張?zhí)扃?，劉平平，?佳??，馬 岑，黃曉文，張嘉俊，王 師,2

(1.中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院，海洋生物遺傳學(xué)與育種教育部重點實驗室，山東 青島 266003；2.青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點國家實驗室，海洋生物學(xué)與生物技術(shù)功能實驗室，山東 青島 266071)

貝類是海洋生態(tài)系統(tǒng)的重要底棲動物類群，同時也是我國海水養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的重要養(yǎng)殖種類。近些年迅速發(fā)展起來的分子標(biāo)記技術(shù)，在貝類的遺傳學(xué)研究以及貝類種質(zhì)創(chuàng)新和新品種培育等方面發(fā)揮了重要作用[1-3]。特別是簡化基因組測序技術(shù)的出現(xiàn)可高效獲得全基因組范圍的標(biāo)記信息[4-7]，使實現(xiàn)貝類全基因組選育成為可能[8]。在貝類遺傳學(xué)研究中，有時需要在保持貝類活體狀態(tài)的情況下開展，如對珍稀瀕危貝類的保護遺傳學(xué)研究。此外在貝類分子育種實踐中，常常需要在不影響扇貝生存或正常生理狀態(tài)的前提下，對大規(guī)模育種群體進行基因組DNA提取，用于后續(xù)基因型測定分析，因此開發(fā)高效、簡便快速的非損傷性DNA提取方法對貝類全基因組選育的開展以及珍稀瀕危貝類的遺傳學(xué)研究具有重要的意義。

貝類基因組DNA提取方法大致可以分為以下幾類：第一類是以酚氯仿抽提法[9]或商業(yè)試劑盒(如E.Z.N.A. Mollusc DNA Kit (Omega Bio-tek)、TIANamp Marine Animals DNA Kit))為代表的DNA提取方法，由于需要較大的入口組織量(大于10 mg)，取材通常是致死性的；第二類是損傷性較低的取樣方法，例如剪取少量外套膜[10]、剪取鰓絲[11]、抽取血淋巴[12]等方式，雖然不會導(dǎo)致實驗對象死亡，但往往會對其造成不同程度的損傷，比如感染、畸形等[13]；第三類是以不損傷活體的前提下取樣進行DNA提取，例如過濾養(yǎng)殖環(huán)境中的海水[14]、收集糞便或擦拭組織用于DNA提取，前兩種方式都需要將個體放置于獨立的空間進行采樣，操作較為繁瑣，處理批量樣品時核酸提取效率低。Karlsson等[12]在淡水珍珠貽貝中評價了擦拭內(nèi)臟團的DNA提取效果，提出擦拭內(nèi)臟團是一種理想的非損傷性的活體取材方式，但核酸的提取需要利用商業(yè)化的微量DNA提取試劑盒完成，對于批量樣品的DNA提取費用較高。由此可見，以上幾類DNA提取方法在大規(guī)模育種群體的基因分型檢測中都有其應(yīng)用的局限性，亟需一種在不損傷個體前提下快速廉價的提取貝類基因組DNA的方法，既能滿足育種工作的需求，又能為珍稀瀕危貝類的遺傳學(xué)研究提供有效的方法。

本研究旨在提出一種基于組織擦拭和簡單裂解相結(jié)合的核酸提取方法，在不損傷扇貝活體的情況下實現(xiàn)簡便快速、低成本的DNA提取，適用于大規(guī)模扇貝樣品的應(yīng)用。實驗以蝦夷扇貝(Patinopectenyessoensis)、櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)和海灣扇貝(Argo-pectenirradians)活體為研究對象探索了兩種不同的擦拭材料(棉簽、濾紙)對不同組織(鰓絲、內(nèi)臟團、外套膜)擦拭后的DNA提取效果，從DNA產(chǎn)量、純度、完整度等方面進行幾種方法的比較分析，通過SNP分子標(biāo)記片段的擴增和微衛(wèi)星標(biāo)記的分型驗證了該DNA提取方法應(yīng)用于基因分型的可行性。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

