何國振 邱科穎 李明曉，2 何卓航 呂秉鼎 張麗霞 湯麗云

（1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣州 510006；2. 珠海市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，珠海 519000；3. 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所云南分所，云南省南藥可持續(xù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，景洪 666100；4. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣州 510642）

陽春砂（Amomum villosum Lour.）來源于姜科（Zingiberaceae）豆蔻屬（Amomum）多年生常綠草本植物［1］，入藥部位為其干燥成熟的果實(shí)，是我國著名的“四大南藥”之一。陽春砂有化濕開胃、溫脾止瀉、理氣安胎的功效，主治脾胃氣滯、宿食不消、腹痛痞脹，是我國傳統(tǒng)的大宗常用藥材，具有1300多年的應(yīng)用歷史［2～3］。目前，陽春砂主要分布在廣東、廣西、云南和福建等地，其中又以廣東陽春產(chǎn)的品質(zhì)最佳［4］。陽春砂是砂仁的主流品種，砂仁的市場需求量大，估計(jì)每年超過2.2×106kg，相關(guān)產(chǎn)業(yè)市場需求量超過100 億元人民幣［5］。而國內(nèi)陽春砂的產(chǎn)量約為1.6×106kg，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足市場的需求［5］。

擴(kuò)大栽培面積可以提高陽春砂的總產(chǎn)量以滿足市場需求。種苗的獲得是擴(kuò)大栽培的關(guān)鍵，目前生產(chǎn)上陽春砂種苗來源于種子繁殖和分株繁殖兩種方式，且分株繁殖是主要的方式。種子繁殖的優(yōu)勢是繁殖系數(shù)高；缺點(diǎn)是需要消耗昂貴的種子，子代藥材的質(zhì)量產(chǎn)生分化。陽春砂種子采收后至少要濕沙層積處理60 d 才能達(dá)到67.2%的萌發(fā)率［6］，相比分株繁殖技術(shù)顯得煩瑣。分株繁殖的不足是繁殖系數(shù)低，但能夠保留親代的優(yōu)良特性［7］。實(shí)踐中常常取帶部分根狀莖的陽春砂兩年或以上直立莖作為種苗，帶紅色根狀莖芽的種苗更是優(yōu)質(zhì)。雖然陽春砂植株的分株能力強(qiáng)，一年至少新生9倍的直立莖，但只取直立莖作為種苗的生產(chǎn)技術(shù)，要消耗許多的直立莖，影響正常生產(chǎn)。沒有直立莖的根狀莖將會(huì)因缺乏營養(yǎng)而枯死。陽春砂的根狀莖有20 個(gè)左右的節(jié)［8］，理論上每個(gè)節(jié)可以再生一株植株。如果用扦插繁殖技術(shù)進(jìn)行陽春砂的營養(yǎng)繁殖，并能利用根狀莖作為插穗，將可以大幅度提高繁殖系數(shù)。

生長素可以促進(jìn)插穗的根發(fā)生和生長［9］，其中萘乙酸（NAA）誘發(fā)的根較粗［7］，更利于幼苗的成活。為了提高陽春砂營養(yǎng)繁殖系數(shù)，本文探討陽春砂扦插繁殖的方法。用NAA處理陽春砂不同的插穗，考察其對成活率等指標(biāo)的影響，以期挖掘更多可用的插穗。與分株繁殖相比，扦插繁殖除了可以提高繁殖系數(shù)外，其種苗的體積比分株繁殖的小，有利于運(yùn)輸；而且，插穗可以用清園出來的陽春砂根狀莖，這些根狀莖本來是被丟棄的，如果可以用來扦插，則可實(shí)現(xiàn)“廢物”利用。目前，關(guān)于陽春砂的扦插繁殖技術(shù)未見報(bào)道。扦插繁殖可以豐富陽春砂的育苗手段，對于陽春砂的生產(chǎn)有著積極的意義。

