孔祝容，唐立，蔣文俊

重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)是指因胰酶異常激活、胰腺局部炎癥反應(yīng)，引起的以全身炎癥綜合征及多器官功能衰竭、死亡為主要特征的急腹癥[1-2]。SAP發(fā)病急、并發(fā)癥多、死亡率高，且無特殊的藥物及治療方法[3]。SAP發(fā)病機制復(fù)雜，目前研究發(fā)現(xiàn)，胰腺腺泡細胞壞死凋亡、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、自噬等與SAP發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[4]。磷酸肌醇-3激酶(phosphoinositide-3 kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)通路可調(diào)控細胞凋亡、自噬、炎癥反應(yīng)等多種生理過程[5]，且PI3K/Akt通路在SAP發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色，并可能為SAP的治療提供新的靶點[6]。尋找SAP特殊的藥物及治療策略，一直是臨床研究的熱點。ω-3多不飽和脂肪酸(omega-3 polyunsaturated fatty acids，ω-3PUFA)為人類必須的脂肪酸，是一種具有抗炎、抗氧化作用的免疫營養(yǎng)物質(zhì)[7]，近來臨床報道發(fā)現(xiàn)，ω-3PUFA干預(yù)治療可有效降低SAP及膿毒癥患者的炎癥反應(yīng)進程[8]，降低SAP患者發(fā)生器官衰竭的風(fēng)險[9]，預(yù)示ω-3PUFA可能為治療SAP的潛在有效藥物。但ω-3PUFA緩解SAP炎性反應(yīng)及死亡癥狀的具體機制還不甚明確。本研究建立SAP小鼠模型，從PI3K/Akt通路介導(dǎo)的炎癥、自噬、凋亡等方面，探究其ω-3PUFA緩解SAP病理進程的可能機制，以期為SAP的臨床治療及ω-3PUFA的開發(fā)應(yīng)用，提供一定的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 動物 健康雄性BALB/C小鼠，體質(zhì)量20～22 g，6～7周育齡，購自于首都醫(yī)科大學(xué)實驗動物科學(xué)部[SCXK(京) 2015-0006]，所有小鼠于本院動物房中飼養(yǎng)。本實驗經(jīng)本院倫理委員會批準，試驗動物符合3R原則。

1.1.2 主要試劑及儀器 ω-3多不飽和脂肪酸(ω-3PUFA)(貨號：ST1267，上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；自噬抑制劑(3-甲基腺嘌呤，3MA)(貨號：CD-07263，武漢純度生物科技有限公司)；PI3K/Akt激活劑(740Y-P)(貨號：M05856，北京百奧萊博科技有限公司)；淀粉酶、白細胞介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)ELISA試劑盒(貨號：YK-13288、YK-10490、YK-10854，北京伊塔生物科技有限公司)；雨蛙素(貨號：YT31544，北京伊塔生物科技有限公司)；蘇木精-伊紅染色(HE)(貨號：YT165，北京百奧萊博科技有限公司)；TUNEL染色試劑盒(貨號：YT137-RJZ，北京百奧萊博科技有限公司)；微管相關(guān)蛋白輕鏈3B(LC3B)、PI3K、磷酸化Akt(p-Akt)、核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)、磷酸化指標(biāo)(p-NF-κB)、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、磷酸化mTOR(p-mTOR)、自噬相關(guān)蛋白(Beclin1)、B細胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、促凋亡相關(guān)蛋白Cleaved-caspase-3及Bax抗體(貨號分別為：ab192890、ab154598、ab38449、ab220803、ab239882、ab134903、ab278621、ab210498、ab182858、ab214430、ab182733，美國abcam公司)。JCM-6000透射電鏡(日本電子光學(xué)公司)等。

1.2 方法

1.2.1 小鼠SAP模型建立及分組給藥 取小鼠，參照文獻[10]腹腔注射雨蛙素50 μg/kg，1次/h，共7次，建立SAP模型，若造模期間小鼠有死亡，解刨死亡小鼠，可見胃、腸極度擴張，胰腺片狀出血壞死且呈暗黑色，視為造模成功，共造模成功75只小鼠，隨機數(shù)字表法分為模型組、ω-3PUFA(2.5 g/kg)組、3MA(PI3K及自噬抑制劑-3-甲基腺嘌呤，10 mg/kg)組、740Y-P(PI3K/Akt激活劑，20 mg/kg)組、ω-3PUFA+740Y-P(2.5 g/kg+20 mg/kg)組，每組15只。另取15只小鼠，與相同時間及頻率注射等量生理鹽水，作為正常對照組。造模成功后開始給藥，ω-3PUFA參照文獻[11]設(shè)置劑量，并用生理鹽水稀釋成濃度為0.6 g/mL的混懸液，按10 mL/kg的劑量，經(jīng)腹腔注射給藥。740Y-P及3MA參照文獻[12-13]設(shè)置劑量并經(jīng)尾靜脈注射給藥1次；ω-3PUFA+740Y-P組腹腔注射ω-3PUFA，尾靜脈給予740Y-P；各組均給藥4 d。給藥期間統(tǒng)計各組小鼠死亡情況。

