張?zhí)飕?，余彬彬?，3*，林文軒，戴博安，錢曉晴

（1.揚州大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，揚州 225127；2.南開大學(xué)環(huán)境污染過程與基準(zhǔn)教育部重點實驗室，天津 300071；3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部產(chǎn)地環(huán)境污染防控重點實驗室/天津市農(nóng)業(yè)環(huán)境與農(nóng)產(chǎn)品安全重點實驗室，天津 300071）

我國每年抗生素使用量約為16.2 萬t，約占全世界用量的一半，其中52%為獸用[1]，進(jìn)入動物體內(nèi)的抗生素有60%～90%以原藥或初級代謝產(chǎn)物的形式通過排泄物釋放到環(huán)境中[2]。據(jù)報道，2018 年我國僅作為飼料添加的抗生素高達(dá)10萬t以上，每年輸入土壤中的抗生素數(shù)量不亞于農(nóng)藥[3]?？股亻L期添加到動物飼料中，最后隨動物糞便排出[4]，這些畜禽糞便直接施入或者轉(zhuǎn)化為有機肥施入土壤，有報道顯示上海地區(qū)黃浦江上游土壤中磺胺類抗生素含量為5.85～33.37 mg·kg-1[5]。

喹諾酮類和磺胺類抗生素因廣譜性和高效抗菌性被廣泛應(yīng)用，目前在國內(nèi)地表水以及土壤中已有檢出[6]。農(nóng)田土壤中檢測出抗生素含量為μg·kg-1～g·kg-1水平[7]。邰義萍等[8]發(fā)現(xiàn)廣東某養(yǎng)殖場豬糞中磺胺類藥物總含量在1.93～13.40 mg·kg-1之間，平均含量為4.40 mg·kg-1。環(huán)丙沙星（CIP）是喹諾酮類抗生素中使用量最大的一種，有研究表明施用沼肥后土壤中CIP 殘留量高達(dá)9.66 mg·kg-1[9]。這些抗生素進(jìn)入環(huán)境后容易造成地表水以及土壤污染，甚至蓄積在植物體內(nèi)影響植物的生長。

小麥在我國是重要的糧食作物，為促進(jìn)其生長發(fā)育在生產(chǎn)過程中常常施入有機肥，已有研究表明沼液替代化肥能夠提高小麥生物量[10]。但是沼液中所含的抗生素會在一定程度上影響小麥的生長和生產(chǎn)安全。鮑艷宇等[11]研究表明，四環(huán)素類抗生素會影響小麥種子萌發(fā)。鄭曦等[12]發(fā)現(xiàn)鹽酸左氧氟沙星在低濃度時促進(jìn)小麥種子萌發(fā)，但抑制幼苗根的生長和葉綠素的合成并降低其過氧化物酶活性。王磊等[13]研究表明小麥比其他糧食作物對抗生素更為敏感。

抗生素在環(huán)境中的殘留情況以及四環(huán)素類抗生素對蔬菜生態(tài)毒性的研究已有許多報道，但對磺胺類以及喹諾酮類抗生素對小麥生態(tài)毒性機制的研究較少。本研究選用磺胺二甲基嘧啶（SM2）和CIP 兩種使用量較高的抗生素，以水培方法，研究兩種抗生素對小麥種子萌發(fā)以及幼苗生長的影響，通過評價和分析兩種抗生素生態(tài)毒性效應(yīng)，明確其對小麥的抑制濃度，為不同種類抗生素風(fēng)險評價以及畜禽糞便的處理和沼液的合理使用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試小麥（Triticum aestivum）品種為徐麥33，購于江蘇省連云港市種子站，SM2 和CIP 均購于上海麥克林公司，純度分別為99%和98%。