1 材料

1.1 扦插材料

實(shí)驗(yàn)材料選自廣州中醫(yī)藥大學(xué)大學(xué)城校區(qū)時(shí)珍山的陽春砂蔭棚（以黑色網(wǎng)布覆蓋頂部和四周的大棚）內(nèi)的陽春砂植株。材料有3 種，分別是根狀莖莖尖、根狀莖和直立莖蘆頭（如圖1）。根狀莖莖尖為當(dāng)年生的莖尖及以下25～30 cm。根狀莖為兩年生的長25～30 cm莖段。直立莖蘆頭是兩年生的蘆頭及蘆頭以上直立莖25～30 cm。

1.2 試劑

α-萘乙酸（上海伯奧生物科技有限公司批號：070811）。

2 方法

2.1 插穗的處理

將實(shí)驗(yàn)材料初步修整后置于蒸餾水中，將根狀莖莖尖在下端剪平，上端為莖尖不用修剪；將根狀莖在水中兩端剪平；將直立莖蘆頭部分下端剪平，上端直立莖部分也剪平（見圖1）。處理后3 種插穗的長度均在25～30 cm。設(shè)置0、100、200、300、500 mg·L-1共5 個(gè)NAA 的濃度梯度，將根狀莖莖尖和根狀莖整體浸泡在不同濃度的NAA 處理液中，插穗直立莖蘆頭則僅蘆頭部分浸泡于NAA處理液中。所有處理的處理時(shí)間為2 h。

2.2 扦插方法

扦插的基質(zhì)配方是營養(yǎng)土∶園土∶珍珠巖＝3∶3∶1?；|(zhì)事先經(jīng)過曝曬消毒，后分裝到塑料長花盆（長×寬×高=50 cm×15 cm×15 cm）和塑料圓花盆（口徑25 cm，深度30 cm）中，用放置過夜的自來水澆透。將根狀莖莖尖和根狀莖整根橫埋于塑料長花盆中，深度為2～3 cm，每盆5 個(gè)插穗；將直立莖蘆頭豎插于圓花盆中，以埋沒蘆頭部分為宜，每盆1 個(gè)插穗。3 種材料的每種處理分別扦插10 個(gè)插穗，重復(fù)3次。

2.3 插后管理

將有插穗的花盆置于陽棚（以透明薄膜蓋頂?shù)拇笈铮﹥?nèi)的架子上，避免陽光直曬；視基質(zhì)濕度適當(dāng)澆水，以保持基質(zhì)濕潤為宜；溫度為外界氣溫，實(shí)驗(yàn)期間大部分時(shí)間處于13～25℃。及時(shí)除雜草。

2.4 結(jié)果統(tǒng)計(jì)

扦插后每周觀察1次插穗的外部形態(tài)變化，于第75 d 統(tǒng)計(jì)各插穗的成活率、生根率、出芽率、根及芽相關(guān)指標(biāo)。插穗經(jīng)過75 d 培養(yǎng)，出現(xiàn)了不同的生長情況：生根發(fā)芽、只生根、只發(fā)芽、不生根不發(fā)芽但存活、枯萎腐爛。統(tǒng)計(jì)除枯萎腐爛外還存活的插穗，計(jì)算存活率（living rate）；出芽率統(tǒng)計(jì)包括生根發(fā)芽和只發(fā)芽的插穗，根狀莖莖尖的發(fā)芽有莖尖生長和再生芽萌發(fā)兩種情況，兩種情況產(chǎn)生的新芽都被統(tǒng)計(jì)；生根率統(tǒng)計(jì)包括生根發(fā)芽和只生根的插穗。統(tǒng)計(jì)有根和/或芽插穗的根數(shù)量、根長、根直徑、芽數(shù)量、芽長、芽直徑等指標(biāo)。根直徑和芽直徑分別用游標(biāo)卡尺基部5 mm 處測量。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用xˉ±s 表示，用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同濃度NAA 處理對陽春砂3 種插穗存活率的影響

