巫偉峰， 陳明杰， 陳國躍， 陳發(fā)興

(1. 福建農(nóng)林大學： a. 園藝學院， b. 海峽聯(lián)合研究院 園藝植物生物學及代謝組學研究中心， 福建 福州 350002；2. 中國科學院廬山植物園， 江西 九江 332900； 3. 龍海市農(nóng)業(yè)科學研究所， 福建 龍海 363100)

果實中有機酸和VC含量是評價果實品質(zhì)的重要指標，目前多采用高效液相色譜(HPLC)法進行測定[1-2]，但隨著色譜技術的快速迭代升級[3]，與HPLC法相比，超高效液相色譜(UPLC)法具有檢測用時更短、色譜分離能力和分離度更高、溶劑消耗更少等優(yōu)勢，可達到化學成分精密檢測的目的[4]。

李(PrunussalicinaLindl.)是傳統(tǒng)水果之一，目前已采用HPLC法對其果實中有機酸和VC含量[5-8]進行了測定。為提高檢測效率，探索更為靈敏的檢測方法，作者以4個李品種(品系)果實為實驗材料，采用UPLC法測定了7個有機酸成分及VC含量，以期為李果實品質(zhì)檢測和評價提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試的4個李品種(品系)為‘皇冠李’(‘Huangguan’)、‘黑琥珀李’(‘Blackamber’)、‘葡萄李’(‘Elodrao’)和‘西瓜李’(‘Xigua’)，均種植于福建省寧德市古田縣。各品種(品系)分別選擇3株健壯且無病蟲害的植株，從樹冠外圍的東、南、西、北、中5個方位各選取形態(tài)和成熟度相近的果實5枚，用冰袋保存帶回實驗室，快速將果皮與果核分離；將中果皮切碎，混勻，經(jīng)液氮速凍后置于-40 ℃冰箱中保存、備用。

主要儀器和試劑：ACQUITY UPLC H-Class超高效液相色譜儀(配有PDA eλ檢測器，美國Waters公司)，Milli-Q Reference超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)，Enppendorf 5810R離心機(德國Enppendorf公司)，KQ3200DA超聲波清洗機(昆山舒美超聲儀器有限公司)。蘋果酸(批號09172)、檸檬酸(批號46933)、酒石酸(批號1643340)、琥珀酸(批號1623411)、富馬酸(批號PHR1270)、草酸(批號41706)、乙酸(批號71251)和VC(批號47863)的標準品均購自美國Sigma公司，所有標準品純度均為色譜純及以上級別。

1.2 方法

1.2.1 UPLC色譜條件 色譜柱為ACQUITY UPLC HSS T3(2.1 mm×100 mm， 1.8 μm)，流動相為體積分數(shù)0.025%H3PO4溶液，流速0.2 mL·min-1，柱溫30 ℃，進樣量1 μL。

1.2.2 標準曲線繪制 分別精密稱取40.0 mg蘋果酸、40.0 mg檸檬酸、20.0 mg酒石酸、100.0 mg琥珀酸、0.4 mg富馬酸、4.0 mg草酸和4.0 mg VC標準品，同時吸取10.0 mg·mL-1乙酸標準品溶液10.0 mL，混合后用超純水溶解并定容至100 mL，獲得混合標準液(蘋果酸、檸檬酸、酒石酸、琥珀酸、富馬酸、草酸、VC和乙酸的質(zhì)量濃度分別為0.400、0.400、0.200、1.000、0.004、0.040、0.040和1.000 mg·mL-1)，按1、5、10、50和100倍進行梯度稀釋，0.22 μm濾膜過濾。按上述色譜條件測定各有機酸成分及VC標準品的峰面積，以峰面積為縱坐標(y)、各標準品質(zhì)量濃度為橫坐標(x)繪制標準曲線。

蘋果酸標準曲線方程為y=12 422.78x+4 639.69(R2=0.999 97)，線性范圍0.004 0～0.400 0 mg·mL-1；檸檬酸標準曲線方程為y=14 047.87x+933.01(R2=0.999 76)，線性范圍0.004 0～0.400 0 mg·mL-1；酒石酸標準曲線方程為y=21 855.25x+3 901.52(R2=0.999 88)，線性范圍0.002 0～0.200 0 mg·mL-1；琥珀酸標準曲線方程為y=12 587.65x+964.60(R2=0.999 89)，線性范圍0.010 0～1.000 0 mg·mL-1；富馬酸標準曲線方程為y=5 036 215.44x+717.37(R2=0.999 96)，線性范圍0.000 0～0.004 0 mg·mL-1；草酸標準曲線方程為y=133 698.45x+1 318.27(R2=0.999 62)，線性范圍0.000 4～0.040 0 mg·mL-1；乙酸標準曲線方程為y=16 566.22x+245.35(R2=0.999 99)，線性范圍0.010 0～1.000 0 mg·mL-1；VC標準曲線方程為y=133 384.75x-1 101.82(R2=0.999 99)，線性范圍0.000 4～0.040 0 mg·mL-1。