成體蝦夷扇貝、櫛孔扇貝、海灣扇貝購買于青島南山海鮮市場，在海水中暫養(yǎng)10 d后取材，期間每天換水2次。

1.2 扇貝的非損傷性DNA提取方法

1.2.1 DNA材料的獲取 采用兩種擦拭材料分別對3種扇貝的不同組織部位進行取材，每種扇貝各取7只個體實驗。具體的擦拭方法為，待扇貝自然張開殼后，輕輕用手指固定，留有一道5～10 mm縫隙，用竹棒棉簽或濾紙條伸進縫隙中，輕輕擦拭目標(biāo)組織表面3次。然后將取材后的棉簽或濾紙放入1.5 mL EP管中。具體的取樣分組如下所列：

CG組(Cotton_gill)：用一只無菌竹棒棉簽伸進縫隙中，輕輕擦拭鰓絲表面3次；

CV組(Cotton_viscera)：用一只無菌竹棒棉簽伸進縫隙中，輕輕擦拭內(nèi)臟團表面3次；

CM組(Cotton_mantle)：用一只無菌竹棒棉簽伸進縫隙中，輕輕擦拭外套膜表面3次；

FG組(Filter paper_gill)：用一張濾紙條(5 mm×100 mm)(Whatman，英國)伸進縫隙中，輕輕擦拭鰓絲表面3次；

FV組(Filter paper_viscera)：用一張濾紙條伸進縫隙中，輕輕擦拭內(nèi)臟團表面3次；

FM組(Filter paper_mantle)：用一張濾紙條伸進縫隙中，輕輕擦拭外套膜表面3次。

1.2.2 細胞裂解與蛋白質(zhì)消化 向上述EP管中加入100 μL裂解液，裂解液成分包括100 mmol/L NaCl、10 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L EDTA(pH=8.0)、1.0% SDS(生工，上海)和0.1 mg/mL的蛋白酶K(索萊寶，北京)，室溫下裂解15 min。

1.2.3 DNA分離 裂解結(jié)束后，取出EP管中的棉簽或濾紙，吸取DNA溶液直接用于分子生物學(xué)下游實驗或置于-20 ℃保存。

1.3 DNA質(zhì)量檢測

用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整度、純度，電壓100 V，電泳30 min；用Colibri紫外分光光度計(Titertek-Berthold，德國)檢測DNA濃度、OD260/OD280的比值。使用RNA酶(賽默飛，美國)對DNA溶液中的RNA進行消化，再用EZ-10柱式DNA純化試劑盒(生工，上海)對其進行純化，用紫外分光光度計檢測純化后DNA的濃度和純度。

1.4 蝦夷扇貝DNA分子標(biāo)記擴增與檢測

以蝦夷扇貝CG組和FG組提取得到的DNA為模板進行分子標(biāo)記的擴增。選取已報道的帶型清晰、穩(wěn)定性好的SSR引物[15-16]和SNP引物[17](見表1)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系為：DNA模板25 ng，F(xiàn)/R引物(10 μmol/L)各0.2 μL，2×Taq Plus Master Mix 12.5 μL，補水至25 μL。PCR程序為：95 ℃預(yù)變性5 min；后進入30個循環(huán)，包括95 ℃變性15 s、退火溫度下20 s、72 ℃延伸30 s；最后72 ℃延伸5 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后，MS1、MS2產(chǎn)物經(jīng)由QIAquick PCR純化試劑盒(Qiagen，德國)純化后用10%丙烯酰胺凝膠電泳檢測；SNP1、SNP2產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表1 蝦夷扇貝分子標(biāo)記核心序列、長度、引物序列及其退火溫度

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取質(zhì)量檢測

通過不同的取材方式獲取的個體基因組DNA電泳檢測結(jié)果見圖1。所有泳道都可見清晰明顯的基因組DNA條帶，陰性對照的泳道內(nèi)無明顯的DNA條帶。所有方法均能成功的提取基因組DNA，并且樣品之間的條帶亮度較為均一穩(wěn)定，盡管有不同程度的降解，但總體而言基因組DNA條帶完整度較高。