分別用濃度為0、100、200、300、500 mg·L-1的NAA 處理扦插，75 d 后統(tǒng)計(jì)存活率（見圖2）。圖2結(jié)果表明，未經(jīng)NAA 處理的3 種插穗也可以存活，根狀莖莖尖的存活率最高達(dá)到83.3%，直立莖蘆頭存活率最低為70%。經(jīng)過NAA 處理后，各插穗的存活率與NAA 濃度呈拋物線關(guān)系，存活率峰值都出現(xiàn)在200 mg·L-1NAA 處理時(shí)。根狀莖莖尖NAA處理的存活率峰值為100%，比對照顯著高17.7%，但與100 和300 mg·L-1NAA 處理的存活率沒有顯著性差異；500 mg·L-1NAA處理的根狀莖莖尖的存活率呈下降趨勢，與對照比較沒有顯著性差異。根狀莖NAA 處理的存活率峰值為96.7%，比對照顯著高23.4%，但與其余3 個(gè)處理的存活率沒有顯著性差異。直立莖蘆頭的存活率峰值為96.7%，比對照顯著高26.7%，也顯著高于100 mg·L-1NAA 處理，但與300和500 mg·L-1NAA 處理的存活率沒有顯著性差異。

3.2 不同濃度NAA 處理對陽春砂3 種插穗出芽率的影響

存活率表示的是扦插后第75天插穗還活著沒有枯死的插穗，這些插穗包括了出芽和/或生根的插穗，也包括了肉眼觀察沒有生長但沒有死亡的插穗。能夠出芽的插穗才有真正成活的可能，因此統(tǒng)計(jì)了插穗的出芽率（見圖3）。

與存活率相似，出芽率與NAA 處理濃度的關(guān)系也呈拋物線。根狀莖莖尖和根狀莖兩種插穗的峰值都處于200 mg·L-1NAA處理時(shí)；直立莖蘆頭的峰值出現(xiàn)在100 mg·L-1NAA 處理，但與200 mg·L-1NAA處理的沒有顯著性差異。根狀莖莖尖、根狀莖和直立莖蘆頭的最高出芽率分別是33.3%、53.3%和70.0%，各自顯著高于對照13.3%、50.3%和53.3%。與存活率明顯不同的是，3種插穗的對照出芽率都很低。根狀莖對照的出芽率只有3.3%，根狀莖莖尖和直立莖蘆頭，分別是10.0%和23.3%。

3.3 不同濃度NAA 處理對陽春砂3 種插穗生根率的影響

插穗要生長，必須分化出根。為了進(jìn)一步比較NAA 處理對3 種插穗的影響，統(tǒng)計(jì)了插穗的生根率（見圖4）。結(jié)果表明，與存活率和出芽率類似，生根率與NAA 處理濃度也呈現(xiàn)拋物線關(guān)系。根狀莖莖尖、根狀莖和直立莖蘆頭3種插穗的生根率峰值都出現(xiàn)在200 mg·L-1NAA 處理，分別為66.7%、36.7%和56.7%，各自顯著比對照高43.3%、26.7%和53.4%。根狀莖莖尖、根狀莖和直立莖蘆頭的對照的生根率，表現(xiàn)出從高到低的與生存率相似的趨勢，分別是23.3%、10.0%和3.3%。

200 mg·L-1NAA 處理根狀莖莖尖的生根率與300 和500 mg·L-1NAA 處理的沒有顯著性差異；其他3 個(gè)濃度NAA 處理的生根率與對照及相互之間也都沒有顯著性差異。200 mg·L-1NAA 處理根狀莖的生根率，除顯著高于對照外，也高于其他3 個(gè)處理；與根狀莖莖尖的情況類似，其他3 個(gè)濃度NAA 處理的生根率與對照及相互間都沒有顯著性差異。200 mg·L-1NAA處理的直立莖蘆頭的生根率顯著高于其他3 個(gè)NAA處理；100 mg·L-1NAA處理的生根率也顯著高于對照，但與300 和500 mg·L-1NAA處理的沒有顯著性差異；300和500 mg·L-1NAA處理的生根率與對照及相互間沒有顯著性差異。

