林 宇，鞠玉亮，劉 娟，王金成，高 建，鄭春生，魏亞?wèn)|，黃國(guó)明

（1. 天津海關(guān)動(dòng)植物與食品檢測(cè)中心，天津 300461；2. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，安徽 合肥 230036；3. 北京海關(guān)技術(shù)中心，北京 101300）

菊花滑刃線蟲(chóng)（Aphelenchoides ritzemabosi）是一種植物專(zhuān)性寄生線蟲(chóng)，既能以?xún)?nèi)寄生方式寄生于植物組織內(nèi)，又能通過(guò)外寄生方式附著于植物花、葉、芽生活[1]。該線蟲(chóng)可寄生于200 種以上高等植物，菊花是其典型危害寄主。其侵染菊花后可引起菊花枯葉病，導(dǎo)致葉片枯死、花芽生長(zhǎng)發(fā)育受阻或出現(xiàn)畸形。同時(shí)該線蟲(chóng)抗逆性強(qiáng)，在種子、植物組織、介質(zhì)土壤以及植物病殘?bào)w中能夠以休眠或脫水狀態(tài)長(zhǎng)時(shí)間存活，具有較高的遠(yuǎn)距離傳播擴(kuò)散風(fēng)險(xiǎn)[2]。目前，菊花滑刃線蟲(chóng)已在世界70 個(gè)以上國(guó)家發(fā)生，我國(guó)的江蘇、福建、江西、河南、湖北、廣東、廣西、貴州、四川、云南等地也發(fā)現(xiàn)其為害，對(duì)菊花、草莓、煙草等農(nóng)作物的生產(chǎn)造成了嚴(yán)重影響[3-5]。

伴隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展和廣泛應(yīng)用，植物寄生線蟲(chóng)的分類(lèi)鑒定也從經(jīng)典的形態(tài)學(xué)方法拓展到以PCR 為基礎(chǔ)的變溫分子檢測(cè)技術(shù)和恒溫分子檢測(cè)技術(shù)，如PCR-RFLP、SCAR 標(biāo)記、實(shí)時(shí)熒光PCR、LAMP、DNA 條形碼[6]等，這些鑒定技術(shù)為植物線蟲(chóng)的分類(lèi)鑒定提供了更可靠、更成熟的手段。重組酶聚合酶擴(kuò)增（recombinase polymerase amplification，RPA）技術(shù)是一種在常溫下進(jìn)行核酸擴(kuò)增的方法，屬于等溫核酸體外擴(kuò)增技術(shù)的一類(lèi)[7]。其原理是利用重組酶與引物形成聚合體，在模板DNA 上搜索與之完全互補(bǔ)配對(duì)的DNA 序列，通過(guò)單鏈DNA 結(jié)合蛋白的作用使模板DNA 解鏈，同時(shí)在DNA 聚合酶的作用下，完成復(fù)制延伸過(guò)程[8]。

目前，RPA 技術(shù)已在植物有害生物檢測(cè)鑒定方面開(kāi)展應(yīng)用研究。魏梅生等[9]建立了番茄細(xì)菌性葉斑病菌（Pseudomonas syringae pv. tomato）的RPA 檢測(cè)方法，這是我國(guó)首次報(bào)道該技術(shù)的實(shí)際應(yīng)用，DNA檢測(cè)靈敏度可達(dá)75 fg/μL，與普通PCR 結(jié)果相當(dāng)。張娜等[10]利用RPA 技術(shù)構(gòu)建了葡萄卷葉伴隨病毒3 號(hào)（Grapevine leafroll-associated virus 3 , GLRaV-3）的 快速檢測(cè)方法，將該項(xiàng)技術(shù)首次應(yīng)用于葡萄病毒鑒定檢測(cè)。Ju 等[11]運(yùn)用RPA 技術(shù)對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)屬（Meloidogyne spp.）中南方根結(jié)線蟲(chóng)（M. incognita）、花生根結(jié)線蟲(chóng)（M. arenaria）、爪哇根結(jié)線蟲(chóng)（M. javanica）、象耳豆根結(jié)線蟲(chóng)（M. enterolobii）4 個(gè)近似種成功實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)與區(qū)分。筆者擬利用RPA 技術(shù)，建立一種簡(jiǎn)便高效的菊花滑刃線蟲(chóng)檢測(cè)方法，為口岸植物檢疫快速通關(guān)、農(nóng)業(yè)線蟲(chóng)病害田間診斷提供更好的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

