定的發(fā)卡，將一個(gè)接頭的環(huán)部序列設(shè)計(jì)為5’-GAA-3’[24]，另一個(gè)發(fā)卡接頭的環(huán)部序列為5’-TTC-3’(見(jiàn)圖2a)。

(a：發(fā)卡接頭的設(shè)計(jì)原理；b：發(fā)卡接頭連接靶標(biāo)的原理。a: The design principle of hairpin adaptors. b: The principle of the target circulization with hairpin adaptors.)

2.2 發(fā)卡接頭連接效率比較

為了減少對(duì)發(fā)卡接頭連接效率評(píng)價(jià)的影響，設(shè)計(jì)了如圖3a所示的連接體系。將4條單鏈DNA通過(guò)互補(bǔ)雜交形成2條帶有3’凸出末端的雙鏈DNA(W和P)。其中W由Wa(79 nt)和Wb(55 nt，5’端磷酸化)構(gòu)成，含有55 bp雙鏈且兩端分別有15和9 nt單鏈凸出端；P由Pa(79 nt)和Pb(47 nt，5’端磷酸化)構(gòu)成，含有47 bp雙鏈且兩端分別有23和9 nt的單鏈部分。W與發(fā)卡接頭H1b互補(bǔ)(5’端未磷酸化)；P與H1a互補(bǔ)(5’端已磷酸化)。

圖3c為T(mén)aqDNA ligase在55 ℃下連接發(fā)卡接頭與W和P(0.1 μmol/L)的結(jié)果。W與H1b連接后形成“15 nt單鏈+64 bp雙鏈+9 nt單鏈”的結(jié)構(gòu)；P與發(fā)卡接頭H1a連接后將形成“23 nt單鏈+56 bp雙鏈+9 nt單鏈”的結(jié)構(gòu)(見(jiàn)圖3b)。結(jié)果表明，W與H1b(Lane 3)和P與H1a(Lane 4)連接后均可獲得濃度較高的單一條帶產(chǎn)物，說(shuō)明發(fā)卡結(jié)構(gòu)可分別與單側(cè)靶標(biāo)發(fā)生高效連接。然而，連接產(chǎn)物條帶與W和P原條帶位置極其接近，這可能是由于W與H1b、P與H1a連接后，發(fā)卡的5’端仍可回折形成雙鏈發(fā)卡結(jié)構(gòu)，而W和P模板的3’端則具有凸出的9 nt單鏈末端，較為舒展的單鏈DNA末端會(huì)減慢DNA在電泳凝膠中的遷移速率[25]。

(a：線(xiàn)性靶標(biāo)模板以及發(fā)卡接頭示意圖；b：線(xiàn)性靶標(biāo)與發(fā)卡接頭連接的三種連接產(chǎn)物；c：連接結(jié)果電泳圖。a: The scheme of linear targets and hairpin adaptors. b: Three kinds of ligation products of linear targets and hairpin adaptors. c: The ligation results.)

然后我們將W、P、H1a和H1b同時(shí)添加至連接體系中，以探索發(fā)卡接頭是否可在與W和P分別連接后進(jìn)行黏性末端的連接。若連接成功，將形成W+Hb+Ha+P(見(jiàn)圖3b(3))的雙鏈DNA結(jié)構(gòu)(15 nt單鏈+129 bp雙鏈+23 nt單鏈，且具有一個(gè)切口)。圖3c中Lane 5為W+Hb+Ha+P的連接結(jié)果，圖中可看出產(chǎn)生了較長(zhǎng)的雙鏈DNA產(chǎn)物且產(chǎn)物濃度較高，說(shuō)明發(fā)卡接頭可發(fā)生高效連接。同時(shí)，這一結(jié)果也進(jìn)一步說(shuō)明發(fā)卡接頭優(yōu)先與線(xiàn)性靶標(biāo)的一側(cè)發(fā)生連接，然后再完成接頭間的連接。同樣，與類(lèi)似長(zhǎng)度的Ladder相比，雙鏈DNA產(chǎn)物遷移率較慢的原因是雙鏈兩端的單鏈末端減慢了DNA在凝膠中的遷移速率。此外，連接中有少量副產(chǎn)物產(chǎn)生，可能是由于W濃度較高，少量H1b接頭也連接到了W上。為了便于評(píng)價(jià)連接效率，加入的W是P的2倍，因此有H1a與W連接后的產(chǎn)物剩余。

