干雅平，樓超艷，朱巖，甘露，陳佳萍

（1.杭州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，浙江 杭州 310018；2.浙江大學(xué) 化學(xué)系，浙江 杭州 310000；3.浙江大學(xué)校醫(yī)院，浙江杭州 310027）

海洋環(huán)境中，有機(jī)污染物種類繁多，對(duì)這些有機(jī)污染物進(jìn)行監(jiān)測(cè)和控制對(duì)海洋生態(tài)系統(tǒng)的保護(hù)具有重要意義。內(nèi)分泌干擾物（endocrine disrupting compounds，EDCs）是一類廣泛存在于海洋環(huán)境的重要外源性污染物質(zhì)，也被稱為環(huán)境激素（environmental hormones），這類化合物會(huì)干擾生物體內(nèi)分泌系統(tǒng)的正常功能，影響人體的正常新陳代謝［1］。隨著社會(huì)的進(jìn)步和科技的發(fā)展，海洋生態(tài)安全越來越受關(guān)注，雙酚類化合物（bisphenols，BPs）作為一類典型的內(nèi)分泌干擾物，其在海洋環(huán)境中的分布亦廣受關(guān)注［2］。雙酚類化合物由2 個(gè)羥基苯酚通過橋接碳或其他化學(xué)結(jié)構(gòu)鍵合而成，成本低廉、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定。由于雙酚類化合物具有良好的延展性，被廣泛用作環(huán)氧樹脂和聚碳酸酯（PC）塑料生產(chǎn)中的原料單體和聚氯乙烯（PVC）塑料的添加劑［3］。因雙酚類化合物的無序排放，造成工業(yè)廢水、城市污水、地表河流、海洋水體及其水體沉積物中含有大量雙酚類污染物。因雙酚類化合物可以模擬雌激素活性，長(zhǎng)期接觸或攝入此類化合物會(huì)降低人類的生育能力，對(duì)人類生殖發(fā)育產(chǎn)生極其不利的影響。研究表明，雙酚類化合物還會(huì)導(dǎo)致乳腺癌、卵巢癌、睪丸癌等惡性腫瘤［4-5］，另外，對(duì)腎臟、神經(jīng)系統(tǒng)等亦具有毒性［6-7］。因此，必須嚴(yán)格分析和檢測(cè)海洋水體及沉積物中的雙酚類化合物，以促進(jìn)海洋生態(tài)環(huán)境的和諧發(fā)展。

建立快速、高效、綠色的分析方法，對(duì)海洋樣品中雙酚類化合物的檢測(cè)至關(guān)重要。雙酚類化合物的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）［8］、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography-mass spectrometry，LCMS）［9-10］、氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）［11-13］等，這些方法應(yīng)用廣泛，但均存在一定的不足。HPLC 法雖十分成熟，但對(duì)雙酚類化合物的分離檢測(cè)通常需要大量有毒有害有機(jī)溶劑作為流動(dòng)相，對(duì)操作人員及生態(tài)環(huán)境都存在潛在的不利影響；LC-MS 法因連接了質(zhì)譜檢測(cè)器，方法靈敏且選擇性佳，但儀器昂貴，設(shè)備維護(hù)費(fèi)用高，難以全面普及；GC-MS 法通常需經(jīng)衍生化處理才能對(duì)雙酚類化合物進(jìn)行分離檢測(cè)，而衍生化過程耗時(shí)、費(fèi)力，且需耗費(fèi)大量有害溶劑，此外，在進(jìn)行衍生化處理時(shí)，分析物的定量準(zhǔn)確性通常不佳（存在潛在的分析物損失）。而超臨界流體色譜（supercritical fluid chromatography，SFC）能有效克服上述方法的不足［14］。SFC 法是一種以超臨界態(tài)二氧化碳流體為流動(dòng)相的色譜分離技術(shù)，而超臨界態(tài)二氧化碳流體兼具氣體和液體的優(yōu)點(diǎn)，流體黏度小，擴(kuò)散性好，密度和溶解能力高（比氣體高）、綠色、無毒、化學(xué)性能穩(wěn)定且廉價(jià)，但因其為非極性流體，不具備分離洗脫雙酚類化合物的能力，需要在其中加入少量極性改性劑以調(diào)節(jié)流動(dòng)相的極性，實(shí)現(xiàn)對(duì)不同極性目標(biāo)分析物的最佳分離。

對(duì)海洋水體、海洋沉積物等復(fù)雜海洋樣品，由于樣品基質(zhì)較復(fù)雜，在對(duì)樣品中的雙酚類化合物進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，應(yīng)先做前處理以純化樣品。常用的前處理［15-16］方法有：固相萃取、分散固相萃取、固相微萃取、液液萃取（liquid-liquid phase extraction，LLE）等。本實(shí)驗(yàn)選擇液液萃取，首先，用乙腈等有機(jī)溶劑，通過鹽析作用輔助目標(biāo)物在兩相中的分配，萃取并去除樣品中的水分和干擾基質(zhì)。