用于試驗(yàn)的線蟲(chóng)種群共計(jì)12 個(gè)，其中菊花滑刃線蟲(chóng)種群2 個(gè)、水稻干尖線蟲(chóng)（Aphelenchoides besseyi）種群3 個(gè)、內(nèi)卷滑刃線蟲(chóng)（Aphelenchoides involutus）種群1 個(gè)、雙尾擬滑刃線蟲(chóng)（Aphelenchoides bicaudatus）種群1 個(gè)、真滑刃線蟲(chóng)種群（Aphelenchus avenae）1 個(gè)、傘滑刃屬線蟲(chóng)（Bursaphelenchus）種群2 個(gè)以及未知種群2 個(gè)。所有線蟲(chóng)種群均由天津海關(guān)動(dòng)植物與食品檢測(cè)中心植檢實(shí)驗(yàn)室收集保存（表1）。

表1 試驗(yàn)線蟲(chóng)種群來(lái)源

主要試劑有TwistAmp Basic 試劑盒（TwistDx）、dNTPs、Taq DNA 聚 合 酶、10x PCR Buffer（Mg2+）、DL2000，均購(gòu)于寶生物工程（大連）有限公司；28S rRNA-D2/D3 區(qū)通用引物 D2A/D3B 與RPA 特異性檢測(cè)引物 AR-R-F/ AR-R-R 由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 單條菊花滑刃線蟲(chóng)DNA 提取 用挑針將線蟲(chóng)置于滴有ddH2O 的載玻片中清洗，清洗后將線蟲(chóng)轉(zhuǎn)入PCR 管（已加入8 μL ddH2O），利用昆蟲(chóng)小型解剖刀在PCR 管中將線蟲(chóng)蟲(chóng)體切裂，后加入2 μL 提取裂解液，置于PCR 儀中56 ℃溫浴1 h，95 ℃加熱10 min，離心后獲得的DNA 提取液可直接用于PCR 擴(kuò)增或放于-20 ℃冰箱留存[12]。

1.2.2 菊花滑刃線蟲(chóng)28S rRNA-D2/D3 區(qū)擴(kuò)增 利用植物寄生線蟲(chóng)28S rRNA-D2/D3 區(qū)通用引物D2A/D3B擴(kuò)增菊花滑刃線蟲(chóng)28S rRNA-D2/D3 序列。PCR 反應(yīng)體系（25 μL）：2×Taq MasterMix 12.5 μL、正反向引物各1 μL（10 μmol/L）、DNA 模板2 μL，ddH2O 補(bǔ)足至25 μL。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)程序參照王金成等[13]的方法，95℃10 min；95℃30 s，55℃30 s，72℃1 min，39 個(gè)循環(huán)；72℃10 min，冷卻至室溫。PCR 產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)后送測(cè)序公司進(jìn)行克隆測(cè)序。

1.2.3 RPA 特異性引物設(shè)計(jì) 檢索Genbank 數(shù)據(jù)庫(kù)中已鑒定到種的滑刃屬線蟲(chóng)（Aphelenchoides spp.）的28S rRNA-D2/D3 序列進(jìn)行打包下載，再結(jié)合該研究測(cè)得的菊花滑刃線蟲(chóng)群體28S rRNA-D2/D3 核酸序列，利用BioEdit 軟件進(jìn)行序列比對(duì)，分析差異位點(diǎn)，將上述序列導(dǎo)入Primer 6.0 設(shè)計(jì)出菊花滑刃線蟲(chóng)RPA 特異性檢測(cè)引物。

1.2.4 菊花滑刃線蟲(chóng)RPA 檢測(cè)方法的建立采用設(shè)計(jì)的RPA 特異性引物AR-R-F（5′- TTCAATGTCGAATAG TCAAGTTAAAGTTATG-3′）/AR-R-R（5′-GAATTTGAC TTATCGTTT CCTTTAAAACACC-3′）對(duì)菊花滑刃線蟲(chóng)進(jìn)行RPA 特異性測(cè)試，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照（ddH2O）。反應(yīng)體系（50 μL）：線蟲(chóng)DNA 模板10 μL、干粉溶解緩沖液（rehydration buffer）29.5 μL、引物（10 μmol/L）各2.4 μL、ddH2O 3.2 μL，加280 mmol/L 醋酸鎂2.5 μL 啟動(dòng)反應(yīng)?；靹蚝笤赑CR 儀中38 ℃溫浴40 min。RPA 擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，加入50 μL 苯酚/氯仿溶液至RPA 擴(kuò)增產(chǎn)物中充分混勻，放置離心機(jī)12 000 r/min 離心2 min，取表面上清液用于凝膠電泳，擴(kuò)增產(chǎn)物送至測(cè)序公司克隆測(cè)序。