1.2 試驗方法

1.2.1 兩種抗生素對小麥種子芽長、根長抑制率的影響

選取顆粒飽滿、大小均勻的小麥種子，以3%的雙氧水浸泡種子20 min進(jìn)行消毒，用去離子水反復(fù)沖洗數(shù)次后，將種子均勻放在鋪滿濾紙的鋁盤中，加入去離子水使之浸沒小麥種子底部，蓋上潤濕的濾紙，放入（25±1）℃的恒溫培養(yǎng)箱中催芽。在9 cm 直徑的玻璃培養(yǎng)皿中放入三層濾紙，用消毒完的鑷子將10粒已露白的小麥種子均勻放于培養(yǎng)皿中，保持種子胚根末端和生長方向呈直線，加入不同濃度的抗生素溶液6 mL，蓋上培養(yǎng)皿蓋，置于（25±1）℃恒溫培養(yǎng)箱中暗處培養(yǎng)，間隔24 h待溶液蒸發(fā)后重新加入溶液。培養(yǎng)72 h 用測量尺測定小麥種子根長、芽長，確定種子根長最高抑制率達(dá)到20%～40%時，開始正式試驗。

根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果，設(shè)置SM2 濃度梯度為0、0.1、1.0、2.0、5.0、10.0、50.0 mg·L-1，CIP 濃度梯度為0、0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、50.0 mg·L-1，對照處理為等量的去離子水，每個處理設(shè)置4個重復(fù)。

小麥種子培養(yǎng)72 h 后用測量尺測定小麥種子根長、芽長，并計算抗生素對根長、芽長的抑制率。

根長抑制率=（對照組根長-處理組根長）/對照組根長×100%

芽長抑制率=（對照組芽長-處理組芽長）/對照組芽長×100%

目前，常采用植物的IC50（50% inhibitory concen?tration，半數(shù)抑制濃度）來評價污染物的生態(tài)毒性強弱[14]，IC50的值越小說明植物對該物質(zhì)越敏感。通過各濃度抗生素對小麥種子的根長、芽長抑制率可求得IC50值。

1.2.2 兩種抗生素對小麥幼苗的影響

種子完全露白后移入含有上述不同濃度抗生素的1/4 霍格蘭氏營養(yǎng)液中培養(yǎng)至兩葉一心。1/4 霍格蘭氏營養(yǎng)液：Ca（NO3）2·4H2O 1 mmol·L-1，KNO31.25 mmol·L-1，NH4NO30.25 mmol·L-1，KH2PO40.25 mmol·L-1，MgSO4·7H2O 0.5 mmol·L-1，F(xiàn)e-EDTA 0.125 mmol·L-1，KI 6.25×10-6mmol·L-1，HBO31.25×10-4mmol·L-1，MnSO41.85×10-4mmol·L-1，ZnSO41.25×10-5mmol·L-1，Na2MoO42.5×10-7mmol·L-1，CuSO44×10-8mmol·L-1，CoCl2·6H2O 2.5×10-8mmol·L-1。將營養(yǎng)液倒入黑色避光容量為1 L 的96孔植物水培盒中，將發(fā)芽出根的小麥根系插進(jìn)水培盒頂部的黑色孔板中保證根系正常生長，孔板上未插入小麥根系的部分用錫紙包裹防止透光。將水培盒放入光照培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)8 d，培養(yǎng)期間每日更換處理液，光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)條件：（25±1）℃、6 000 lx 光照強度下培養(yǎng)13 h，（20±1）℃、無光照下培養(yǎng)11 h。每個處理設(shè)置4個重復(fù)。

生物量：用四位天平分別稱量小麥幼苗地上部與地下部鮮質(zhì)量，并將稱量后的小麥幼苗地上部與地下部放入105 ℃烘箱中殺青30 min，再將溫度調(diào)至75 ℃烘至恒質(zhì)量后稱量其干質(zhì)量。

小麥幼苗根系形態(tài)的測定：用根系掃描儀掃描小麥根系，通過WinRHIZO 根系掃描系統(tǒng)（Win RH220 STO1600 Systems）得出總根長、平均直徑和小麥根系形態(tài)掃描圖。