1.2.2 小鼠血清淀粉酶及炎性因子檢測 末次給藥麻醉后，腹主動脈取血3 mL，離心取血清按ELISA試劑盒檢測淀粉酶及炎性因子IL-1β、TNF-α水平。

1.2.3 透射電鏡檢測及標(biāo)本采集 處死小鼠，解剖取胰腺組織，剪下約0.3 cm×0.3 cm組織塊，2.5%戊二醛浸潤固定后，送入電鏡室檢查胰腺腺泡細胞結(jié)構(gòu)變化及自噬泡形成情況。剩余胰腺組織分成兩部分，一部分置于-80 ℃保存，另一部分迅速置于4%多聚甲醛中固定24 h，常規(guī)透明、浸蠟、包埋后、切成5 μm切片。

1.2.4 HE及TUNEL染色觀察胰腺組織病理變化及腺泡細胞凋亡狀況 取1.2.3中部分石蠟組織切片，分別按HE及TUNEL染色試劑盒說明書方法進行染色、封片后，置于光學(xué)顯微鏡下觀察胰腺組織病理變化及腺泡細胞凋亡狀況。取HE染色切片，參照文獻[10]中方法，對胰腺水腫、壞死、出血及脂肪壞死情況、炎癥浸潤情況等進行評分。

取TUNEL染色切片，光學(xué)顯微鏡下觀察并用Image-pro plus軟件系統(tǒng)檢測棕黃色染色的凋亡細胞數(shù)目，細胞凋亡率=凋亡細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%。

1.2.5 免疫熒光法檢測LC3B、PI3K表達 取1.2.3中部分組織石蠟切片，脫蠟、水化、曲拉通透化后，分別加入一抗(LC3B、PI3K，1∶200)4 ℃濕盒孵育過夜。避光加入熒光二抗(異硫氰酸熒光素, 1∶200)，DAPI染核 30 min，甘油封片，于熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.2.6 免疫組化法檢測p-NF-κB、Cleaved-caspase-3陽性表達 取1.2.3中部分組織石蠟切片，脫蠟、水化、抗原修復(fù)及滅活后，分別加入一抗(p-NF-κB、Cleaved-caspase-3，1∶500)4 ℃孵育過夜，經(jīng)DAB顯色，蘇木精復(fù)染，鹽酸乙醇分化、脫水、封片后，于光鏡下觀察并拍照，用Image Pro-Plus 6.0軟件進行累計光密度值測量分析。

1.2.7 Western blot法檢測胰腺組織Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR、Beclin1、Bcl-2、Bax蛋白相對表達水平 取1.2.3冰凍胰腺組織，4 ℃解凍，裂解提取蛋白，BCA法測蛋白總濃度后，取50 μg蛋白進行電泳及轉(zhuǎn)膜反應(yīng)，加入一抗(Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR、Beclin1、Bcl-2、Bax，1∶600，β-actin(內(nèi)參))抗體，1∶800)，4 ℃孵育過夜，加入HRP羊抗兔二抗(1∶800)，37 ℃孵育3 h，增強化學(xué)發(fā)光法顯色，以化學(xué)發(fā)光儀觀察條帶并拍照，以Image-J軟件分析各組蛋白相對表達。

1.3 統(tǒng)計方法

2 結(jié)果

2.1 ω-3PUFA對小鼠死亡及胰腺損傷大體觀察的影響

正常對照組無死亡，胰腺組織正常。模型組及ω-3PUFA+740Y-P組小鼠各有5只死亡，腹腔內(nèi)血性積液較多，胃、腸擴張及胰腺片狀出血、壞死嚴重。ω-3PUFA組及3MA組小鼠無死亡，腹腔內(nèi)血性積液減少，胃、腸擴張及胰腺片狀出血、壞死緩解。740Y-P組小鼠死亡9只，腹腔內(nèi)血性積液、胃、腸擴張及胰腺片狀出血、壞死進一步加重。

