王曉國，張自斌，李秀玲，周主貴*

(1.廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 微生物研究所，廣西 南寧 530007; 2.廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 花卉研究所，廣西 南寧530007)

兜蘭屬是蘭科植物中最具特色的一個類群，分布于東南亞、南洋群島以及太平洋西南大洋洲島嶼國家[1]。近年來，野生兜蘭的過度采集和其自然生境受到嚴(yán)重破壞[2]，兜蘭分布區(qū)和種群數(shù)量劇減[3]。目前，兜蘭全屬植物已被列入“野生動植物瀕危物種國際貿(mào)易公約”(CITES)附錄Ⅰ而受到嚴(yán)格保護(hù)[4]。中國是兜蘭的主要分布區(qū)之一，主要分布于西南地區(qū)及華南部分地區(qū)[5，6]。廣西西北部為我國野生帶葉兜蘭(Paphiopedilumhirsutissimum)的主要分布區(qū)域，近年來廣西野生帶葉兜蘭分布破碎化現(xiàn)象加劇，種群恢復(fù)的工作刻不容緩[7]。

根內(nèi)真菌主要定殖于植物根內(nèi)，大致分為共生、腐生和寄生真菌3種類型。其中，共生真菌可從土壤中直接吸收植物所需礦質(zhì)營養(yǎng)，協(xié)助根系吸收水分，改善植物養(yǎng)分和水分狀況[8，9]。在自然界中，幾乎所有的蘭科植物均具有菌根，其生活始終必須部分或者全部依靠菌根提供養(yǎng)分，共生真菌對蘭科植物的繁殖、生長起著重要的作用[10，11]。在野外環(huán)境下，大多數(shù)蘭科植物種子必須與合適的共生真菌建立共生關(guān)系才能夠萌發(fā)，共生真菌對蘭科植物的種群恢復(fù)起著重要的作用。

根內(nèi)真菌的群落結(jié)構(gòu)不僅會影響到共生真菌而且也會對植物的生長和發(fā)育起到重要的作用。帶葉兜蘭多見于地生或者石上浮生，為半附生種類，對共生真菌依賴性較強[12]。采用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)技術(shù)評估植物根內(nèi)真菌群落多樣性是有限的，并非所有根內(nèi)真菌都能夠分離培養(yǎng)[13,14]。采用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)從植物組織中提取總DNA，設(shè)計特異引物通過 PCR擴(kuò)增和基因組分析，可以避免純培養(yǎng)分析根內(nèi)真菌的局限性[15]，但這些技術(shù)仍然不能全面分析根內(nèi)所有真菌的物種多樣性。高通測量序(high-throughput sequencing)具有測序速度快、通量高的優(yōu)點，已成為微生物種群結(jié)構(gòu)及多樣性分析的有效先進(jìn)研究手段[16，17]。為此，本研究本著最小化損傷野生帶葉兜蘭的原則，收集野生帶葉兜蘭根段，利用Illumina Miseq測序平臺對其根內(nèi)真菌rDNA ITS基因可變區(qū)進(jìn)行測序，結(jié)合生物信息學(xué)分析野生帶葉兜蘭根內(nèi)真菌的群落組成，以期為研究帶葉兜蘭根內(nèi)真菌和內(nèi)生真菌的關(guān)系提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

野生帶葉兜蘭根樣于2017年9月采自廣西樂業(yè)雅長國家自然保護(hù)區(qū)內(nèi)的蘭園(LY)、黃瓊洞(HJD)、邕木(YM)3個樣點。帶葉兜蘭是瀕危蘭科植物，因此本研究選取了根系比較發(fā)達(dá)的植株，每個植株收集1條約5 cm長的根段。每個樣點分3個采集處，每處收集4～6條根段混為一個樣品處理。根樣收集后，裝于自封袋，適量填充原生境苔蘚或腐殖質(zhì)，帶回實驗室置于-80 ℃冰箱短期保存。

1.2 實驗方法

1.2.1 根系總DNA的提取 將根系剪成2～3 cm長的小段，先用自來水沖洗干凈，再用蒸餾水清洗，放入0.1%的升汞中浸泡5 min 左右；取出后用蒸餾水沖洗干凈，再放入75%酒精中浸泡20 s左右，最后用蒸餾水沖洗干凈，晾干后備用。

對根段表面消毒后，采用植物DNA提取試劑盒對根樣總DNA進(jìn)行提取，其操作流程按照試劑盒說明書進(jìn)行。所提DNA的完整性采用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，同時采用Nanodrop紫外分光光度計(Thermo Fisher Scientifific，Wilmington，Delaware，USA)對DNA進(jìn)行定量分析。