小麥根系氧化還原力：用α-萘胺法測定小麥苗期根系的氧化還原力[15]。根系氧化還原力是根系活力的重要表現(xiàn)，當(dāng)根系的氧化還原力越大時，根系活力就越強，吸收養(yǎng)分的能力也增強[16]。

小麥幼苗根系細(xì)胞活力：取各處理的小麥幼苗根部組織置于2 mL 20μmol·L-1二乙酸熒光素（Fluores?cein diacetate，F(xiàn)DA）中，37 ℃條件下浸染20 min后，用0.05 mmol·L-1PBS（pH=7.0）清洗3～5 次，將樣品放在生物熒光倒置顯微鏡下拍照[17]。FDA 能夠使活細(xì)胞著色，熒光隨著染料從死細(xì)胞中流失而降低，因而顯微鏡下觀察到的細(xì)胞熒光強度能夠判定小麥根系細(xì)胞活力的強弱。當(dāng)植物受到外界脅迫時，細(xì)胞活力會發(fā)生變化，根系細(xì)胞活力可以作為評價有毒物質(zhì)誘導(dǎo)植物細(xì)胞死亡的重要指標(biāo)[18]。

1.2.3 統(tǒng)計分析

采用SPSS 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，運用ANOVA 方法分析處理組與空白對照組之間的差異性，用Origin 9.0 軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 SM2、CIP對小麥種子根長、芽長的影響

SM2 對小麥種子根長、芽長的影響見圖1A、1C，結(jié)果表明：與對照組相比，0.1～2.0 mg·L-1SM2 處理組能夠促進(jìn)小麥種子根和芽的生長，10.0～50.0 mg·L-1SM2抑制小麥種子根的生長，且濃度越高抑制作用越強，而SM2濃度達(dá)到50.0 mg·L-1時顯著抑制小麥芽長（P＜0.05），芽長由對照的5.23 cm減小至4.31 cm。

CIP對小麥種子根長、芽長的影響見圖1B、1D，結(jié)果表明：與對照組相比，0.1～1.0 mg·L-1CIP 均能夠促進(jìn)小麥種子根的生長，而0.1～5.0 mg·L-1CIP 均能夠促進(jìn)小麥種子芽的生長。5.0～50.0 mg·L-1CIP均抑制小麥種子根的生長，且濃度越高抑制作用越大，而在實驗濃度范圍內(nèi)CIP 對小麥種子芽的生長均無顯著抑制作用。

從圖1可以看出SM2與CIP對小麥種子萌發(fā)均表現(xiàn)為低濃度促進(jìn)高濃度抑制的作用，但是0.1～1.0 mg·L-1低濃度處理下SM2 對小麥種子抑制率高于CIP，50.0 mg·L-1SM2 明顯抑制小麥芽長而CIP 對小麥芽長無明顯抑制作用。兩種抗生素對小麥種子根長的抑制率明顯高于對芽長的抑制率，因此采用小麥種子根長的IC50來表征抗生素的生態(tài)毒性。SM2 對小麥種子根長IC50為101.65 mg·L-1，CIP 對應(yīng)的IC50為176.10 mg·L-1，SM2對小麥種子根長的IC50值略小，說明在早期萌發(fā)階段小麥種子的根對SM2更為敏感，比如1.0 mg·L-1處理下SM2 與CIP 對小麥種子根的抑制率分別為-13.66%和-38.75%。

2.2 SM2、CIP對小麥幼苗生物量的影響

SM2對小麥幼苗生物量的影響見圖2，結(jié)果表明：與對照組相比，0.1 mg·L-1SM2 處理組在一定程度上促進(jìn)了小麥根和葉的生長以及小麥干物質(zhì)的積累，從1.0 mg·L-1SM2 開始明顯抑制小麥地下部生物量，并且濃度越高抑制作用越大。1.0～5.0 mg·L-1的SM2 處理組小麥地上部生物量變化不明顯，之后隨著SM2濃度的增加呈現(xiàn)逐漸減小的趨勢。

圖1 SM2（A、C）與CIP（B、D）對小麥種子根長、芽長的影響Figure 1 Effects of SM2（A，C）and CIP（B，D）on root and shoot length of wheat seeds