2.2 ω-3PUFA對小鼠血清淀粉酶及炎性因子水平的影響

與正常對照組相比，模型組小鼠血清淀粉酶及炎性因子IL-1β、TNF-α水平升高(P<0.05)。與模型組相比，ω-3PUFA組及3MA組小鼠血清淀粉酶及炎性因子IL-1β、TNF-α水平降低(P<0.05)，740Y-P組小鼠血清淀粉酶及炎性因子IL-1β、TNF-α水平進一步升高(P<0.05)。與ω-3PUFA組相比，ω-3PUFA+740Y-P組血清淀粉酶及炎性因子IL-1β、TNF-α水平升高(P<0.05)，見表1。

表1 各組小鼠血清淀粉酶及炎性因子水平比較

2.3 ω-3PUFA對小鼠胰腺超微結(jié)構(gòu)變化及自噬空泡形成的影響

電鏡觀察顯示，正常對照組小鼠腺泡細胞核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體等細胞器結(jié)構(gòu)清晰完整，無自噬空泡形成。與正常對照組相比，模型組及ω-3PUFA+740Y-P組小鼠腺泡細胞胞核及胞漿固縮、線粒體腫脹及細胞器結(jié)構(gòu)消失嚴重，雙層膜結(jié)構(gòu)的細胞自噬空泡形成較多。與模型組相比，ω-3PUFA組及3MA組腺泡細胞胞核及胞漿固縮、線粒體腫脹緩解及自噬空泡形成減少；740Y-P組腺泡細胞胞核及胞漿固縮、線粒體腫、自噬空泡形成進一步加重，見圖1。

圖1 小鼠胰腺組織電鏡觀察圖(12000×)

2.4 ω-3PUFA對小鼠胰腺組織壞死、炎性浸潤、腺泡細胞凋亡的影響

正常對照組小鼠胰腺組織結(jié)構(gòu)完整，染色均勻。HE染色顯示模型組及ω-3PUFA+740Y-P組胰腺小葉間呈彌漫性水腫，胰腺細胞壞死、間質(zhì)出血及炎性浸潤明顯；TUNEL染色可見腺泡細胞棕黃顆粒物質(zhì)沉積增多，組織病理學(xué)評分及細胞凋亡率升高(P<0.05)。ω-3PUFA組及3MA組小鼠胰腺細胞水腫、壞死、出血及炎性浸潤緩解，組織病理學(xué)評分降低(P<0.05)，細胞凋亡率進一步升高(P<0.05)；740Y-P組胰腺組織病理學(xué)評分進一步升高(P<0.05)，細胞凋亡率降低(P<0.05)，與ω-3PUFA組相比，ω-3PUFA+740Y-P組胰腺組織病理學(xué)評分升高(P<0.05)，細胞凋亡率降低(P<0.05)，見表2和圖2。

圖2 各組小鼠胰腺組織HE及TUNEL染色圖(200×)

表2 小鼠胰腺組織病理學(xué)評分及細胞凋亡率比較

2.5 ω-3PUFA對小鼠胰腺組織LC3B、PI3K陽性表達的影響

免疫熒光顯示，正常對照組小鼠胰腺腺泡細胞胞漿中LC3B、PI3K呈弱陽性表達。與正常對照組相比，模型組小鼠胰腺組織LC3B、PI3K陽性表達升高(P<0.05)。與模型組相比，ω-3PUFA組及3MA組小鼠胰腺組織LC3B、PI3K陽性表達降低(P<0.05)，740Y-P組小鼠胰腺組織LC3B、PI3K陽性表達進一步升高(P<0.05)。與ω-3PUFA組相比，ω-3PUFA+740Y-P組小鼠胰腺組織LC3B、PI3K陽性表達升高(P<0.05)，見圖3和表3。

表3 小鼠胰腺組織LC3B、PI3K陽性表達比較

圖3 小鼠胰腺組織LC3B、PI3K免疫熒光染色圖(200×)

2.6 ω-3PUFA對小鼠胰腺組織細胞p-NF-κB、Cleaved-caspase-3陽性表達的影響

免疫組化染色顯示，p-NF-κB、Cleaved-caspase-3在小鼠胰腺組織細胞胞漿中呈弱陽性表達。與正常對照組相比，模型組小鼠p-NF-κB、Cleaved-caspase-3陽性表達升高(P<0.05)。與模型組相比，ω-3PUFA組及3MA組小鼠胰腺組織p-NF-κB陽性表達降低(P<0.05)，Cleaved-caspase-3陽性表達升高(P<0.05)；740Y-P組小鼠胰腺組織p-NF-κB陽性表達升高(P<0.05)，Cleaved-caspase-3陽性表達降低(P<0.05)。與ω-3PUFA組相比，ω-3PUFA+740Y-P組小鼠胰腺組織p-NF-κB陽性表達升高(P<0.05)，Cleaved-caspase-3陽性表達降低(P<0.05)，圖4，表4。

