夏 駿，姚曉麗，劉 潭，劉伯毅△，方志成

（1. 十堰市太和醫(yī)院·湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，湖北 十堰 442000； 2. 湖北醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖北 十堰 442000）

膿毒癥是全身性有害炎性反應(yīng)，死亡率高，多由多器官功能障礙和衰竭引發(fā)［1-2］，多表現(xiàn)為心功能不全［3］。目前，尚不清楚膿毒癥的病理生理學(xué)機(jī)制，故其治療是非特異性的且通常是無(wú)效的［4］。有研究表明，其發(fā)生機(jī)制通常與敗血癥性心肌功能障礙有關(guān)，包括過(guò)度氧化應(yīng)激、心肌細(xì)胞凋亡、心臟收縮功能障礙和持續(xù)性炎癥［5］。缺氧誘導(dǎo)因子-1（HIF-1）調(diào)控著許多控制心血管系統(tǒng)所必需的細(xì)胞過(guò)程的基因，包括代謝、血管生成、細(xì)胞存活和氧傳遞［6］。HIF-1α 是HIF-1 的主要功能亞單位，可通過(guò)誘導(dǎo)血紅素加氧酶-1（HO-1）激活HIF-1α，使其具有心臟保護(hù)作用。HO-1 被認(rèn)為是多種組織中對(duì)氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)最重要的心臟保護(hù)蛋白［7］。金絲桃苷為黃酮醇苷類化合物，具有抗炎、利尿、止咳等作用，可提高心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌超氧化物歧化酶（SOD）活力，改善心肌功能［8］，且可有效減少氧自由基生成，保護(hù)心肌。本研究中探討了金絲桃苷通過(guò)調(diào)節(jié)HIF-1α/HO-1 信號(hào)通路改善膿毒癥大鼠心肌損傷的作用機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與動(dòng)物

儀器:PowerLab System 型分析系統(tǒng)（澳大利亞Instruments 公司）；Thermo ScientificTMMultiskanTMGO 型酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo Fisher 公司）；BX53 型顯微鏡（日本奧林巴斯公司）。

試藥:地塞米松（STZ，美國(guó)Sigma 公司，純度為99.99%，批號(hào)為30648957）；肌鈣蛋白I（cTnI，批號(hào)為20649215），腦鈉肽（BNP，批號(hào)為20364952），腫瘤壞死因子-α（TNF-α，批號(hào)為20846213），白細(xì)胞介素1β（IL-1β，批號(hào)為20563214），酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）試劑盒，均購(gòu)自上海優(yōu)寧維生物有限公司；金絲桃苷（南京建成生物工程研究所，純度為99.99%，批號(hào)為190108）；二氨基聯(lián)苯胺（DAB）染色試劑盒（寶生物工程大連有限公司，批號(hào)為203695）；HIF-1α 和HO-1 蛋白抗體（美國(guó)Abcam 公司，批號(hào)分別為20136542，20613524）。

動(dòng)物:SPF 級(jí)12 周齡SD 大鼠120 只，體質(zhì)量為210 ～280 g，雌雄各半，購(gòu)自重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（渝）2018-0003，動(dòng)物使用許可證號(hào)為SYXK（渝）2018-0027，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)為001906127。試驗(yàn)期間所有大鼠均飼養(yǎng)于清潔級(jí)動(dòng)物房?jī)?nèi)，溫度為18 ～25 ℃，相對(duì)濕度為60% ～70%，動(dòng)物自由取食、飲水，自動(dòng)控制光照/黑暗交替（12 h/12 h）。本研究已獲得十堰市太和醫(yī)院倫理委員會(huì)審查和批準(zhǔn)，符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)要求。

1.2 動(dòng)物建模、分組及給藥

選取120 只SD 大鼠，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對(duì)照組（A 組）、模型組（B 組）、陽(yáng)性藥對(duì)照組（C 組，地塞米松10 mg/kg），金絲桃苷低、中、高劑量組（D1、D2、D3組，生藥10，20，40 mg/kg），各20 只。各組大鼠在禁食、禁飲12 h 后，腹腔注射10%水合氯醛0.3 mL/kg，麻醉后消毒腹部皮膚，在腹部縱切3 cm 切口，打開(kāi)腹腔，分離大鼠盲腸；A 組不作其他處理，縫合傷口，其余各組結(jié)扎盲腸末端，使用9 號(hào)針頭刺穿盲腸3 次，輕壓使糞便溢出，關(guān)閉腹腔，縫合傷口。術(shù)后，D1組、D2組、D3組和C 組腹腔注射相應(yīng)藥物，A 組、B 組腹腔注射等體積生理鹽水，給藥1 次，12 h 后處死動(dòng)物。12 h 內(nèi)各組大鼠提供相同的飼養(yǎng)環(huán)境和飲食。