3.4 陽春砂3種插穗的芽和根再生方式

與木本植物的莖不同，陽春砂有直立莖和根狀莖兩種莖。直立莖是從根狀莖上分化出來的，根狀莖分化出直立莖后，在鄰近直立莖后端的根狀莖上又分生出3 條新的根狀莖［8］。根狀莖是沿地表生長，而直立莖向上生長。直立莖的莖短，下端基部形成蘆頭，蘆頭上是由多個(gè)葉鞘構(gòu)成的假莖［10］，葉鞘從短莖長出，并包裹著短莖。

根據(jù)陽春砂莖的生長習(xí)性，根狀莖莖尖和根狀莖兩種插穗被平放淺埋于基質(zhì)中，直立莖蘆頭扦插于基質(zhì)中。扦插75 d后，發(fā)現(xiàn)3種插穗分生芽和根的方式有差異（見圖5）。沒有受NAA 處理的根狀莖莖尖，只見原來的莖尖生長（見圖5A）；NAA 處理的根狀莖莖尖，原來的莖尖能夠繼續(xù)生長（見圖5C），也可以從插穗中的節(jié)上重新分化出芽（見圖5B），插穗中間有芽分化的莖尖的生長受到抑制；根可以從各個(gè)節(jié)上長出（見圖5：J～L）。對于根狀莖，無論是處理還是對照，芽和根都從節(jié)上長出（見圖5：D～E，M～O），其中芽以靠近插穗生物學(xué)上端的切口的節(jié)上長出居多。直立莖蘆頭插穗的假莖部分（葉鞘）枯萎，在蘆頭或蘆頭下端的莖部分分生出芽和根（見圖5：G～I(xiàn)，P～R）。

3種插穗以直立莖蘆頭分生出的芽生長最快。

3.5 不同濃度NAA 處理對根狀莖莖尖和根狀莖的再生根生長的影響

為了進(jìn)一步考察NAA對根狀莖莖尖和根狀莖兩種插穗再生的影響，測量了它們的再生根生長指標(biāo)（見表1～2）。不同濃度NAA 處理后，根狀莖莖尖的根數(shù)量、根長度、根直徑都呈現(xiàn)拋物線狀的濃度關(guān)系，3 個(gè)指標(biāo)的峰值都處于200 mg·L-1NAA處理。200 mg·L-1NAA 處理的根狀莖莖尖再生根的數(shù)量比對照顯著多56.7%；根長度比對照顯著長82.6%；高于或低于200 mg·L-1濃度的NAA 處理，這兩個(gè)指標(biāo)都下降。200 mg·L-1NAA 處理的根直徑顯著比對照粗29.2%，但是提高NAA 的濃度，根直徑變化沒有顯著性差異。

表1 不同濃度NAA 處理對根狀莖莖尖根數(shù)量、根長和根直徑的影響Table 1 The effect of treatments with different concentrations of NAA on root number，length and diameter of the tip of rhizome

表2 不同濃度NAA 處理對根狀莖根數(shù)量、根長和根直徑的影響Table 2 The effect of treatments with different concentrations of NAA on root number，length and diameter of rhizome

根狀莖受不同濃度的NAA 處理后，再生根的數(shù)量和直徑大小與對照沒有顯著性差異；根的長度表現(xiàn)出劑量關(guān)系，200 mg·L-1NAA處理的根長度最長，顯著比對照長203.5%，但是與100 和300 mg·L-1NAA處理的沒有顯著性差異。

