陶志勇，UMAR Ibrahim，呂樵嵐，劉韋萍，張培藝，靳小霞，方強(qiáng)，夏惠

蚌埠醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室，安徽 蚌埠 233030

恙蟲(chóng)病由恙蟲(chóng)病東方體引起的，其傳播媒介為恙螨[1-2]。本病主要流行于東南亞、東北亞等亞洲地區(qū)[3-5]，近年來(lái)我國(guó)恙蟲(chóng)病的流行區(qū)由南向北不斷擴(kuò)大[6-7]，安徽沿淮流域的恙蟲(chóng)病發(fā)病人數(shù)和發(fā)病率呈逐漸升高的趨勢(shì)[8-9]。其中，蚌埠市的懷遠(yuǎn)縣恙蟲(chóng)病發(fā)病較為嚴(yán)重，恙螨帶菌狀況亟需研究[10]。恙蟲(chóng)病東方體培養(yǎng)和動(dòng)物接種較為困難，因此，開(kāi)發(fā)適合現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用的低成本檢測(cè)方法對(duì)于恙蟲(chóng)病的防控具有重要價(jià)值。本研究在已有基礎(chǔ)上[11]，針對(duì)恙蟲(chóng)病東方體GroEL基因，建立了一種基于“染料-蠟丸”的目視LAMP檢測(cè)恙螨體內(nèi)恙蟲(chóng)病東方體的方法，通過(guò)與便攜式LAMP儀聯(lián)合使用，可以為恙蟲(chóng)病的防治提供新的檢測(cè)工具。

1 材料和方法

1.1材料 恙螨：采用小黑板法捕捉來(lái)自蚌埠市懷遠(yuǎn)縣的恙螨，貯存于70%乙醇中，由蚌埠醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室保存。微晶蠟：購(gòu)自荊門(mén)石化公司?？寺≥d體和GroEL核酸片段：購(gòu)自南京金斯瑞有限公司。主要試劑儀器：Bst酶、Taq酶、Sau3AI內(nèi)切酶、dNTPs、硫酸鎂購(gòu)自NEB公司；Axygen組織DNA提取試劑盒購(gòu)自Corning公司；SYBR Green I購(gòu)自Invitrogen公司。便攜式LAMP儀原型機(jī)為本課題組自行研發(fā)。

1.2方法

1.2.1靶序列選擇與引物設(shè)計(jì) 將OtGroEL基因(GenBank:JX235722)序列上傳到Primer Explorer 5.0(http://primeexplorer.jp/lampv5e/index.html)網(wǎng)站用于引物組設(shè)計(jì)，根據(jù)系統(tǒng)推薦，結(jié)合引物的一般要求，選擇其中的一套引物并合成。

1.2.2重組質(zhì)粒pUC57-rOt-GroEL的構(gòu)建OtGroEL基因片段由金斯瑞公司合成，并克隆到pUC57載體上，同時(shí)對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3恙螨DNA提取 將恙螨從乙醇保存的標(biāo)本管中取出放置在平皿中，用生理鹽水沖洗恙螨，在解剖鏡下用一次性塑料研磨棒將恙螨磨碎。按照廠商的說(shuō)明書(shū)，采用Axygen 組織DNA Miniprep試劑盒(Corning公司，中國(guó)杭州)從研磨好的螨樣品中提取DNA，檢測(cè)DNA濃度后，樣品在-20℃冰箱保存。

1.2.4“染料-蠟丸”的制備 將1 mL一次性注射器的針筒在0.1 mL處切斷，保留注射器下部和注射推桿作為蠟丸模具。用不銹鋼藥匙盛取適量微晶蠟，酒精燈加熱使其熔化。傾倒約0.2 mL液態(tài)蠟進(jìn)入模具，加1 μL 1000× 熒光染料SYBR Green I在冷卻凝固蠟表面上，再傾倒另外0.2 mL的液態(tài)蠟進(jìn)入模具，等蠟完全凝固后，推動(dòng)針?biāo)ǎ瑢Ⅲw積約為0.5 mL的圓柱體“染料-蠟丸”推到1 mL無(wú)菌塑料離心管中，放置-20℃冰箱保存。