通過紫外分光光度計檢測扇貝基因組DNA的濃度和純度見表2。在棉簽擦拭組中，蝦夷扇貝、櫛孔扇貝和海灣扇貝分別測得的平均濃度為97.66、97.22和82.18 ng/μL，濾紙擦拭組中蝦夷扇貝、櫛孔扇貝和海灣扇貝分別測得的平均濃度70.64、 62.86和53.13 ng/μL。在3種扇貝中，2種擦拭材料均能獲取得率較高的DNA，在不同樣品之間以及不同扇貝中的應(yīng)用具有較好的可重復(fù)性。判斷DNA純度的常用指標(biāo)是OD260/OD280，純凈的DNA的OD260/OD280比值約為1.8。所有組中OD260/OD280的比值均小于1.8，所提DNA中含有蛋白質(zhì)污染。由于是直接吸取的裂解液對溶液內(nèi)的DNA進行檢測，并未進行純化等操作，必然會有蛋白殘留于溶液中。通常，如果蛋白殘留嚴(yán)重，點樣孔中蛋白與部分DNA的結(jié)合會出現(xiàn)電泳孔亮度較高的現(xiàn)象，但圖1顯示點樣孔的亮度適中，泳道內(nèi)DNA條帶亮度比較高，說明本方法有較高的核酸提取效率。推測是由于擦拭法獲取的組織量有限使得蛋白污染能夠有較好的控制。另外，由于裂解液中含有鹽離子以及RNA等雜質(zhì)，通過吸光度計算得到的濃度可能會存在偏差，因此我們對DNA溶液消化RNA后進行純化，檢測DNA濃度與OD260/OD280(見表2)。其中OD260/OD280的比值均在1.8左右，說明無蛋白質(zhì)殘留，OD260/OD230的比值在2.5左右，說明無糖類、鹽離子等污染，測定的DNA濃度數(shù)值真實可信。與純化前相比，各組DNA濃度均有不同程度的損失，但與純化前DNA濃度呈現(xiàn)出相同的趨勢。

經(jīng)過棉簽擦拭和濾紙擦拭的扇貝個體在一個月之后都生存狀態(tài)良好，存活率可以達到100%，說明2種擦拭方式對3種扇貝的生存狀態(tài)均未產(chǎn)生明顯的影響，表明本方法是一種在扇貝中均適用的非損傷性DNA提取方法。

2.2 不同方法提取DNA的結(jié)果比較

通過對采樣部位的比較顯示，在3種扇貝中，不論是濾紙法還是棉簽法取樣操作，DNA得率由高到低的組織分別是：鰓絲、內(nèi)臟團和外套膜，這與傳統(tǒng)的酚氯仿提取方法具有類似的結(jié)果。在蝦夷扇貝、櫛孔扇貝和海灣扇貝的實驗中，擦拭鰓絲的DNA產(chǎn)量均為最高，純化前分別達到14.364、15.363和13.834 μg，純化后達到5.560、6.120和5.885 μg(見圖2)，因此在DNA需求量較大的情況下適宜選取鰓絲作為貝類DNA提取的擦拭部位。對不同采樣材料提取的DNA結(jié)果比較可以看出(見圖2)，在DNA的得率上3種扇貝的所有組織中棉簽擦拭的產(chǎn)量都要高于濾紙擦拭的方式，DNA得率的檢測結(jié)果與電泳檢測結(jié)果吻合，電泳圖上可以看出棉簽法提取的蝦夷扇貝和海灣扇貝DNA有較為明顯的泳道拖尾現(xiàn)象，擦拭鰓絲組和內(nèi)臟團組更為明顯，而在得率最低的外套膜組中泳道背景干凈。推測是由于棉簽法DNA的上樣量較大導(dǎo)致的拖尾的現(xiàn)象。通過濾紙法提取DNA的得率整體上較棉簽法低，但是在電泳檢測結(jié)果中可以看出其DNA提取的完整度和純度上在不同的扇貝和組織中均有較好的表現(xiàn)。

((a) 蝦夷扇貝；(b) 櫛孔扇貝；(c) 海灣扇貝；M為1 kb Marker；nc1、nc2分別為棉簽和濾紙的陰性對照。(a),(b),(c) represented the DNA isolation result of Yesso scallops, Zhikong scallops and Bay scallops respectively. M represented 1 kb DNA Ladder Marker. nc1, nc2 represented the negative control of cotton and filter paper swabbing respectively.)