3.6 不同濃度NAA 對直立莖蘆頭再生芽生長的影響

由于直立莖蘆頭的再生芽在3 種插穗中生長最快，本研究選擇了考察芽生長指標(biāo)來進(jìn)一步判斷NAA 對直立莖蘆頭插穗再生的影響（見表3）。不同濃度的NAA 處理后，再生芽的數(shù)量與對照沒有顯著性差異。芽的長度呈現(xiàn)濃度效應(yīng)，以200 mg·L-1NAA 處理的芽最長，比對照顯著長25.2%，但與100 mg·L-1NAA 處理的沒有顯著性差異。提高NAA 的濃度，再生芽的長度顯著性下降。芽的直徑也是以200 mg·L-1NAA 處理的最大，比對照顯著大35.2%，但與100 和200 mg·L-1NAA 處理的沒有顯著性差異。500 mg·L-1NAA 處理的再生芽的粗度顯著性下降。

表3 不同濃度NAA 處理對直立莖蘆頭芽數(shù)量、芽長和芽直徑的影響Table 3 The effect of treatments with different concentrations of NAA on bud number，length and diameter of the stem basal

4 討論

陽春砂是著名的四大南藥之首［11］，具有很高的藥用和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。然而，超低的單位產(chǎn)量急需擴(kuò)大栽培面積。扦插是一個(gè)最好且經(jīng)濟(jì)的營養(yǎng)繁殖方法［12］，可以獲得與親代相同的基因型，以保障藥材質(zhì)量。本文正是基于陽春砂生產(chǎn)實(shí)踐的需求，探索了陽春砂扦插繁殖的方法。無論是對照還是NAA 處理，陽春砂3 種插穗扦插后75 d 都能再生成苗，說明扦插可以成為陽春砂營養(yǎng)繁殖的一條可行途徑。本研究的直立莖蘆頭扦插方法與目前生產(chǎn)上用的分株繁殖方法比較接近。然而，分株繁殖只是利用了直立莖和少量的根狀莖莖尖作為繁殖材料，與扦插繁殖比較，繁殖系數(shù)比較低。

木本植物的扦插過程，先出現(xiàn)芽的分化，然后分化出根，但分化出芽的插穗不一定能夠分化出根，沒有根的插穗隨著扦插時(shí)間的延長而枯萎。多數(shù)扦插研究的扦插時(shí)間是60 d 左右［12］，然而，陽春砂3種插穗在扦插75 d后，還出現(xiàn)插穗肉眼觀察既沒有芽或根再生卻又不死亡的現(xiàn)象。為了準(zhǔn)確描述這種現(xiàn)象，本文使用了存活率而不是成活率（survival rate）的概念。成活率是指能夠分化出芽或根的插穗的百分率。陽春砂3 種插穗的存活率比較高，在70%以上。但3 種插穗的芽或根分化率并不高，根狀莖莖尖的出芽率和生根率之和為33.3%，根狀莖的為13.3%，直立莖蘆頭的為26.6%。陽春砂插穗沒有清晰的先再生芽或再生根的順序，有些插穗只見芽，有些插穗只見根。出芽率和生根率的和包括了同時(shí)有芽和根的部分插穗，所以實(shí)際上能夠分化出芽或根的插穗的百分比會(huì)更低。也就是說，如果不用植物生長調(diào)節(jié)劑處理插穗，在75 d 內(nèi)，對照的成活率很低。為了提高插穗的成活率，需要用植物生長調(diào)節(jié)劑處理插穗。本文結(jié)果表明，用200 mg·L-1NAA 處理3 種插穗后，出芽率和生根率都比各自的對照大幅度提高，體現(xiàn)芽或根生長良好的長度和直徑兩個(gè)指標(biāo)，也比對照顯著提高。