本文建立了超臨界流體色譜法用于分析海洋水體和沉積物中雙酚A（BPAF）、雙酚AF（BPA）、雙酚C（BPC）、四溴雙酚A（TBBPA）4 種雙酚類化合物，先通過液液萃取對(duì)樣品進(jìn)行前處理，提取純化樣品，再通過優(yōu)化超臨界流體色譜條件，實(shí)現(xiàn)同時(shí)對(duì)4種雙酚類化合物的分離檢測(cè)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 試劑與儀器

超臨界流體色譜儀為日本島津公司旗下的Nexera UC 超臨界流體色譜系統(tǒng)，采用紫外檢測(cè)方法；SBL-5DTS超聲波恒溫清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；LG16B 高速離心機(jī)（雷勃爾，北京）；Millipore simplicity 超純水機(jī)（美國(guó)Millipore公司）。

雙酚類化合物標(biāo)準(zhǔn)品：BPAF（純度99.0%）、BPA（純度98.0%）、BPC（純度98.0%）、TBBPA（純度98.0%）購(gòu)自阿拉丁化學(xué)品公司（中國(guó)），化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1 所示，在配制以上標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)考慮純度因子。HPLC 所需色譜純級(jí)別的甲醇、乙腈等有機(jī)溶劑均購(gòu)自Tedia 公司（美國(guó)）。氯化鈉（分析純）、無水硫酸鎂（分析純）均購(gòu)自阿拉丁化學(xué)品公司（中國(guó)）。實(shí)驗(yàn)用水均為經(jīng)Millipore simplicity 超純水機(jī)（美國(guó)）凈化的二次去離子水。將不同水域的海洋水體及沉積物樣品保存于冰箱待用。

配制含有4 種雙酚類化合物的甲醇儲(chǔ)備液（200 mg·L-1）：準(zhǔn)確稱取適量的雙酚類化合物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，加入適量甲醇至標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)完全溶解，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成200 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液，超聲后低溫儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

配制含有4 種雙酚類化合物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：用甲醇逐級(jí)稀釋標(biāo)準(zhǔn)溶液，得到不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，低溫保存，臨配臨用。

1.2 樣品前處理

用移液槍準(zhǔn)確量取海洋水體樣品5.0 mL 于10 mL 離心管中，加入5 mL 乙腈混合均勻，溶液中加入1.0 g 無水硫酸鎂和1.0 g 氯化鈉，超聲輔助萃取5 min，以10 000 r·min-1離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移至自動(dòng)進(jìn)樣樣品瓶中，待SFC 進(jìn)樣分析，外標(biāo)法定量。用天平稱取海洋沉積物樣品5.0 g，操作過程同上。

圖1 4 種雙酚的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structures of four bisphenols

1.3 超臨界色譜分析條件

實(shí)驗(yàn)采用Nexera UC SFC 系統(tǒng)進(jìn)行超臨界流體色譜-紫外檢測(cè)器法分析。該系統(tǒng)由超臨界流體輸送 泵（LD-30ADSF）、改 性 劑 輸 送 泵（LC-20ADXR）、脫氣單元（DGU-20A5R）、自動(dòng)進(jìn)樣器（SIL-30A）、柱溫箱（CTO-20AC）、系統(tǒng)背壓調(diào)節(jié)器（SFC-30A）和系統(tǒng)控制器（CBM-20A）組成。雙酚類化合物通過WondaCract ODS-2 色譜柱（5 μm，4.6 mm×250 mm，Shimadzu，日本）進(jìn)行分離，采用超臨界態(tài)CO2+10%（v/v）CH3OH 對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行等度洗脫，總流速為2.0 mL·min-1、柱溫為36 ℃、系統(tǒng)背壓為12 MPa。經(jīng)紫外全波長(zhǎng)掃描，得到最佳檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm。為防止柱飽和，樣品進(jìn)樣量為5 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