表2 3種扇貝中不同提取方式的DNA濃度和質(zhì)量

圖2 3種扇貝中不同取材方法獲得的DNA純化后產(chǎn)量

2.3 分子標(biāo)記PCR產(chǎn)物擴增檢測

用棉簽擦拭鰓絲(CG)、濾紙擦拭鰓絲(FG)獲得的蝦夷扇貝DNA直接作為模板，擴增MS1、MS2、SNP1、SNP2共4個DNA分子標(biāo)記所在的片段。電泳結(jié)果顯示(見圖3)，提取的樣品DNA均能擴增出條帶清晰符合預(yù)計片段大小范圍的條帶。不同個體擴增的微衛(wèi)星條帶表現(xiàn)出一定的多態(tài)性，擴增條帶長度約為200 bp，符合預(yù)期。2個SNP標(biāo)記引物擴增出100 bp左右的特異性條帶，預(yù)期PCR產(chǎn)物的大小分別為100和95 bp，電泳結(jié)果符合預(yù)期目的條帶的位置。該片段經(jīng)Sanger測序驗證確認是預(yù)先設(shè)計的目標(biāo)區(qū)段，并且擴增產(chǎn)物檢測無非特異性的雜帶，因此該產(chǎn)物可以為HRM高分辨率熔解曲線基因分型系統(tǒng)所用進行SNP位點的篩查和分型。根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果可知，兩種擦拭方法提取的DNA在擴增的帶型以及條帶亮度上并無顯著差別，在所有個體中都能獲得穩(wěn)定的擴增結(jié)果，因此棉簽法和濾紙法獲取的基因組DNA均可以直接應(yīng)用于下游基因分型的實驗中。本方法獲得的DNA溶解于裂解液中，未經(jīng)純化等操作，雖含有蛋白酶K、SDS等酶反應(yīng)抑制劑，但通過稀釋的方法制備用于PCR擴增的模板，能夠有效地減弱酶抑制劑對下游PCR擴增的影響，獲得特異性較好并且穩(wěn)定的擴增結(jié)果。

((a) MS1標(biāo)記；(b) MS2標(biāo)記；(c) SNP1標(biāo)記；(d) SNP2標(biāo)記。M為100 bp Marker；泳道1/3/5和泳道2/4/6分別是以棉簽和濾紙擦拭鰓絲方式獲取的DNA作為模板的擴增結(jié)果；nc為陰性對照。(a),(b),(c),(d) represented the amplified result of Molecular Marker MS1,MS2,SNP1 and SNP2 respectively. M represented 100 bp DNA Ladder Marker. Lane 1/3/5 and lane 2/4/6 was the PCR amplification products using DNA extracted by cotton and filter paper swabbing respectively. nc was negative control using H2O as template.)

2.4 SSR分型結(jié)果驗證

各選取了6只蝦夷扇貝分別驗證了棉簽擦拭鰓絲法(CG)和濾紙擦拭鰓絲法(FG)提取的DNA用于標(biāo)記分型的可靠性，以傳統(tǒng)的酚氯仿抽提法提取的DNA作為模板檢測微衛(wèi)星標(biāo)記MS1和MS2的擴增結(jié)果作為對照。電泳結(jié)果表明，棉簽法和濾紙法提取的DNA在擴增效果上并無顯著差別，MS1和MS2標(biāo)記均能獲得較好的擴增結(jié)果(見圖4)。在所有個體中，兩種方法的微衛(wèi)星標(biāo)記檢測結(jié)果與對照組具有一致的帶型，沒有出現(xiàn)基因丟失 (Allelic dropout) 或假等位基因 (False allele)的現(xiàn)象[18]。2種擦拭方法裂解后獲得的DNA模板均能夠用于基因型檢測實驗，獲得的個體分型結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