圖2 SM2對小麥幼苗生物量的影響Figure 2 Effects of SM2 on biomass of wheat seedlings

CIP 對小麥幼苗生物量的影響見圖3，結(jié)果表明：與對照組相比，除0.1mg·L-1CIP對小麥幼苗葉片的生長無明顯作用外，各濃度CIP 處理組對小麥幼苗根長、葉長以及地上部與地下部的鮮質(zhì)量、干質(zhì)量均有不同程度的抑制。對于小麥幼苗地上部來說，隨著CIP 濃度的增大其生物量呈現(xiàn)逐漸減小的趨勢。而對于小麥幼苗地下部，0.1～1.0 mg·L-1CIP對其生物量具有明顯的抑制作用，但當(dāng)CIP 濃度達(dá)到10.0 mg·L-1后小麥幼苗地下部生物量變化趨于平緩。

上述結(jié)果表明，SM2、CIP兩種抗生素對小麥幼苗地下部的影響均大于地上部，但CIP 對小麥幼苗抑制臨界濃度低于SM2。

2.3 SM2、CIP對小麥幼苗根系形態(tài)的影響

SM2 對小麥幼苗根系形態(tài)影響見圖4A 和圖5A、圖5B，結(jié)果表明：0.1 mg·L-1SM2 能夠促進(jìn)小麥根系生長，小麥幼苗根系總根長與平均直徑均有所增大，但是隨著SM2濃度的增大，小麥幼苗根系生長受到抑制，側(cè)根逐漸減少，總根長與平均直徑均呈現(xiàn)減小的趨勢，這與小麥幼苗干物質(zhì)積累的結(jié)果一致。

CIP 對小麥幼苗根系形態(tài)影響見圖4B 和圖5C、圖5D，結(jié)果表明：在各濃度CIP 處理下小麥幼苗根系生長均會受到抑制，隨著CIP 濃度的增大，小麥幼苗根系側(cè)根數(shù)和須根數(shù)也逐漸減少，總根長與平均直徑均呈現(xiàn)減小的趨勢，當(dāng)CIP 濃度達(dá)到10.0 mg·L-1后隨著CIP濃度的增大，小麥幼苗根系變化較小，CIP對小麥根系的抑制作用達(dá)到較高水平，這與小麥幼苗干物質(zhì)積累的結(jié)果也一致。

由此可見，低濃度處理下SM2對小麥幼苗根系形態(tài)起促進(jìn)作用，而低濃度CIP 已經(jīng)抑制小麥根系發(fā)育，但是隨著處理濃度的增大兩種抗生素抑制根系發(fā)育作用均逐漸增強。

2.4 SM2、CIP對小麥幼苗根系氧化還原力的影響

SM2 對小麥幼苗根系氧化還原力的影響見圖6A，結(jié)果表明：SM2 與小麥幼苗根系氧化還原力呈明顯負(fù)相關(guān)，當(dāng)SM2濃度達(dá)到10.0 mg·L-1時顯著抑制小麥根系氧化還原力（P＜0.05），此時小麥根系對α-萘胺的生物氧化量由對照的103.15 μg·g-1·h-1減小到86.25μg·g-1·h-1，并且SM2濃度越大根系對α-萘胺的生物氧化量越小。

圖3 CIP對小麥幼苗生物量的影響Figure 3 Effects of CIP on biomass of wheat seedlings

圖4 不同濃度的SM2（A）和CIP（B）對小麥幼苗根系形態(tài)的影響Figure 4 Effects of SM2（A）and CIP（B）on root morphology of wheat seedlings

圖5 SM2（A、B）和CIP（C、D）對小麥幼苗總根長、平均直徑的影響Figure 5 Effects of SM2（A,B）and CIP（C,D）on total root length and average diameter of wheat seedlings