圖4 小鼠胰腺組織p-NF-κB、Cleaved-caspase-3免疫組化圖(200×)

表4 小鼠胰腺組織p-NF-κB、Cleaved-caspase-3陽性染色比較光密度)

2.7 ω-3PUFA對小鼠Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR、Beclin1、Bcl-2、Bax蛋白表達的影響

與正常對照組相比，模型組小鼠胰腺組織p-mTOR/mTOR

蛋白表達降低(P<0.05)，p-Akt/Akt、Beclin1、Bax/Bcl-2表達升高(P<0.05)。與模型組相比，ω-3PUFA組及3MA組小鼠胰腺組織p-mTOR/mTOR、Bax/Bcl-2蛋白表達升高(P<0.05)，p-Akt/Akt、Beclin1蛋白表達降低(P<0.05)；740Y-P組小鼠胰腺組織p-mTOR/mTOR、Bax/Bcl-2表達降低(P<0.05)，p-Akt/Akt、Beclin1表達升高(P<0.05)。與ω-3PUFA組相比，ω-3PUFA+740Y-P組小鼠胰腺組織p-mTOR/mTOR、Bax/Bcl-2表達降低(P<0.05)，p-Akt/Akt、Beclin1表達升高(P<0.05)，見圖5和表5。

表5 各組小鼠肺組織p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR、Beclin1、Bax/Bcl-2蛋白表達比較

圖5 各組小鼠肺組織中Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR、Beclin1、Bcl-2、Bax蛋白表達免疫印跡圖 A：正常對照組；B：模型組；C：ω-3PUFA組；D：3MA組；E：740Y-P組；F：ω-3PUFA+740Y-P組

3 討論

SAP病死率高達30%。高淀粉酶血癥是SAP的主要診斷指標(biāo)[14]。胰腺細胞結(jié)構(gòu)損傷及炎癥反應(yīng)是SAP的主要病理特征[15]。本研究用雨蛙素誘導(dǎo)建立小鼠SAP模型后發(fā)現(xiàn)，小鼠死亡增加，血清淀粉酶、炎性因子-IL-1β、TNF-α水平分泌升高的同時，胰腺組織出現(xiàn)明顯壞死、炎性浸潤等病理損傷，提示造模成功。Wu等[5]認為胰腺炎相關(guān)性腹水中的有害物質(zhì)如TNF-α、白介素及內(nèi)毒素等，是引起胰腺組織壞死并加劇炎癥反應(yīng)的主要原因，用腹腔穿刺引流等方式降低炎癥因子水平，是延遲或避免SAP多器官衰竭及死亡的重要方式。ω-3PUFA具有較好的抗炎作用。陸冰等[16]發(fā)現(xiàn)ω-3PUFA能夠抑制NF-κB/TNF-α通路激活，降低α-淀粉酶在腦組織中積聚而緩解阿爾茨海默癥神經(jīng)炎性損傷。本研究發(fā)現(xiàn)ω-3PUFA干預(yù)治療后，小鼠死亡只數(shù)減少，胰腺組織壞死及炎性浸潤減輕，表現(xiàn)為血清淀粉酶、炎性因子水平的降低及p-NF-κB炎性活化通路蛋白在胰腺組織細胞中表達降低，提示ω-3PUFA可能通過降低炎性反應(yīng)來緩解SAP小鼠死亡及胰腺炎性壞死癥狀。

細胞凋亡或壞死也是SAP主要病理癥狀。TNF-α和IL-1β等各種細胞因子及因素均可導(dǎo)致腺泡細胞死亡，而腺泡細胞壞死又可進一步促進胰腺組織中胰腺酶活化，并釋放出更多炎癥介質(zhì)來加重SAP的病理進程[17]。但近來研究發(fā)現(xiàn)，腺泡細胞的凋亡反而會減少SAP患者胰腺酶的活化和釋放，減緩SAP的病理進程[18]。Chen等[19]認為炎癥可誘發(fā)組織壞死，而凋亡對腺泡細胞具有保護作用。本研究發(fā)現(xiàn)模型組小鼠胰腺組織中的腺泡細胞凋亡率升高，凋亡途徑被激活，表現(xiàn)為凋亡標(biāo)志蛋白Cleaved-caspase-3在腺泡中陽性表達升高，Bax/Bcl-2促凋亡表達升高，而ω-3PUFA干預(yù)組顯示出促凋亡途徑的進一步激活，提示ω-3PUFA也可能通過激活促凋亡途徑，發(fā)揮腺泡細胞保護作用，而緩解SAP胰腺組織病理損傷，這與Kong等[18]及Chen[19]等研究報道相一致。