1.2.5藍(lán)光檢測(cè)器的制備 將市售玩具LED手電筒的燈珠取下，替換成478 nm波長(zhǎng)藍(lán)光LED燈珠即可。

1.2.6目視LAMP法 按照文獻(xiàn)[12-13]配制LAMP反應(yīng)體系，以rOt-GroEL質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照，無(wú)菌去離子水為陰性對(duì)照，在冰面上常規(guī)加樣。在擴(kuò)增反應(yīng)開(kāi)始前，將“染料-蠟丸”置于反應(yīng)管中，緊閉管蓋，并移入便攜式LAMP儀上。反應(yīng)參數(shù)設(shè)置為65℃加熱60 min，熱蓋溫度為80℃，此為第一階段常規(guī)LAMP擴(kuò)增。其后，加熱至99℃，10 min，此為第二階段熔解蠟丸釋放染料、核酸染色和Bst酶滅活的過(guò)程。反應(yīng)全程由鋰電池供能，反應(yīng)結(jié)束后用步驟5制備的藍(lán)光檢測(cè)器照射，肉眼觀察結(jié)果，綠色為陽(yáng)性，桔色為陰性。

1.2.7目視LAMP擴(kuò)增的特異性與檢測(cè)限 擴(kuò)增產(chǎn)物由Sau3AI酶切FIP引物中的相應(yīng)酶切位點(diǎn)，通過(guò)電泳驗(yàn)證擴(kuò)增的特異性。檢測(cè)下限的測(cè)定：將質(zhì)粒用步驟3提取所得恙螨DNA溶液連續(xù)稀釋為1×104、1×103、1×102和1×101拷貝，并以無(wú)菌去離子水為陰性對(duì)照，其余按步驟6操作，目視判斷結(jié)果。同時(shí)利用外引物F3、B3作為普通PCR引物，擴(kuò)增前述系列濃度的質(zhì)粒樣本，并與LAMP進(jìn)行比較。

2 結(jié) 果

2.1引物設(shè)計(jì)結(jié)果 該組引物見(jiàn)表1。其檢測(cè)的靶標(biāo)為OtGroEL基因中一段237 bp的序列。

表1 Ot GroEL LAMP引物組

2.2“染料-蠟丸”制備 所制備的“染料-蠟丸”外觀為白色蠟狀圓柱體，直徑約4 mm，柱高約6 mm，放置進(jìn)普通PCR管內(nèi)，與管內(nèi)液體不接觸(圖1)。

注：A：成品“染料-蠟丸”；B：“染料-蠟丸”放置在普通PCR管內(nèi)。

2.3藍(lán)光檢測(cè)器 通過(guò)撥動(dòng)開(kāi)關(guān)，藍(lán)光檢測(cè)器可發(fā)出藍(lán)色光(圖2)。

注：A：普通LED玩具電筒；B：電筒的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，箭頭所指為白光LED燈珠；C：更換為藍(lán)光LED燈珠后，電筒發(fā)藍(lán)光；D：自制藍(lán)光檢測(cè)器成品。

2.4目視LAMP結(jié)果 在便攜式LAMP儀上完成第一階段反應(yīng)后，“染料-蠟丸”保持完整，在第二階段反應(yīng)完成后，蠟丸熔化，染料被自動(dòng)釋放到反應(yīng)液中，核酸被染色，陽(yáng)性對(duì)照管呈現(xiàn)亮麗的綠色，而陰性對(duì)照管呈桔黃色(圖3)。

注：A：陽(yáng)性反應(yīng)呈亮綠色 B：陰性反應(yīng)呈桔黃色。

2.5目視LAMP擴(kuò)增的特異性 瓊脂糖凝膠電泳顯示，LAMP產(chǎn)物經(jīng)Sau3AI酶切后，原典型Ladder樣條帶被切割為一條約120 bp 的條帶(圖4)。

注：M：DNA Marker；1：LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物；2：LAMP產(chǎn)物Sau3AI酶切。

2.6目視LAMP的檢測(cè)下限 將系列稀釋的質(zhì)粒作為樣品，在便攜式LAMP儀上完成目視LAMP的兩個(gè)階段反應(yīng)后，結(jié)果顯示該法檢測(cè)下限為1×102拷貝質(zhì)粒(圖5A)，而PCR法檢測(cè)下限為1×103拷貝質(zhì)粒(圖5B)。

注：M：DNA Marker；1：陰性對(duì)照；2：1×101拷貝質(zhì)粒；3：1×102拷貝質(zhì)粒；4：1×103拷貝質(zhì)粒；5：1×104拷貝質(zhì)粒。