1.2.2 文庫構(gòu)建及測序 以50～100 ng DNA為模板，PCR擴(kuò)增真菌ITS rDNA上的 ITS2 可變區(qū)，真菌通用引物ITS2F(5′-GTGAATCATCGARTC-3′)為前引物，ITS2R (5′-TCCTCCGCTTATTGAT-3′)為后引物，并為每個樣本添加特異性Barcode序列，其中Ba-F(5′-ACCTGCGGARGGAT-3′)為前引物，Ba-R(5′-GAGATCCRTTGYTRAA-3′)為后引物；對各處理樣本中的真菌ITS1區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增。使用Agilent 2100 生物分析儀檢測文庫質(zhì)量，并且通過Qubit和實時定量PCR檢測文庫濃度。

DNA文庫混合后，按Illumina MiSeq(Illumina，San Diego，CA，USA)儀器使用說明書進(jìn)行2×300/250雙端測序(PE)；圖像分析和堿基識別是通過MiSeq工具中的MiSeq Control Software (MCS)進(jìn)行的，最后在Illumina basespace云端計算平臺進(jìn)行初始分類分析。上機測序和分析委托蘇州金唯智生物科技有限公司進(jìn)行。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析 雙端測序得到的正反向reads首先進(jìn)行兩兩組裝連接，過濾拼接結(jié)果中含有N的序列，保留序列長度大于200 bp的序列。經(jīng)過質(zhì)量過濾，去除嵌合體序列，最終得到的序列用于OTU分析。使用VSEARCH(1.9.6)進(jìn)行序列聚類(序列相似性設(shè)為97%)，比對ITS rRNA的參考數(shù)據(jù)庫是UNITE ITS database (https://unite.ut.ee/)。然后用 RDP classifier (Ribosomal Database Program) 貝葉斯算法對OTU的代表性序列進(jìn)行物種分類學(xué)分析，并在不同物種分類水平下統(tǒng)計每個樣本的群落組成?；贠TU的分析結(jié)果，采用對樣本序列進(jìn)行隨機抽樣的方法，分別計算Shannon、Chao1等α多樣性指數(shù)，并作出稀釋曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 各樣品內(nèi)的OTU水平分析

本次實驗利用第二代測序技術(shù)對帶葉兜蘭不同樣點根樣品中的真菌群落進(jìn)行了測序研究，測序區(qū)域為ITS區(qū)段，測序長度在200～500 bp，樣本最小平均長度352 bp，最大平均長度407 bp。共測得原始序列條數(shù)為1260490條，過濾掉低質(zhì)量的序列并均一化后，得有效序列數(shù)952589條，并在99%相似度下將其聚類為用于物種分類的OTUs，統(tǒng)計得到所有樣品在不同OTUs中的豐度信息，共產(chǎn)生1028個OTUs。其中HJD處理中1號樣品的內(nèi)生真菌所得OTUs數(shù)量最高，共測得557個OTUs；LY處理中3號樣品中最少，僅有143個OTUs (表1)。

稀釋曲線可直接反映不同樣本的測序數(shù)據(jù)量的合理性，并間接反映各個樣本中物種的豐富程度。從圖1中可知，9個樣品稀釋曲線均基本趨于平緩，說明這些樣本基本覆蓋了絕大多數(shù)的真菌，其真菌群落具有多樣性，此次所得序列可基本反映真實環(huán)境中真菌群落結(jié)構(gòu)。但稀釋曲線仍未達(dá)到完全飽和，說明仍有部分真菌種類尚未被發(fā)現(xiàn)(圖1)

表1 各樣品測序數(shù)據(jù)

圖1 各樣品的稀釋曲線

2.2 各樣品中內(nèi)生真菌群落相關(guān)性分析

以各樣本點中分布的OTUs數(shù)為計算依據(jù)，構(gòu)建韋恩圖(圖2)。圖中每個圓形代表一個樣本點中的3個樣品的真OTUs總數(shù)，中間的共有區(qū)域的數(shù)字代表所有樣品共有的OTUs數(shù)目，圓形上的數(shù)字代表該樣品特有的OTUs數(shù)目。如圖2所示，帶葉兜蘭菌根中總共包含2096個OTUs，其中，以HJD處理樣品中的OTUs最多，包含1075個OTUs；YM處理樣品中的OTUs次之，包含559個OTUs；LY處理樣品中的OTUs最少，包含462個OTUs。有271個OTUs同時出現(xiàn)在YM和LY處理中，381個OTUs同時出現(xiàn)在HJD和LY處理中，498個OTUs同時出現(xiàn)在YM和HJD處理中。254個OTUs在所有處理中均有出現(xiàn)，占21.16%，說明實驗選取的帶葉兜蘭根樣品中，存在一定的相似內(nèi)生真菌群落組成。