不定根的形成是插穗最重要的發(fā)育現(xiàn)象，這個(gè)過程受到眾多的內(nèi)源生理因子影響，而生長素被認(rèn)為是最初觸發(fā)根分化的內(nèi)源因子［12］。生長素調(diào)節(jié)插穗的根分化過程是復(fù)雜的，其機(jī)理至今未完全清楚［13］。不同種類的生長素對插穗的生根效果是不一樣的，吲哚乙酸（IBA）誘導(dǎo)的根多且長，而NAA 誘導(dǎo)的根少而粗，IBA 和NAA 的混合溶液誘導(dǎo)生根的效果更佳［7，14］。生產(chǎn)實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)表明，陽春砂是容易生根的植物，因此本研究選擇了促進(jìn)根粗的NAA作為生根的單一誘導(dǎo)因子。生長素的生物作用具有濃度效應(yīng)［15］，在本研究設(shè)計(jì)的100、200、300、500 mg·L-1濃度梯度中，促進(jìn)陽春砂3 種插穗的芽和根發(fā)生及生長的NAA最適濃度基本上處于200 mg·L-1。

插穗根狀莖莖尖因?yàn)橛星o尖和節(jié)，在芽的分化上出現(xiàn)比較有趣的現(xiàn)象。被NAA 處理后，插穗原來的莖尖可以繼續(xù)生長，也可能還會(huì)在節(jié)上分化出芽。節(jié)上有芽分化的插穗，它的莖尖的生長受到抑制，呈現(xiàn)出頂端優(yōu)勢被解除的現(xiàn)象。推測低濃度的NAA 能夠促進(jìn)莖尖的生長，而高濃度的NAA 抑制了莖尖的生長，卻促進(jìn)了在節(jié)上分生出芽。由于插穗具有一定的長度，并且生長素的運(yùn)輸具有極性運(yùn)輸?shù)奶匦裕?5］，外源NAA 在插穗內(nèi)部的分布應(yīng)該是不均勻的，這或許可以解釋在根狀莖莖尖及根狀莖兩種插穗上的芽和根隨機(jī)再生的現(xiàn)象。這種推測是否成立，還有待進(jìn)一步的研究。

目前生產(chǎn)上分株繁殖時(shí)普遍沒有使用植物生長調(diào)節(jié)劑處理繁殖材料，但是本文結(jié)果提示分株繁殖時(shí)如果用200 mg·L-1NAA 處理，能夠縮短芽和根的分生時(shí)間，加快陽春砂成林的速度。扦插時(shí)使用的插穗種類和年齡、植物生長調(diào)節(jié)劑的種類及其濃度，植物生長調(diào)節(jié)劑處理的時(shí)間和方式，扦插基質(zhì)的組分等，以及它們之間的相互配合，與成活率有密切的關(guān)系［14，16～17］。為了進(jìn)一步提高成活率及節(jié)約扦插材料，本研究在插穗的大小、植物生長調(diào)節(jié)劑的種類與濃度篩選及處理時(shí)間、扦插期的適宜時(shí)長，扦插基質(zhì)的篩選等多方面，還需要進(jìn)一步的研究。

本研究成功地進(jìn)行了陽春砂的扦插并挖掘出3種插穗，為陽春砂種苗繁殖提供了一種在分株繁殖之外的高繁殖系數(shù)的營養(yǎng)繁殖方法。NAA 對陽春砂不同插穗的扦插繁殖效果有顯著影響。經(jīng)200 mg·L-1NAA 處理，3 種插穗在存活率、芽和根的分化及生長方面都顯著優(yōu)于對照。200 mg·L-1NAA 處理根狀莖莖尖的存活率為100%，比對照顯著高17.7%；根狀莖的存活率為96.7%，比對照顯著高23.4%；直立莖蘆頭的存活率為96.7%，比對照顯著高26.7%。根狀莖莖尖和根狀莖兩種插穗的最高出芽率為200 mg·L-1NAA 處理時(shí)的33.3%和53.3%，顯著比對照高13.3%和50.3%；直立莖蘆頭被100 mg·L-1NAA 處理后的出芽率達(dá)到最高的70.0%，但與200 mg·L-1NAA 處理的沒有顯著性差異。200 mg·L-1NAA 處理后，根狀莖莖尖、根狀莖和直立莖蘆頭3 種插穗的生根率分別為66.7%、36.7%和56.7%，各自顯著比對照高43.3%、26.7%和53.4%。