2.3 發(fā)卡動(dòng)態(tài)接頭的穩(wěn)定性對(duì)連接的影響

發(fā)卡結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性是影響發(fā)卡接頭與靶標(biāo)連接的關(guān)鍵因素。根據(jù)Wang等[23-24]的研究成果，環(huán)部序列為5’-GNA-3’的發(fā)卡結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性遠(yuǎn)高于其他序列。如環(huán)部序列為5’-GAA-3’的發(fā)卡的Tm比環(huán)部為5’-AAG-3’的發(fā)卡高10℃以上。因此，本部分重新設(shè)計(jì)了環(huán)部序列為5’-AAG-3’和5’-CTT-3’的一組發(fā)卡接頭H2a與H2b，與2.2中環(huán)部序列為5’-GAA-3’和5’-TTC-3’的發(fā)卡接頭H1a和H1b進(jìn)行對(duì)比。此外，為探究發(fā)卡接頭磷酸化對(duì)連接的影響，分別選用了5’端磷酸化的發(fā)卡接頭和5’端未磷酸化的發(fā)卡接頭進(jìn)行了對(duì)比。

當(dāng)進(jìn)行單側(cè)連接時(shí)，5’端磷酸化的發(fā)卡接頭與靶標(biāo)連接后可獲得較為單一的產(chǎn)物(見(jiàn)圖4，Lane 3、5、7和9)，說(shuō)明發(fā)卡接頭與靶標(biāo)發(fā)生了高效連接且接頭的穩(wěn)定性對(duì)連接效率影響較小。對(duì)于5’未磷酸化的發(fā)卡接頭，自身穩(wěn)定性較高的H1發(fā)卡接頭與靶標(biāo)的連接結(jié)果與磷酸化接頭的結(jié)果相似，可產(chǎn)生條帶位置相同的單一產(chǎn)物。然而，對(duì)于自身穩(wěn)定性較低的H2發(fā)卡接頭，其與靶標(biāo)連接后產(chǎn)生了一條遷移率較慢的連接產(chǎn)物。原因是未磷酸化的H2a和H2b發(fā)卡接頭穩(wěn)定性較低，在電泳過(guò)程中打開(kāi)形成單鏈，導(dǎo)致遷移率降低。當(dāng)進(jìn)行雙側(cè)連接時(shí)，發(fā)卡接頭的穩(wěn)定性以及是否含有磷酸基對(duì)連接效率影響較大。結(jié)果顯示，當(dāng)H2a磷酸化、H2b未磷酸化時(shí)，與靶標(biāo)連接后剩余底物最少(Lane 13)，說(shuō)明連接效率最高?？赡艿脑蚴欠€(wěn)定性較低的H2a和H2b更易打開(kāi)進(jìn)行互相連接；而對(duì)于熔點(diǎn)較高的H1a和H1b，較難打開(kāi)從而導(dǎo)致雙側(cè)連接的產(chǎn)率較低。

圖4 發(fā)卡接頭穩(wěn)定性及磷酸化對(duì)連接靶標(biāo)的影響

2.4 發(fā)卡動(dòng)態(tài)接頭連接靈敏度評(píng)價(jià)

本部分選取了高濃度靶標(biāo)下連接效率較高的H2a和H2b發(fā)卡接頭，精準(zhǔn)評(píng)價(jià)H2a和H2b發(fā)卡接頭對(duì)痕量靶標(biāo)的連接情況。采用熒光定量PCR法測(cè)定接頭與靶標(biāo)連接后的產(chǎn)物量，從而對(duì)發(fā)卡接頭的連接效率和環(huán)化靶標(biāo)的靈敏度進(jìn)行評(píng)價(jià)。具體原理是采用pUC18質(zhì)粒中的271 bp雙鏈DNA作為靶標(biāo)(末端具有9 nt凸出的黏性末端)，將靶標(biāo)稀釋至不同濃度后與發(fā)卡接頭連接，然后利用熒光定量PCR檢測(cè)連接產(chǎn)物，通過(guò)Ct值評(píng)價(jià)連接產(chǎn)物的含量。單側(cè)連接后進(jìn)行PCR時(shí)，位于發(fā)卡側(cè)的下游引物3’端與靶標(biāo)僅互補(bǔ)3 bp，剩余序列與發(fā)卡接頭序列相同(見(jiàn)圖5a)。因此，僅當(dāng)發(fā)卡接頭與靶標(biāo)成功連接后才可發(fā)生PCR擴(kuò)增。針對(duì)H2a單側(cè)連接產(chǎn)物的PCR引物為F-H2a和R-H2a，針對(duì)H2b單側(cè)連接產(chǎn)物的PCR引物為F-H2b和R-H2b(序列見(jiàn)表1)。當(dāng)雙側(cè)連接時(shí)，發(fā)卡接頭可將271 bp的靶標(biāo)連接為環(huán)狀雙鏈DNA，PCR的引物設(shè)計(jì)于發(fā)卡接頭兩側(cè)的靶標(biāo)區(qū)。若雙側(cè)連接成功，則可跨越接頭發(fā)生PCR擴(kuò)增；若雙側(cè)連接未成功，則擴(kuò)增區(qū)域不連續(xù)，無(wú)法發(fā)生PCR。雙側(cè)連接產(chǎn)物的PCR引物為F-271和R-271(見(jiàn)表1)。