1.2.5 RPA 檢測(cè)方法特異性測(cè)試 依據(jù)1.2.4 檢測(cè)反應(yīng)體系對(duì)菊花滑刃線蟲(chóng)及其他10 個(gè)種群進(jìn)行RPA 特異性測(cè)試，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照（ddH2O），對(duì)建立的RPA 檢測(cè)方法特異性進(jìn)行測(cè)試。

1.2.6 RPA 靈敏度測(cè)試 提取單條菊花滑刃線蟲(chóng)DNA， 分 別 稀 釋 為1/5、1/10、1/20、1/40、1/80、1/160、1/320 這7 個(gè)濃度梯度，按照1.2.4 檢測(cè)反應(yīng)體系，測(cè)試RPA 檢測(cè)方法的靈敏度。

2 結(jié)果與分析

2.1 菊花滑刃線蟲(chóng)28S rRNA-D2/D3 區(qū)擴(kuò)增

根據(jù)植物寄生線蟲(chóng)通用引物28S rRNA-D2/D3 區(qū)擴(kuò)增結(jié)果（圖1）顯示，研究收集的菊花滑刃線蟲(chóng)種群均擴(kuò)增出明亮單一的條帶，陰性對(duì)照無(wú)條帶出現(xiàn)。經(jīng)克隆測(cè)序后獲得菊花滑刃線蟲(chóng)28S rRNA-D2/D3 區(qū)產(chǎn)物長(zhǎng)度為750 bp 左右，結(jié)合Genbank 數(shù)據(jù)庫(kù)中下載的滑刃屬線蟲(chóng)（Aphelenchoides spp.）28S rRNA-D2/D3區(qū)序列，綜合分析比對(duì)，設(shè)計(jì)菊花滑刃線蟲(chóng)RPA 特異性檢測(cè)引物。

圖1 菊花滑刃線蟲(chóng)種群28S rRNA-D2/D3 擴(kuò)增結(jié)果

2.2 菊花滑刃線蟲(chóng)RPA 檢測(cè)方法的建立

采用RPA 檢測(cè)特異性引物AR-R-F/AR-R-R 對(duì)菊花滑刃線蟲(chóng)DNA 進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果如圖2 所示，測(cè)序后獲得約202 bp 的特異性片段，與預(yù)期目的條帶一致，陰性對(duì)照（ddH2O）則無(wú)條帶出現(xiàn)，將擴(kuò)增的特異性片段進(jìn)行序列比對(duì)，與目的片段一致。

圖2 RPA 方法檢測(cè)菊花滑刃線蟲(chóng)結(jié)果

2.3 菊花滑刃線蟲(chóng)RPA 檢測(cè)方法特異性測(cè)試

利用RPA 檢測(cè)特異性引物AR-R-F/AR-R-R 對(duì)菊花滑刃線蟲(chóng)以及近似種進(jìn)行特異性測(cè)試，結(jié)果如圖3 所示，設(shè)計(jì)的RPA 引物僅能對(duì)菊花滑刃線蟲(chóng)有效，擴(kuò)增出約202 bp 的特異性目的片段，其余寄生線蟲(chóng)與陰性對(duì)照（ddH2O）則無(wú)條帶出現(xiàn)，證明該檢測(cè)方法具有較強(qiáng)的特異性。

圖3 菊花滑刃線蟲(chóng)RPA 方法特異性檢測(cè)結(jié)果

2.4 RPA 檢測(cè)靈敏度測(cè)試

對(duì)單條線蟲(chóng)DNA 按1/5、1/10、1/20、1/40、1/80、 1/160、1/320 的比例進(jìn)行稀釋?zhuān)缓笠韵♂尯蟮腄NA為模板進(jìn)行RPA 檢測(cè)，結(jié)果如圖4 所示，未稀釋的菊花滑刃線蟲(chóng)DNA 擴(kuò)增的特異性條帶明亮清晰；稀釋至1/5～1/80 后，RPA 檢測(cè)特異性產(chǎn)物條帶依然質(zhì)量較高，沒(méi)有明顯的減弱；當(dāng)稀釋至1/160～1/320 時(shí)，擴(kuò)增條帶質(zhì)量明顯下降，但整體仍可清楚判別。這表明以該研究設(shè)計(jì)的RPA 特異性引物為基礎(chǔ)建立的菊花滑刃線蟲(chóng)RPA 檢測(cè)體系具有較高的靈敏度。