((a) CG法擴增標(biāo)記MS1；(b) FG法擴增標(biāo)記MS1；(c) CG法擴增標(biāo)記MS2；(d) FG法擴增標(biāo)記MS2。M為100 bp Marker；nc為陰性對照；編號相同的泳道為同一個個體的兩種方法的檢測結(jié)果，左側(cè)泳道為擦拭法，右側(cè)泳道為酚氯仿抽提法泳道。(a),(b) represented the amplified result of Molecular Marker MS1 using the DNA extracted by CG and FG method respectively. (c),(d) represented the amplified result of Molecular Marker MS2 using the DNA extracted by CG and FG method respectively. M represented 100 bp DNA Ladder Marker. nc was negative control using H2O as template. Each individual was amplified using the DNA extracted by cotton/filter swabbing (Lane left) and phenol-chloroform (right).)

3 討論

隨著測序技術(shù)的發(fā)展，越來越多的高效簡便、低成本的基因分型技術(shù)可供遺傳育種研究人員使用，成為貝類分子標(biāo)記輔助育種和珍稀貝類遺傳學(xué)研究中應(yīng)用的重要的技術(shù)手段，但這類研究開展的前提是需要在不損傷活體的前提下批量獲取樣品的基因組DNA。貝類提取DNA最為常見的方法是傳統(tǒng)的酚氯仿抽提法[9]或利用商業(yè)化試劑盒，但這類方法的取材方式往往對實驗對象是致死性的。因此許多研究者圍繞貝類非損傷性DNA提取方法進行了探索。例如使用注射器吸取太平洋牡蠣體腔液[19]或過濾牡蠣養(yǎng)殖環(huán)境中的海水[14]達到非損傷性取材的目的，但是這類取樣方式操作繁瑣，大批量樣品的取樣效率低；張鳳梅等[20]研究提出了一種適用于雙殼類軟體動物殼基因組DNA的提取方法，將貝殼打磨成粉末后裂解后直接沉淀DNA獲得，該方法更適用于難以獲得活體樣本的瀕危物種或貝殼標(biāo)本等；Karlsson等[12]在淡水珍珠貽貝中評價了4種取樣方式(抽取血淋巴、刮取足表面黏液、刮取少量外套膜、擦拭內(nèi)臟團)的DNA提取效果和分型的準(zhǔn)確性，結(jié)果表明擦拭內(nèi)臟團的取材方式相比其他方法DNA得率和分型準(zhǔn)確性更高，但該研究中利用商品化試劑盒提取DNA，大規(guī)模樣品的提取成本較高。針對以上局限性，本研究提出一種擦拭法和直接裂解法相結(jié)合的貝類DNA提取策略，在不損傷扇貝活體的前提下以極低的成本短時快速的完成樣品的核酸提取，為貝類大規(guī)模開展分子標(biāo)記輔助育種研究提供高效率具有實用價值的技術(shù)方法。