CIP 對小麥幼苗根系氧化還原力的影響見圖6B，結(jié)果表明：CIP 與小麥幼苗根系氧化還原力呈明顯負(fù)相關(guān)，1.0 mg·L-1CIP 即顯著抑制小麥根系氧化還原力（P＜0.05），此時小麥根系對α-萘胺的生物氧化量由對照的103.15 μg·g-1·h-1減小到86.77 μg·g-1·h-1，并且隨著CIP 濃度的增大根系對α-萘胺的生物氧化量呈逐漸減小的趨勢。

圖6 SM2（A）和CIP（B）對小麥根系氧化還原力的影響Figure 6 Effects of SM2（A）and CIP（B）on redox ability of wheat roots

可以看出SM2 和CIP 對小麥幼苗根系氧化還原力的影響均表現(xiàn)為隨著抗生素濃度的增大根系氧化還原力逐漸降低，且CIP 產(chǎn)生抑制作用的臨界濃度更低。

2.5 SM2、CIP對小麥幼苗根系細(xì)胞活力的影響

SM2 對小麥幼苗根系細(xì)胞活力的影響見圖7A，結(jié)果表明：與對照相比，0.1 mg·L-1SM2對小麥根系細(xì)胞活力影響較小，但當(dāng)SM2 濃度達(dá)到1.0 mg·L-1時小麥根系熒光亮度有所減弱，之后隨著SM2 濃度的增大，小麥根系熒光區(qū)域逐漸減小并且亮度逐漸減弱，根系細(xì)胞活力逐漸減弱。

CIP 對小麥幼苗根系細(xì)胞活力的影響見圖7B，結(jié)果表明：與對照相比，各濃度CIP 處理下的小麥根系細(xì)胞均一定程度受損，在試驗濃度范圍內(nèi)隨著CIP 濃度增大，小麥根系熒光區(qū)域逐漸減小并且亮度逐漸減弱，小麥根系細(xì)胞活力呈逐漸減弱的趨勢。

隨著SM2 和CIP 濃度的增大，小麥根系細(xì)胞活力均呈現(xiàn)逐漸減弱的趨勢，但低濃度SM2處理下小麥根系細(xì)胞活力變化較小，而低濃度CIP 處理下小麥根系細(xì)胞活力已有所降低。

圖7 SM2（A）與CIP（B）對小麥幼苗根系細(xì)胞活力的影響Figure 7 Effects of SM2（A）and CIP（B）on root cell viability of wheat seedlings

3 討論

3.1 兩種抗生素對小麥種子毒性效應(yīng)

低濃度SM2、CIP能夠促進(jìn)小麥種子萌發(fā)，原因可能是在較低濃度抗生素脅迫下種子產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，刺激體內(nèi)生長物質(zhì)的合成，王盼亮等[19]研究表明，低劑量的抗生素刺激植物體內(nèi)蛋白質(zhì)的合成來抵御抗生素的脅迫。但隨著抗生素濃度的升高種子萌發(fā)開始受抑制，并且隨著濃度的增大抑制作用不斷增強，說明當(dāng)抗生素濃度較高時抗生素的毒害作用會逐漸顯現(xiàn)，這與李萌等[20]的研究結(jié)果相似。而抗生素對小麥種子根的抑制作用更強可能是由于小麥種子的根與污染物直接接觸，而芽可以通過從胚中吸收養(yǎng)分維持自身生長，但是隨著抗生素濃度的升高，根吸收抗生素并運輸?shù)椒N胚內(nèi)，芽的生長也會逐漸受到抑制[21]。

對比兩種抗生素對小麥種子根長的IC50可以發(fā)現(xiàn)，小麥種子對SM2 的敏感程度略大于CIP，說明小麥對不同種類抗生素耐受程度不同，實際生產(chǎn)中要注意沼液等畜禽糞便有機肥中所含抗生素的濃度。魏子艷[22]研究表明磺胺對甲氧嘧啶比金霉素對油菜的生態(tài)毒性更強。