在實(shí)驗(yàn)中，海洋樣品的純化主要通過液液萃取完成，在液液萃取過程中，萃取溶劑種類的選擇和超聲萃取時(shí)間的優(yōu)化對(duì)最終的萃取效果有重要影響。實(shí)驗(yàn)分別比較了甲醇、乙醇、乙腈和丙酮4 種萃取溶劑的萃取效果，4 種萃取溶劑對(duì)BPA、BPC、BPAF、TBBPA 等4 種雙酚類化合物的萃取率如圖2（a）所示。萃取過程中加入1.0 g 無水硫酸鎂和1.0 g 氯化鈉產(chǎn)生鹽析作用，以促進(jìn)雙酚類化合物在兩相中的分配，當(dāng)乙腈作為萃取溶劑時(shí)，對(duì)實(shí)際樣品中的雙酚類化合物的萃取率最高，因此，選擇乙腈作為最佳萃取溶劑。此外，在超聲輔助下進(jìn)行液液萃取，周期性的超聲波頻率可加快分子的傳質(zhì)過程，縮短萃取時(shí)間，提高萃取率。實(shí)驗(yàn)比較了不同萃取時(shí)間下（2～20 min），乙腈對(duì)目標(biāo)物的萃取率如圖2（b）所示，當(dāng)萃取時(shí)間為5 min 時(shí)，對(duì)4 種雙酚類化合物均有較高的萃取率，因此超聲輔助萃取時(shí)間選擇5 min。

圖2 液液萃取過程中萃取溶劑的選擇（a）和超聲輔助萃取時(shí)間的優(yōu)化（b）Fig.2 Selection of extraction solvent（a）and optimization of ultrasonic-assisted extraction time（b）for LLE

2.2 超臨界流體色譜條件探討

采用SFC 法對(duì)雙酚類化合物進(jìn)行分離，并對(duì)其分離條件進(jìn)行優(yōu)化。 雙酚類化合物通過WondaCract ODS-2 色譜固定相（5 μm，4.6 mm×250 mm，Shimadzu，日本）在超臨界流體色譜上進(jìn)行分離，當(dāng)以單一的非極性超臨界態(tài)二氧化碳作為流動(dòng)相時(shí)，對(duì)雙酚類化合物的洗脫能力較弱，通過加入一定比例的極性改性劑，增強(qiáng)了流動(dòng)相的洗脫效果，同時(shí)為使雙酚類化合物在超臨界流體色譜上得到最佳的分離效果，對(duì)柱溫、流速、系統(tǒng)背壓等超臨界流體色譜參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化。通過探究極性改性劑的比例以及柱溫、流速、系統(tǒng)背壓等參數(shù)對(duì)雙酚類化合物分離效果的影響，發(fā)現(xiàn)當(dāng)柱溫為36 ℃、流速為2.0 mL·min-1、系統(tǒng)背壓為12 MPa，以超臨界態(tài)二氧化碳/甲醇=90/10（v/v）為流動(dòng)相時(shí)，4 種雙酚類化合物均獲得了最優(yōu)的色譜峰及響應(yīng)值。

2.2.1 極性改性劑的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)以甲醇作為極性改性劑，探究了不同流動(dòng)相配比對(duì)分離效果的影響。當(dāng)二氧化碳與甲醇體積比為8%～10%時(shí)，4 種雙酚類化合物的保留時(shí)間如圖3（a）所示，由此可知，隨著二氧化碳與甲醇體積比的增加，流動(dòng)相對(duì)4 種雙酚類化合物的洗脫能力逐漸增強(qiáng)，綜合考慮分離度和色譜峰形，最終選擇二氧化碳/甲醇=90/10（v/v）作為流動(dòng)相。

2.2.2 柱溫、流速以及系統(tǒng)背壓的優(yōu)化

除對(duì)固定相和流動(dòng)相進(jìn)行優(yōu)化外，對(duì)柱溫、流速、系統(tǒng)背壓等超臨界流體色譜參數(shù)也進(jìn)行了優(yōu)化?？傮w來說，柱溫、流速及系統(tǒng)背壓的變化會(huì)改變流動(dòng)相的密度，進(jìn)而影響流動(dòng)相對(duì)目標(biāo)組分的溶劑化能力和洗脫能力，其對(duì)分離雙酚類化合物的影響分別如圖3（b）、（c）和（d）所示。在分離4 種雙酚類化合物時(shí)，柱溫升高會(huì)延長(zhǎng)分離時(shí)間，且影響是非線性的，當(dāng)柱溫大于36 ℃時(shí)，流動(dòng)相對(duì)目標(biāo)化合物洗脫能力的影響逐漸減弱，見圖3（b）。隨著流速的增大，流動(dòng)相的密度和洗脫能力增大，目標(biāo)物在固定相上的保留時(shí)間隨之縮短，見圖3（c）。隨著系統(tǒng)背壓的升高，4 種雙酚類化合物的洗脫時(shí)間逐漸縮短。綜合考慮雙酚類化合物的分離度和分離時(shí)間，最終選擇柱溫36 ℃、流速2.0 mL·min-1、系統(tǒng)背壓12 MPa，實(shí)現(xiàn)了5 min 內(nèi)對(duì)雙酚類化合物的快速、完全分離。

圖3 極性改性劑比例（a）、柱溫（b）、流速（c）和系統(tǒng)背壓（d）對(duì)分離的影響Fig.3 The effect of modifier percentage（a），temperature（b），flow rate（c），back pressure（d）on separation