研究以三種扇貝(蝦夷扇貝、櫛孔扇貝、海灣扇貝)為實驗對象，比較了兩種擦拭材料(棉簽和濾紙)擦拭鰓絲、內(nèi)臟團、外套膜3種組織的DNA提取效果，從DNA濃度、純度、分子標(biāo)記的擴增及標(biāo)記分型的準(zhǔn)確性等方面進行了比較分析。采用兩種擦拭材料均能成功提取主帶清晰完整的基因組DNA，棉簽法擦拭整體DNA的得率要高于濾紙法。原因可能是棉簽的易操作性使得通過接觸獲得的組織細胞量更多，而通過濾紙接觸的力度相對于棉簽要小很多，獲得組織細胞量較少。但棉簽法由于DNA上樣量大的緣故，泳道內(nèi)拖尾現(xiàn)象較為明顯。這一點在蝦夷扇貝和海灣扇貝中較為明顯，但在櫛孔扇貝中，兩種采樣材料提取的效果相仿。因此后續(xù)使用棉簽擦拭法時需要考慮減少擦拭的次數(shù)。由于濾紙具有易于吸附結(jié)合核酸的特性，可以進一步將其放置于清洗液中洗脫，去除蛋白酶K、SDS等酶抑制劑[21]達到純化的目的。高通量基因分型技術(shù)的首要步驟是利用限制性內(nèi)切酶處理基因組DNA，對DNA純度的要求較高，因此濾紙法在這類技術(shù)的應(yīng)用中更具優(yōu)勢。另外，濾紙更易于記錄編號，方便保存，是現(xiàn)場或者野外檢測攜帶的理想的材料。就不同組織而言，擦拭鰓絲提取的DNA得率最高，然后依次為內(nèi)臟團和外套膜。其中棉簽擦拭鰓絲(CG組)的DNA產(chǎn)量最高，可以用于500次以上的PCR反應(yīng)，棉簽擦拭可以滿足DNA需求量較大的分子實驗需求。棉簽法和濾紙法得到的DNA完全可以滿足分子標(biāo)記的擴增要求，所有個體的擴增結(jié)果均一穩(wěn)定，分型結(jié)果準(zhǔn)確可靠，均可以應(yīng)用于基因分型檢測。兩種擦拭材料各有優(yōu)勢，研究者可以結(jié)合下游實驗的需求來選擇合適的采樣材料，如對DNA的需求量大時首選棉簽法作為采樣方式；如對DNA的質(zhì)量要求較高或者野外現(xiàn)場采樣時，優(yōu)先選擇濾紙擦拭的方法。DNA測試比較結(jié)果在蝦夷扇貝、櫛孔扇貝和海灣扇貝實驗中呈現(xiàn)基本一致的規(guī)律，表明該方法是一種在扇貝中應(yīng)用穩(wěn)定并且具有普適性的方法，在貝類親子鑒定、分子標(biāo)記輔助育種以及瀕危貝類的遺傳學(xué)分析中具有廣闊的應(yīng)用前景。

本研究中所建立方法的主要創(chuàng)新之處在于將擦拭組織的棉簽或者濾紙直接放置于裂解液中，通過優(yōu)化裂解液的配方和裂解時間使擦拭獲得的組織細胞得到充分裂解。針對下游實驗的應(yīng)用，以稀釋的方法獲得可用于分子標(biāo)記擴增的基因組DNA模板，通過稀釋倍數(shù)的調(diào)節(jié)可以有效地控制SDS等酶抑制劑對下游PCR反應(yīng)的抑制影響。所有的實驗步驟簡便易操作，可以短時內(nèi)完成一次性上百個樣本的組織采集和核酸提取，特別適用于大規(guī)模貝類樣品的分子標(biāo)記檢測和高通量基因分型。本研究的報道的DNA提取方法與已有的貝類基因組DNA提取方法相比具有以下優(yōu)勢：(1)對研究對象基本沒有損傷，滿足育種親貝選育和珍稀貝類遺傳學(xué)研究的需求；(2)操作簡便快速，擦拭組織后只需要一步裂解過程即可完成整個流程，用時不超過20 min，不需要水浴鍋、高速離心機、隔離水箱等專門儀器設(shè)備，適用于實際生產(chǎn)車間內(nèi)或野外環(huán)境的現(xiàn)場DNA提?。?3)實驗成本低，每個樣品的提取成本僅需0.17元，遠低于酚氯仿抽提法(2.10元)和商業(yè)試劑盒(8.19～18.08元)，適于大規(guī)模樣品的DNA提??；(4)實驗安全性更高，規(guī)避了傳統(tǒng)方法中酚、氯仿[22]等有毒有害試劑給實驗者帶來的吸入性安全隱患，大大提高了DNA提取實驗的安全性。

4 結(jié)語

本研究報道了一種快速、廉價、非損傷性的貝類核酸提取方法，可以獲得產(chǎn)量和純度較高的DNA，是比較理想的非損傷性的貝類DNA 提取技術(shù)，特別適用于大量樣本或野外環(huán)境下活體扇貝的核酸提取，在貝類親子鑒定、遺傳育種、珍稀瀕危貝類遺傳資源鑒定及保護等方面具有較大的應(yīng)用潛力。后續(xù)可以探索該方法與高通量基因分型技術(shù)的聯(lián)用將有助于提高大規(guī)模育種群體的基因分型效率，為貝類全基因組育種實踐工作的開展提供有力的技術(shù)支撐。