3.2 兩種抗生素對小麥幼苗生長的影響

兩種抗生素對小麥幼苗生長的毒性作用機制有明顯區(qū)別，但與種子萌發(fā)不同的是CIP 對小麥幼苗生長的抑制作用更強。其原因是抗生素在植物體內(nèi)的累積能力不同，衰減系數(shù)也不同，因此產(chǎn)生的生態(tài)毒性程度也不同，CIP屬于親水性較強的抗生素，而SM2則親水性較弱，因此CIP 更易從地下部運輸?shù)降厣喜?，從而對小麥幼苗地上部與地下部產(chǎn)生毒害[23]。其毒性可能是由于小麥體內(nèi)生長所需的葉酸與從環(huán)境中吸收的抗生素相互競爭使得小麥對葉酸吸收減小，進(jìn)而影響小麥幼苗的生長[24]。與小麥種子相比，兩種抗生素對幼苗的抑制臨界濃度更低，說明隨著幼苗的生長其累積抗生素的能力有所提高，其根系只能被迫吸收環(huán)境中的抗生素。同樣抗生素對小麥幼苗地下部的影響大于地上部，原因可能是根系直接暴露在抗生素溶液中受到毒害作用，并且根作為吸收養(yǎng)分的主要器官對抗生素的累積能力強于葉片，這與鮑陳燕等[25]的研究結(jié)果類似。

3.3 兩種抗生素對小麥幼苗根系的影響

植物根系是直接吸收和利用環(huán)境中水分和養(yǎng)分的器官，地下部根系的生長狀況和形態(tài)會影響整株植物生長發(fā)育[26]。小麥根系形態(tài)的結(jié)果與其生物量相一致，隨著抗生素濃度的增大，根長和平均直徑逐漸減小，側(cè)根明顯減少，說明根系吸收養(yǎng)分的能力不斷減弱，根系的固持能力也不斷減弱。這與王效瑾等[27]的研究結(jié)果相反，其研究表明在高濃度污染物脅迫下，小麥幼苗的根長減小，但是根系的平均直徑逐漸增加，原因可能是不同的污染物對小麥的脅迫效應(yīng)不同。

根系氧化還原力和細(xì)胞活力均能夠反映根系活力，在較高濃度SM2 和CIP 脅迫下小麥根系活力明顯減弱，說明抗生素一旦超過臨界濃度就會抑制小麥根系活力，影響小麥根系養(yǎng)分的吸收。一般而言植株通過體內(nèi)抗氧化酶活性以及滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來抵御外界脅迫，因此在較高濃度抗生素脅迫下小麥體內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)可能受到損傷，影響幼苗正常生長發(fā)育。這與廖德潤等[28]的研究結(jié)果類似，其研究表明低濃度的抗生素對空心菜植株的生長具有刺激效應(yīng)，而高濃度條件下則表現(xiàn)出抑制效應(yīng)，植株中可溶性蛋白含量以及抗氧化酶活性均受到抑制。

4 結(jié)論

（1）低濃度的SM2、CIP能夠促進(jìn)小麥種子根和芽的生長，但達(dá)到抑制臨界濃度后開始對小麥種子根長起抑制作用，并且隨著濃度的增大抑制作用不斷增強，抗生素對小麥種子根的毒性效應(yīng)強于芽。小麥種子對SM2 的耐受程度略低于CIP，低濃度的SM2 對小麥種子根的生態(tài)毒性更為明顯。

（2）兩種抗生素對小麥幼苗生長的毒性作用機制有明顯區(qū)別，CIP 對小麥幼苗的生態(tài)毒性更強。抗生素對小麥幼苗的抑制臨界濃度低于小麥種子，并且對小麥幼苗地下部的毒害作用大于地上部。

（3）在試驗濃度范圍內(nèi)兩種抗生素與小麥幼苗根系活力呈負(fù)相關(guān)，在較低濃度下SM2、CIP對小麥幼苗根系活力影響較小，隨著抗生素濃度的升高小麥幼苗根系活力逐漸減弱。因此在施用糞肥時要嚴(yán)格監(jiān)控其中抗生素的量，保證糧食生產(chǎn)安全。