2.3 線性關(guān)系及檢出限

由于實(shí)際樣品基質(zhì)復(fù)雜多樣，樣品經(jīng)前處理后可能存在基質(zhì)干擾，因此對(duì)本方法的基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行了評(píng)價(jià)。本實(shí)驗(yàn)中，前處理方法對(duì)實(shí)際樣品中4 種雙酚類化合物的基質(zhì)效應(yīng)范圍均為?2.5%～4.1%，說明該方法可以有效消除基質(zhì)干擾?？紤]基質(zhì)效應(yīng)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響極小，本實(shí)驗(yàn)采用外標(biāo)法直接對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行定量分析。將4 種雙酚類化合物的甲醇溶液 配 制 成 質(zhì) 量 濃 度 分 別 為0.10，0.20，0.50，1.00，2.00，5.00，20.0 mg·L-1的一系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，利用外標(biāo)法定量，繪制峰面積（Y）-濃度（X）標(biāo)準(zhǔn)曲線。線性范圍、線性方程、線性相關(guān)系數(shù)、檢出限（LODs）及定量限（LOQs）等結(jié)果見表1。由表1 可知，4 種雙酚類化合物在線性范圍內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)均高于0.998 9，檢出限為0.03～0.06 mg·L-1。

表1 4 種雙酚類化合物的線性相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限（n=5）Table 1 Linearity，correlation coefficient，LODs and LOQs of four target bisphenols（n=5）

2.4 樣品分析

實(shí)驗(yàn)共選取3 處海域的海洋水體以及海洋沉積物作為實(shí)驗(yàn)樣品，通過液液萃取對(duì)樣品進(jìn)行前處理，用超臨界流體色譜法測(cè)定樣品，得到：（1）在海域1的海洋水體樣品和沉積物樣品中均檢出了BPAF，質(zhì) 量 分 數(shù) 分 別 為0.086 和0.095 μg·mL-1，未 檢 出BPA、BPC 和TBBPA；（2）在海域2 的海洋水體樣品和沉積物樣品中，4 種雙酚類化合物均未檢出；（3）在海域3 的海洋水體樣品中檢出了BPAF，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.102 μg·mL-1，沉積物樣品中4 種雙酚類化合物均未檢出。其中，海域1 沉積物樣品4 的色譜圖如圖4 所示，超臨界流體色譜法在5 min 內(nèi)即可有效分離出4 種雙酚類化合物。

圖4 實(shí)際海洋樣品和雙酚類化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液的超臨界流體色譜譜圖Fig.4 Chromatograms of marine samples and bisphenols standard solution separated by SFC

2.5 回收率及精密度

實(shí)驗(yàn)探究了4 種雙酚類化合物在樣品中的回收率，操作過程如下：

對(duì)實(shí)際樣品進(jìn)行0.10，0.20，0.50 mg·L-13 個(gè)濃度水平的加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，每個(gè)濃度平行測(cè)定3 次，通過液液萃取對(duì)加標(biāo)樣品進(jìn)行處理，采用SFC 法對(duì)加標(biāo)樣品進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算加標(biāo)回收率，結(jié)果見表2。由表2 知，加標(biāo)回收率為85.7%～112.0%；精密度≤10.3%，方法重現(xiàn)性佳。

4 結(jié) 論

內(nèi)分泌干擾物是存在于海洋生態(tài)環(huán)境中具有持久性危害的外源性污染物質(zhì)，雙酚類化合物作為一類典型的內(nèi)分泌干擾物對(duì)海洋生態(tài)環(huán)境具有重要影響，對(duì)海洋樣品中雙酚類化合物的濃度進(jìn)行檢測(cè)、追蹤，對(duì)其分布進(jìn)行監(jiān)測(cè)，對(duì)海洋生態(tài)研究具有重要意義。建立了由液液萃取和超臨界流體色譜法同時(shí)測(cè)定海洋水體及沉積物中的BPA、BPAF、BPC 和TBBPA 4 種雙酚類化合物的方法，在線性濃度范圍內(nèi)4 種雙酚類化合物均具有良好的線性，且線性相關(guān)系數(shù)均高于0.998 9，方法的檢出限為0.03～0.06 mg·L-1，回收率為85.7%～112.0%，具有良好的重現(xiàn)性。實(shí)現(xiàn)了同時(shí)對(duì)海洋水體及沉積物中常見的雙酚類化合物的快速檢測(cè)，方法的選擇性好、精密度和回收率高，且快速高效，可廣泛應(yīng)用于海洋環(huán)境中雙酚類化合物的監(jiān)測(cè)、追蹤、風(fēng)險(xiǎn)研究及評(píng)估等工作。

表2 4 種雙酚類化合物在空白海水樣品中的回收率（n=3）Table 2 Recoveries of four bisphenols in blank marine samples（n=3）