2.3 各樣品中內(nèi)生真菌多樣性及群落結(jié)構(gòu)差異分析

采用Alpha多樣性指標(biāo)中的Coverage指數(shù)、Shannon指數(shù)和Chao1指數(shù)來分析各樣品內(nèi)生真菌的豐富度和多樣性。結(jié)果表明，同一樣本點的不同樣品之間Shannon指數(shù)存在一定差異，不同樣本點之間也存在差異，說明帶葉兜蘭菌根真菌的群落分化程度較高。從群落豐度Chao1指數(shù)和OTUs數(shù)量來看，HJD1>HJD3>HJD2>LY1>YM1>YM2>LY2>YM3>LY3，說明HJD樣點的帶葉兜蘭根部的內(nèi)生真菌群落分化的程度更高。

圖2 各樣本中內(nèi)生真菌群落相關(guān)性分析

PCA的橫坐標(biāo)表示第一主成分，百分比則表示第一主成分對樣品差異的貢獻(xiàn)值；縱坐標(biāo)表示第二主成分，百分比表示第二主成分對樣品差異的貢獻(xiàn)值；圖3中的每個點表示一個樣品，同一個組的樣品使用同一種顏色表示。主成分1(PC1)和主成分2(PC2) 對樣品差異性貢獻(xiàn)率分別達(dá)到38.30%和24.21%，合計達(dá)到62.51%。由各樣品在主成分中的位置可以看出，LY、YM在一個區(qū)域內(nèi)，且距離極為接近，表明兩者之間差異較?。欢鳫JD與LY、YM則存在明顯差異。HJD的組內(nèi)樣品分布比較松散，樣品間的間隔較大，說明組內(nèi)樣品的差異顯著(圖3)。以上結(jié)果表明，實驗選取的帶葉兜蘭根樣品中，雖存在相似的內(nèi)生真菌組成，但各樣本點間仍存在一定差異，且可能與各樣本點的帶葉兜蘭生長環(huán)境有關(guān)。HJD樣點的帶葉兜蘭多生長在石頭上，根系生長環(huán)境的均一性較差，更容易受到周圍環(huán)境、水分等多中因素的影響，從而造成真菌對宿主組織或生長環(huán)境的選擇偏好性，導(dǎo)致帶葉兜蘭根樣本點間也存在較為明顯的差異。

表2 各樣點的Alpha多樣性

圖3 各樣點間根內(nèi)真菌群落主成分分析

2.4 各樣品中內(nèi)生真菌群落結(jié)構(gòu)組成分析

利用RDP classifier對各樣品中OTU依次在門(phylum)、綱(class )、目(order)、科 ( family )、屬(genus)水平信息上進(jìn)行真菌物種分析，挖掘樣本點間的群落結(jié)構(gòu)組成。結(jié)果表明，帶葉兜蘭根內(nèi)生真菌群落共涉及6個門、21個綱、46個目、96個科、143個屬、217個種及大量未分類種類(表3)。

表3 各樣點的根內(nèi)真菌群落組成

在門的水平中，共鑒定出21個綱，對其中20個主要綱進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，優(yōu)勢菌群包括座囊菌綱(Dothideomycetes)、糞殼菌綱(Sordariomycetes) 、散囊菌綱(Eurotiomycetes)、傘菌綱(Agaricomycetes)、酵母菌綱(Saccharomycetes)、微球黑粉菌綱(Microbotryomycetes)、銀耳綱(Tremellomycetes)以及一些未知菌目。座囊菌綱(Dothideomycetes)、糞殼菌綱(Sordariomycetes)、散囊菌綱 (Eurotiomycetes)及傘菌綱(Agaricomycetes)為各樣品中的優(yōu)勢菌群。古菌根菌綱(Archaeorhizomycetes)、圓盤菌綱(Orbiliomycetes) 、節(jié)擔(dān)菌綱(Wallemiomycetes)在HJD樣品中分布較多(圖4)。此外，帶葉兜蘭根樣中存在著大量未分類菌屬。

圖4 綱水平的帶葉兜蘭菌根真菌群落組成

在綱水平中共鑒定出46個目，含量最高的前30個目中包括了傘菌目(Agaricales) 、革菌目 (Thelephorales) 、多孔菌目(Polyporales) 、煤炱目(Capnodiales) 、假球殼目(Pleosporales)、葡萄座腔菌目(Botryosphaeriales) 、肉座菌目(Hypocreales)、散囊菌目(Chaetothyriales)、曲霉目 (Eurotiales)等以及一些未知菌綱(圖5)。其中，肉座菌目 (Hypocreales)、散囊菌目(Chaetothyriales)、曲霉目 (Eurotiales)在3個樣點中均有分布，紅菇目(Russulales)在YM樣點中分布較多，葡萄座腔菌目(Botryosphaeriales)、炭角菌目(Xylariales)、古菌根菌目(Archaeorhizomycetales)等在HJD樣點分布較多(圖5)。此外，帶葉兜蘭根樣中還存在著大量未分類菌屬。