細胞自噬在維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)、炎癥反應(yīng)、細胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用[20]。近來研究發(fā)現(xiàn)，SAP過程中胰腺腺泡細胞異常自噬現(xiàn)象也逐漸受到廣泛關(guān)注[21]。Lee等[22]在SAP動物模型胰腺腺泡細胞中，發(fā)現(xiàn)雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬空泡增多及高表達自噬標(biāo)記物-LC3(現(xiàn)象，并認為SAP患者腺泡損傷可能與炎癥刺激下的腺泡自噬異常有關(guān)。本研究也在模型組小鼠腺泡細胞中檢測到大量雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬空泡形成，且部分空泡內(nèi)含有大量未消化的細胞內(nèi)容物，另外腺泡胞漿中LC3B呈強陽性表達，證實自噬異常激活可能參與SAP病理過程。馬立峰等[23]發(fā)現(xiàn)ω-3PUFA在骨關(guān)節(jié)疾病中發(fā)揮促細胞自噬作用；相反，Lee等[24]發(fā)現(xiàn)ω-3PUFA可抑制自噬緩解肌肉萎縮的病理進程，提示ω-3PUFA在細胞自噬過程中發(fā)揮正負反饋調(diào)節(jié)作用。本研究發(fā)現(xiàn)，ω-3PUFA組顯示出抑制自噬空泡增加及降低LC3B表達作用，提示ω-3PUFA可通過阻斷自噬發(fā)揮緩解SAP病理進程作用。

PI3K/Akt通路是調(diào)控細胞炎性反應(yīng)、自噬、凋亡等生理過程的關(guān)鍵通路。近來研究發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt通路在SAP腺泡凋亡壞死、炎性反應(yīng)及自噬等過程，發(fā)揮重要調(diào)控作用。Jin等[25]發(fā)現(xiàn)，PI3K可調(diào)控NF-κB炎癥通路激活，加重SAP中胰腺組織炎癥壞死程度。Wu等[5]抑制PI3K激活后，可增加NF-κB下游促凋亡基因Bax表達，并顯著降低SAP進展；羅晨等[21]發(fā)現(xiàn)抑制PI3K/Akt，可抑制NF-κB激活引起的腺泡細胞異常自噬，并促進細胞凋亡，且凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2也可通過競爭性調(diào)節(jié)Beclin1，阻斷自噬。PI3K/Akt下游調(diào)控因子mTOR可直接調(diào)控Bcl-2表達，競爭性調(diào)節(jié)BH3受體域作用，抑制Beclin1依賴的自噬形成來調(diào)控自噬及凋亡[26]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠腺泡胞漿中PI3K、p-Akt呈強陽性表達，且介導(dǎo)的自噬及炎癥激活、凋亡增加，表現(xiàn)為p-mTOR/mTOR降低，Beclin1表達及p-NF-κB陽性表達升高，Bax/Bcl-2促凋亡升高。用3MA阻斷PI3K表達及自噬后，小鼠表現(xiàn)出SAP胰腺組織炎癥壞死減少，腺泡促凋亡保護途徑進一步激活，炎癥反應(yīng)及自噬相關(guān)途徑的抑制。相反，740Y-P激活PI3K表達后，小鼠死亡及胰腺組織炎癥壞死加重，自噬及炎癥激活，促凋亡保護途徑減弱。ω-3PUFA組顯示出與3MA相似的自噬及炎癥抑制、凋亡增加及SAP病理癥狀的減緩，而740Y-P可逆轉(zhuǎn)ω-3PUFA的上述作用，提示ω-3PUFA抑制SAP炎癥及自噬異常反應(yīng)，促進腺泡促凋亡保護途徑激活及緩解SAP病理癥狀作用，可能與阻斷PI3K/Akt途徑激活有關(guān)。

綜上所述，ω-3PUFA可通過抑制PI3K/Akt通路介導(dǎo)的炎癥及自噬異常途徑活化，促進腺泡促凋亡保護途徑激活，來緩解SAP小鼠死亡及胰腺組織炎性壞死的進一步發(fā)展?？蔀棣?3PUFA在SAP領(lǐng)域的開發(fā)應(yīng)用提供一定參考。但SAP自噬、炎癥及凋亡等調(diào)控網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜且多樣。ω-3PUFA緩解SAP病理癥狀的其它途徑，還需進一步研究。