3 討 論

LAMP技術(shù)是具有高敏感性和高特異性的核酸檢測(cè)方法，在病原體檢測(cè)領(lǐng)域具有較大的應(yīng)用潛力。該法不需要PCR的變溫循環(huán)，在65℃單一溫度下進(jìn)行核酸擴(kuò)增，擴(kuò)增效率極高，且不依賴昂貴的儀器，適合在現(xiàn)場(chǎng)推廣[12,14]。但是LAMP法也存在結(jié)果斷讀困難的問(wèn)題，反應(yīng)自然產(chǎn)生的白色沉淀肉眼觀察困難，如果反應(yīng)后開(kāi)蓋加入核酸染料，在提高結(jié)果可讀性的同時(shí)，也增加擴(kuò)增產(chǎn)物擴(kuò)增子污染實(shí)驗(yàn)體系的風(fēng)險(xiǎn)，限制了LAMP在條件受限地區(qū)的現(xiàn)場(chǎng)化應(yīng)用。本研究利用微晶蠟丸的凝熔特性，制備含有高敏感熒光核酸染料SYBR Green I的蠟丸，在反應(yīng)前投放在反應(yīng)管內(nèi)，從而避免了染料直接進(jìn)入反應(yīng)液抑制擴(kuò)增。在反應(yīng)的第二階段，蠟丸熔化為液態(tài)后，SYBR Green I的比重大，自然落入到反應(yīng)液中，受熱力影響自然與反應(yīng)液混勻，并將核酸染色。反應(yīng)結(jié)束后，一旦溫度低于微晶蠟的熔點(diǎn)，液態(tài)重新凝聚成固態(tài)，在LAMP反應(yīng)液的上層自然形成一道屏障，把擴(kuò)增產(chǎn)物封閉起來(lái)，避免反應(yīng)管意外開(kāi)啟導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)環(huán)境被擴(kuò)增子污染，造成持續(xù)的假陽(yáng)性[15]。

LAMP產(chǎn)物電泳后呈特征性Ladder樣條帶，可被適合的內(nèi)切酶切割，電泳可對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證。經(jīng)內(nèi)切酶Sau3AI消化后，OtGroELLAMP擴(kuò)增產(chǎn)物被切割成單一條帶，與預(yù)期一致。使用目視LAMP法檢測(cè)OtGroEL的下限為1×102拷貝質(zhì)粒，而同批樣本使用普通PCR法檢測(cè)下限為1×103拷貝質(zhì)粒，提示LAMP檢測(cè)的敏感性高于普通PCR法。LAMP反應(yīng)無(wú)需變溫，Bst酶在恒溫條件下持續(xù)高效延伸合成DNA產(chǎn)物，同時(shí)LAMP檢測(cè)反應(yīng)體系中的引物、酶的用量大，進(jìn)一步提高了產(chǎn)物量，甚至肉眼可見(jiàn)少量白色沉淀。LAMP高敏感性決定了其易受假陽(yáng)性困擾，尤其需要嚴(yán)格防止擴(kuò)增子對(duì)實(shí)驗(yàn)體系的污染。在病原體LAMP檢測(cè)開(kāi)發(fā)過(guò)程中，常用酶切和電泳來(lái)驗(yàn)證LAMP擴(kuò)增的特異性。酶切需要開(kāi)蓋取樣，電泳過(guò)程是開(kāi)放的，因此特別容易產(chǎn)生難以去除的擴(kuò)增子氣溶膠污染。在操作過(guò)程中如能做到人員、物品、場(chǎng)所的嚴(yán)格分離，則可很大程度地避免污染LAMP實(shí)驗(yàn)體系。

本研究首次應(yīng)用的LAMP儀的原型機(jī)，可以為L(zhǎng)AMP擴(kuò)增反應(yīng)提供恒溫的操作環(huán)境，設(shè)置簡(jiǎn)便，易于操作，具有一定的便攜性，在鋰電池的驅(qū)動(dòng)下，即可實(shí)現(xiàn)LAMP擴(kuò)增。將本儀器與“染料-蠟丸”目視LAMP法聯(lián)合應(yīng)用，在沒(méi)有市電供應(yīng)的場(chǎng)所，可供LAMP檢測(cè)順利開(kāi)展，使得該方法能夠更接近于現(xiàn)場(chǎng)的應(yīng)用。本研究新設(shè)計(jì)的針對(duì)OtGroEL靶點(diǎn)的LAMP引物，能夠檢測(cè)出1×102個(gè)質(zhì)粒拷貝，結(jié)合“染料-蠟丸”和便攜式LAMP儀，可以為現(xiàn)場(chǎng)條件下恙螨感染恙蟲(chóng)病東方體的檢測(cè)提供新的工具。