圖4 菊花滑刃線蟲(chóng)雙重RPA 方法靈敏度檢測(cè)結(jié)果

3 小結(jié)與討論

試驗(yàn)以菊花滑刃線蟲(chóng)為對(duì)象，利用RPA 技術(shù)建立了菊花滑刃線蟲(chóng)RPA 檢測(cè)方法，可特異性檢測(cè)菊花滑刃線蟲(chóng)，產(chǎn)生約202 bp 的特異性片段，對(duì)其他近似種線蟲(chóng)群體呈現(xiàn)陰性。該恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法在38 ℃等溫條件下溫浴40 min 便可完成反應(yīng)，同常規(guī)PCR、SCAR 標(biāo)記、DNA 條形碼等檢測(cè)方法相比較，有效縮短了檢測(cè)時(shí)間，降低了對(duì)PCR 儀的剛性需求，在小型金屬浴設(shè)備中也能進(jìn)行擴(kuò)增，有利于該方法在基層一線實(shí)驗(yàn)室的布局和推廣。而與等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)中的典型代表環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）相比，RPA 技術(shù)其優(yōu)勢(shì)在于，引物設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單，僅需一對(duì)引物即可完成擴(kuò)增，避免了引物設(shè)計(jì)困難、互相干擾性大、擴(kuò)增條件需大量實(shí)驗(yàn)摸索、檢測(cè)體系不穩(wěn)定等負(fù)面因素，因此RPA 檢測(cè)方法的建立與實(shí)用更簡(jiǎn)便易行。

同時(shí)該研究建立的菊花滑刃線蟲(chóng)RPA 檢測(cè)方法具有較高的靈敏度，不僅對(duì)單條線蟲(chóng)提取DNA 實(shí)現(xiàn)高效檢測(cè)，而且當(dāng)模板DNA 濃度稀釋為單條線蟲(chóng)的1/320 時(shí)，擴(kuò)增出的特異性條帶結(jié)果依然可以判別。此外，因?yàn)镽PA 技術(shù)對(duì)模板DNA 的獨(dú)特結(jié)合方式，要求特異性引物至少由30～35 個(gè)堿基構(gòu)成，這種長(zhǎng)引物與模板DNA 的嚴(yán)格互補(bǔ)結(jié)合，從而使得RPA 檢測(cè)擴(kuò)增的產(chǎn)物特異性較高，不容易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。

研究基于RPA 技術(shù)建立的菊花滑刃線蟲(chóng)檢測(cè)方法，在有效縮短檢測(cè)時(shí)間的同時(shí)，又能保持較高的靈敏度，為菊花滑刃線蟲(chóng)的的檢測(cè)鑒定提供了一種更為簡(jiǎn)便、快捷的方法，對(duì)于口岸植物檢疫快速通關(guān)、線蟲(chóng)病害田間調(diào)查等應(yīng)用十分方便。

菊花滑刃線蟲(chóng)是滑刃屬線蟲(chóng)中十分重要的植物寄生線蟲(chóng)，屬于我國(guó)檢疫性有害生物[4]。崔汝強(qiáng)等[14]曾利用植物寄生線蟲(chóng)rDNA-ITS 區(qū)序列差異性，設(shè)計(jì)出特異性引物BSF/ArtR，建立了菊花滑刃線蟲(chóng)的常規(guī)PCR 特異性引物檢測(cè)方法，王金成等[15]利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)滑刃屬線蟲(chóng)的核糖體28S rRNA-D2/D3 和ITS序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析得出，28S rRNA-D2/D3 與ITS序列能夠較好地區(qū)分大部分滑刃線蟲(chóng)種類(lèi)，可作為滑刃屬線蟲(chóng)DNA 條形碼候選基因，上述方法一定程度上為菊花滑刃線蟲(chóng)的分子鑒定提供了參考。