圖5 目水平上的帶葉兜蘭菌根真菌群落組成

進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，在屬水平上，含量最高的前30個目中包括了木霉屬(Trichoderma)、濕傘屬(Hygrocybe)、青霉屬(Penicillium)、外瓶霉屬(Exophiala)、地星屬(Geastrum)、散囊菌屬(Phaeomoniella)、膠膜菌屬(Tulasnella)、鐮刀菌屬(Fusarium)等以及一些未知菌屬。其中大多數(shù)菌屬都在HJD樣點中有分布，裸腹菌屬(Gymnomyces)、散囊菌屬(Phaeomoniella)在YM樣點含量較高(圖6)。

由此可見，不同樣點的帶葉兜蘭根內(nèi)生真菌群落結(jié)構(gòu)組成相近，但各樣點間菌群含量則存在明顯差異，HJD樣點的菌群含量明顯與LY和YM的不同，LY和YM樣點的菌群含量較為接近。這與上述多樣性分析、差異性分析、主成分分析結(jié)果一致。

3 結(jié)論與討論

根內(nèi)微生物組成與植物種類、生長時期、組織類型等密切相關(guān)[18，19]。此外，植物生長地理位置、降雨量、日照時間、土壤等環(huán)境因素也間接影響內(nèi)生微生物群落的形成[20，21]。HJD樣點3采集處的群落多樣性差異較大，該樣點的帶葉兜蘭多為石生，可能與土壤環(huán)境的差異較大有關(guān)。YM和LY樣點采集處的群落多樣性也表現(xiàn)出一定的差異，可能是由于此兩處的帶葉兜蘭生長數(shù)量較為密集，生長空間的大小可能對群落多樣性的貢獻(xiàn)更大。HJD樣點與YM、LY樣點相比，不管是群落多樣性還是群落組成都要高，且YM、LY樣點帶葉兜蘭多為成片密集生長，這可能表明在小空間尺度上，帶葉兜蘭的種群密度可能在一定程度上影響了根內(nèi)真菌的多樣性和群落組成。

圖6 屬水平上的帶葉兜蘭菌根真菌群落組成

帶葉兜蘭根內(nèi)真菌群落由一些常見真菌以及部分未知菌屬組成。在屬水平上，木霉屬(Trichoderma)、濕傘屬(Hygrocybe)、青霉屬(Penicillium)、外瓶霉屬(Exophiala)、地星屬(Geastrum)、散囊菌屬(Phaeomoniella)、膠膜菌屬(Tulasnella)、鐮刀菌屬(Fusarium)等屬為優(yōu)勢菌群，這與前人的研究結(jié)果[22，23]略有區(qū)別，這種區(qū)別可能是由生長地域的差異所致[24-26]。與蘭科植物形成菌根的共生真菌多為擔(dān)子菌門的蠟殼菌(Sebacinaceae)、角擔(dān)菌(Ceratobasidiaceae)、膠膜菌(Tulasnellaceae)、革菌(Thelephoraceae)、銹病菌(Pucciniomycotina)、鐮刀菌(Fusarium)等真菌[6]。通過傳統(tǒng)組織分離培養(yǎng)法鑒定到的帶葉兜蘭共生真菌多為膠膜菌(Tulasnellaceae)、角擔(dān)菌科(Ceratobasidiacea)真菌及少數(shù)鐮刀菌屬(Fusarium)真菌[7]。本研究中優(yōu)勢菌群中僅有鐮刀菌和膠膜菌為蘭科共生真菌的菌屬，其余菌屬并未鑒定到，這不代表此次實驗中其余蘭科共生真菌沒有定殖到帶葉兜蘭中。植物總DNA的提取方法、測序的深度和OTU的豐度值及數(shù)據(jù)過濾等極有可能將一些含量較少的蘭科共生真菌的菌屬剔除。分離培養(yǎng)的方法可以分離到部分根內(nèi)真菌，同時也會低估真菌的多樣性。而非培養(yǎng)的方法雖然得到不可培養(yǎng)的真菌，但較培養(yǎng)的方法能夠更加全面地了解真菌的多樣性和群落結(jié)構(gòu)。共生真菌不管是在種類還是在含量上只占根內(nèi)真菌的一小部分，除了一些明確的腐生和致病真菌外，其他大多數(shù)真菌的種類和含量還是未知，對這些未知真菌確切的生物學(xué)功能并不清楚，它們對維持整個根內(nèi)真菌的多樣性及共生真菌種類和數(shù)量上的功能也需要深入研究。