1.2.3 果實中有機酸和VC含量測定 精密稱取各樣品1 g，研磨至勻漿，加10 mL超純水，室溫超聲(300 W)提取30 min，1 000 r·min-1常溫離心10 min；取上清液，殘渣用8 mL超純水重復提取1次并離心；合并上清液，用超純水定容至20 mL，0.22 μm濾膜過濾，按上述色譜條件進樣測定，重復3次。根據(jù)峰面積和標準曲線計算樣品中各有機酸成分和VC含量。

1.2.4 方法學考察 精密度考察：取‘葡萄李’果實提取液1 mL，按上述色譜條件重復進樣測定5次，蘋果酸、檸檬酸、酒石酸、琥珀酸、富馬酸、草酸、乙酸和VC峰面積的RSD值分別為1.5%、1.1%、0.3%、0.8%、1.6%、0.2%、0.3%和0.4%，表明儀器精密度良好。

加樣回收率考察：取‘葡萄李’果實提取液5 mL，加入5 mL稀釋10倍的混合標準液，按上述色譜條件重復進樣測定5次，計算加樣回收率。蘋果酸、檸檬酸、酒石酸、琥珀酸、富馬酸、草酸、乙酸和VC加樣回收率的RSD值分別為0.63%、1.73%、0.49%、0.14%、0.00%、0.57%、0.14%和0.58%，表明該測定方法準確度較高。

重復性考察：精密稱取‘葡萄李’樣品5份，按上述方法制備提取液，并按上述色譜條件進樣測定。蘋果酸、檸檬酸、酒石酸、琥珀酸、富馬酸、草酸、乙酸和VC含量的RSD值分別為3.80%、1.43%、2.35%、5.57%、0.00%、4.25%、4.12%和2.13%，表明該測定方法重復性良好。

1.3 數(shù)據(jù)處理和分析

采用EXCEL 2019軟件進行數(shù)據(jù)處理，采用SPSS 20.0軟件進行ANOVA方差分析。

2 結(jié)果和分析

供試的4個李品種(品系)果實中有機酸成分和VC的含量見表1。結(jié)果顯示：4個李品種(品系)果實中有機酸含量變幅較大，均以蘋果酸含量最高(1.172 0～1.991 1 mg·g-1)，酒石酸含量次之(0.063 8～0.418 9 mg·g-1)，富馬酸含量最低(0.000 1 mg·g-1以下)，檸檬酸、琥珀酸、草酸和乙酸含量為0.008 4～0.071 5 mg·g-1；有機酸總含量和VC含量變幅較小，分別為1.356 2～2.162 0和0.017 0～0.022 8 mg·g-1。

表1 李品種(品系)果實中有機酸成分與VC含量的比較

不同品種(品系)間，‘葡萄李’果實中蘋果酸、檸檬酸、酒石酸、乙酸和VC的含量以及有機酸總含量總體上最低，但其琥珀酸和草酸含量則最高，且多數(shù)指標與其他品種(品系)存在顯著(P<0.05)差異；‘黑琥珀李’果實中蘋果酸和VC的含量以及有機酸總含量均最高，但其琥珀酸和乙酸含量則最低；‘西瓜李’果實中檸檬酸、酒石酸和乙酸的含量最高，但其草酸含量則最低；供試的4個品種(品系)中，以‘皇冠李’果實中各有機酸成分和VC的含量以及有機酸總含量較為均衡，處于中等偏高的水平。

3 討論和結(jié)論

上述測定結(jié)果表明：采用UPLC法測定李果實中的蘋果酸、檸檬酸、酒石酸、琥珀酸、富馬酸、草酸、乙酸和VC含量，具有操作簡便、重復性好的優(yōu)點。

由測定結(jié)果可知：‘皇冠李’、‘黑琥珀李’、‘葡萄李’和‘西瓜李’果實均以蘋果酸為主要有機酸成分，根據(jù)陳發(fā)興等[9]劃分的果實類型可將其歸為蘋果酸型果實。劉碩等[5]、王小紅等[6]和李鵬等[10]的研究結(jié)果也顯示其他李品種(品系)果實的有機酸成分也以蘋果酸含量最高，可見不同品種(品系)李果實中有機酸的主要組成成分總體相似。供試的4個品種(品系)中，有機酸總含量和VC含量均以‘黑琥珀李’果實最高、‘葡萄李’果實最低，且‘皇冠李’、‘黑琥珀李’和‘西瓜李’果實間無顯著差異，且以‘皇冠李’果實中各有機酸成分和VC的含量以及有機酸總含量較為均衡。供試的4個李品種(品系)果實中有機酸的組成比例存在明顯差異，這種差異除與各品種本身的遺傳特性有關外，還可能與種植地的氣候和土壤因子以及栽培管理措施有關。

本文對4個李品種(品系)果實中有機酸和VC含量的測定結(jié)果可為篩選低酸、高VC含量的李品種(品系)提供依據(jù)，但本文僅涉及有機酸和VC含量，而果實中的可溶性糖含量、糖酸比和香氣等指標也是評價果實品質(zhì)的重要依據(jù)，因而，后期將進一步建立包含多項品質(zhì)指標的多維評價體系，以期為建立李品種(品系)系統(tǒng)、全面的科學評價體系提供參考依據(jù)。