圖5b中分別表示了不同濃度靶標(biāo)(103～109copies/μL)與H2a或H2b的單側(cè)連接結(jié)果及靶標(biāo)與H2a+H2b的雙側(cè)連接結(jié)果。結(jié)果顯示，發(fā)卡動(dòng)態(tài)接頭與靶標(biāo)連接后可成功擴(kuò)增，且空白組無(wú)Ct值(數(shù)據(jù)未列出)，說(shuō)明發(fā)卡接頭可以成功對(duì)痕量靶標(biāo)進(jìn)行單側(cè)連接和雙側(cè)連接。隨著靶標(biāo)濃度的降低，Ct值均逐漸升高，說(shuō)明連接產(chǎn)物量逐漸減少。單側(cè)連接時(shí)，靶標(biāo)濃度降低至105copies/μL以下Ct值不再變化，說(shuō)明發(fā)卡接頭單側(cè)連接的靈敏度達(dá)105copies/μL。雙側(cè)連接時(shí)，靶標(biāo)濃度低于106copies/μL時(shí)無(wú)法獲得Ct值，說(shuō)明發(fā)卡動(dòng)態(tài)接頭環(huán)化靶標(biāo)的靈敏度為106copies/μL。

上述結(jié)果證實(shí)，發(fā)卡動(dòng)態(tài)接頭可通過(guò)使靶標(biāo)兩端產(chǎn)生連接活性差異提高靶標(biāo)的環(huán)化靈敏度。而傳統(tǒng)雙鏈接頭連接靶標(biāo)兩黏性末端的活性基本一致，在黏性末端長(zhǎng)度為9 nt時(shí)，雙鏈接頭連接靶標(biāo)兩端難以形成一定的先后性。因此，傳統(tǒng)TC-RCA靈敏度低的原因極有可能是兩個(gè)雙鏈接頭同時(shí)占據(jù)靶標(biāo)兩端，且同種接頭間無(wú)法互補(bǔ)配對(duì)，繼而影響靶標(biāo)環(huán)化。

(a：?jiǎn)蝹?cè)連接產(chǎn)物的PCR擴(kuò)增方案；b：H2a、H2b與271 bp靶標(biāo)連接后的熒光定量PCR結(jié)果。a: The PCR scheme of one-side ligation products. b: The RT-PCR results of the ligation products of 271 bp target with H2a and H2b.)

2.5 短接頭環(huán)化558 bp靶標(biāo)DNA

為進(jìn)一步提高靶標(biāo)環(huán)化的靈敏度，本研究又設(shè)計(jì)了一種長(zhǎng)度為10 nt的短鏈動(dòng)態(tài)接頭，期望通過(guò)不穩(wěn)定短鏈接頭增加接頭對(duì)靶標(biāo)兩端的連接活性差異，實(shí)現(xiàn)靶標(biāo)的高靈敏度環(huán)化。短鏈接頭的設(shè)計(jì)為將互補(bǔ)區(qū)域縮短至5 bp，且兩端分別有5 nt的黏性末端。較短的互補(bǔ)區(qū)域使短鏈接頭的穩(wěn)定性降低，難以形成雙鏈接頭。又因接頭兩端的黏性末端GC含量不同，導(dǎo)致兩端連接活性具有差異，從而抑制靶標(biāo)兩端同時(shí)連接兩個(gè)雙鏈接頭。本部分設(shè)計(jì)的短鏈接頭互補(bǔ)區(qū)域的GC含量為100%，兩端黏性末端為HgaI限制性?xún)?nèi)切酶的酶切序列(見(jiàn)圖6a)，具體序列見(jiàn)表1。

短鏈動(dòng)態(tài)接頭連接的靶標(biāo)長(zhǎng)度為558 bp，序列也來(lái)自pUC18質(zhì)粒。使用T4 DNA liagse在25 ℃的條件下連接不同濃度靶標(biāo)并獲得連接產(chǎn)物；隨后，利用引物Ex-558a以及Ex-558b(見(jiàn)表1)進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)環(huán)化后產(chǎn)物濃度。從圖6b中可以看出，在靶標(biāo)濃度為109～104copies/μL均有環(huán)化產(chǎn)物生成，當(dāng)靶標(biāo)濃度低于104copies/μL無(wú)Ct值測(cè)出且空白組也無(wú)有效Ct值，說(shuō)明短鏈接頭環(huán)化靶標(biāo)的靈敏度為104copies/μL。

(a：短鏈接頭的設(shè)計(jì)圖；b：短鏈接頭環(huán)化558 bp靶標(biāo)DNA的產(chǎn)物進(jìn)行RT-PCR的結(jié)果。a: The design of the short adaptors. b: The RT-PCR results of the circularization products of the target DNA with short adaptors.)

本研究構(gòu)建了一種新型的發(fā)卡動(dòng)態(tài)接頭，探究了對(duì)靶標(biāo)的環(huán)化情況，并且研究了發(fā)卡接頭的穩(wěn)定性和磷酸化位置等對(duì)接頭環(huán)化靶標(biāo)的影響。最初Wang等[18]設(shè)計(jì)的傳統(tǒng)雙鏈接頭是由兩條26 nt的單鏈部分互補(bǔ)，形成中間17～19 bp雙鏈、兩端各9 nt單鏈凸出末端的雙鏈結(jié)構(gòu)。17～19 bp的雙鏈結(jié)構(gòu)在連接溫度55 ℃下難以打開(kāi)，雙鏈接頭與靶標(biāo)連接時(shí)會(huì)作為一個(gè)整體連接，且雙鏈接頭對(duì)于靶標(biāo)兩端的連接活性幾乎無(wú)差異，因此接頭會(huì)同時(shí)連接到靶標(biāo)的兩端，導(dǎo)致大多靶標(biāo)兩端均具有雙鏈接頭而最終無(wú)法環(huán)化為RCA的環(huán)狀模板，致使RCA靈敏度降低。對(duì)于發(fā)卡動(dòng)態(tài)接頭，由于發(fā)卡結(jié)構(gòu)的存在，兩條發(fā)卡接頭難以在體系中互補(bǔ)為雙鏈接頭，而是分別與靶標(biāo)兩端連接，然后在分子內(nèi)黏性末端連接的優(yōu)勢(shì)下打開(kāi)并發(fā)生環(huán)化，這樣可極大程度避免靶標(biāo)難以環(huán)化的問(wèn)題。本研究設(shè)計(jì)的發(fā)卡接頭最低可連接1×106copies/μL的靶標(biāo)DNA。通過(guò)增大接頭兩端連接活性差異并減少互補(bǔ)部分的長(zhǎng)度，改進(jìn)后的短鏈動(dòng)態(tài)接頭的連接靈敏度可達(dá)1×104copies/μL。可見(jiàn)，利用結(jié)構(gòu)、互補(bǔ)長(zhǎng)度等產(chǎn)生的連接活性差異，可有效避免抑制環(huán)化的連接發(fā)生。后續(xù)還可通過(guò)進(jìn)一步優(yōu)化接頭設(shè)計(jì)以及反應(yīng)條件來(lái)提高接頭對(duì)靶標(biāo)的靈敏度。

3 結(jié)語(yǔ)

本研究通過(guò)探究發(fā)卡動(dòng)態(tài)接頭對(duì)TC-RCA靶標(biāo)的環(huán)化情況以及發(fā)卡靈敏度和磷酸化對(duì)連接效率的影響，解釋了TC-RCA靈敏度低的根本原因。即雙鏈接頭分別連接在靶標(biāo)兩端，導(dǎo)致無(wú)法進(jìn)行環(huán)化。此外，通過(guò)設(shè)計(jì)一種新型的短鏈動(dòng)態(tài)接頭進(jìn)一步提高了靶標(biāo)的環(huán)化靈敏度，達(dá)104copies/μL。本研究構(gòu)建的發(fā)卡動(dòng)態(tài)接頭和短鏈動(dòng)態(tài)接頭可應(yīng)用于雙鏈環(huán)狀DNA制備、RCA擴(kuò)增及基于RCA的基因檢測(cè)和全基因組擴(kuò)增等多個(gè)領(lǐng)域。本研究對(duì)于完善雙鏈DNA的環(huán)化機(jī)理、進(jìn)一步提高TC-RCA的檢測(cè)靈敏度具有重要意義，同時(shí)對(duì)反向PCR等其他生物技術(shù)中雙鏈DNA的連接和環(huán)化研究也具有很高的參考價(jià)值。