1.3 觀察指標(biāo)

血流動(dòng)力學(xué):使用肝素鹽水（500 U/mL）填充導(dǎo)管，從右頸動(dòng)脈將導(dǎo)管插入左心室，使用PowerLab 記錄左室收縮壓（LVSP）、左心室舒張末壓（LVEDP）、左心室內(nèi)壓最大上升速率（＋dp/dtmax）和左心室內(nèi)壓最大下降速率（-dp/dtmax）。

血清及心臟組織炎性因子:試驗(yàn)?zāi)┢?，腹腔注?0%水合氯醛0.3 mL/kg，取大鼠心臟非抗凝血3 mL，4 ℃離心（2 500 r/min）15 min，取上層血清置新的1.5 mL EP 管中，-80 ℃保存，備用。稱取大鼠心臟組織0.1 g，置玻璃研磨器中，加入1 mL 磷酸鹽緩沖液（PBS），充分研磨，4℃離心（2500r/min）15min，取上層血清，-80 ℃保存，備用。按ELISA 試劑盒說(shuō)明書(shū)方法檢測(cè)血清中cTnI及BNP 和心臟組織上清液中TNF-α 及IL-1β 含量。

心臟病理組織切片:試驗(yàn)?zāi)┢冢骨蛔⑸?0%水合氯醛，取大鼠心臟組織，生理鹽水漂洗，置甲醛水溶液中固定，48 h 后取部分心臟組織制作蘇木精-伊紅（HE）染色切片，顯微鏡下觀察大鼠心臟結(jié)構(gòu)病理變化。

心臟HIF-1α 和HO-1 蛋白表達(dá)水平:取心臟病理組織切片的組織蠟塊，切成5 μm 厚度，置防脫載玻片上，經(jīng)脫蠟（二甲苯）、水化（梯度乙醇）處理后進(jìn)行如下操作，PBS 浸泡3 次，每次5 min，晾干；將切片置枸櫞酸鈉緩沖液中，煮沸15 min，進(jìn)行抗原修復(fù)，PBS 浸泡3次，每次5 min；3%雙氧水浸泡10 min，去除內(nèi)源性酶，PBS 浸泡3 次，每次5 min；每張切片的組織上滴加50 μL山羊血清，封閉30 min；棄去山羊血清，不清洗，加50 μL一抗孵育，4 ℃過(guò)夜；次日，棄去一抗，PBS 浸泡3 次，每次5 min，晾干，滴加50 μL 二抗［生物素標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）］孵育30 min；棄去二抗，PBS 浸泡3 次，每次5 min，滴加DAB 顯色劑，顯微鏡下觀察組織顏色，適時(shí)終止；用PBS 洗去DAB 顯色劑，滴加蘇木素復(fù)染5 min，自來(lái)水沖洗，1%鹽酸乙醇（75%）溶液分化5 s，自來(lái)水沖洗5 min，藍(lán)化；依次經(jīng)過(guò)70%，80%，90%，95%乙醇和無(wú)水乙醇各5 min，二甲苯20 min 后用中性樹(shù)脂封片。顯微鏡下觀察HIF-1α 和HO-1 蛋白表達(dá)水平。采用雙盲法判定免疫組化結(jié)果，由2 位未參與前期試驗(yàn)且有病理工作經(jīng)驗(yàn)的工作人員在100 倍顯微鏡下采用半定量分析法統(tǒng)計(jì)蛋白表達(dá)結(jié)果。陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率，0 分為無(wú)表達(dá)，1 分為表達(dá)1% ～25%，2 分為表達(dá)25% ～50% ，3 分為表達(dá)50% ～75% ，4 分為表達(dá)75%以上；染色強(qiáng)度，0 分為無(wú)顏色，1 分為淺黃色，2 分為黃色，3 分為棕黃色。兩者得分相乘作為最后得分，0 分為-，1 ～2 分為＋，3 ～4 分為＋＋，5 ～6 分為＋＋＋，＞6 分為＋＋＋＋。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)

與A 組比較，B 組LVSP，＋dp/dtmax，-dp/dtmax均顯著降低，LVEDP 顯著升高（P ＜0.05）；與B 組比較，C 組、D1組、D2組、D3組LVSP，＋dp/dtmax，-dp/dtmax均顯著升高，LVEDP 顯著降低（P ＜0.05），且呈劑量依賴性（P ＜0.05）；與C 組比較，D1組、D2組LVSP，＋dp/dtmax，-dp/dtmax均顯著降低，LVEDP 顯著升高（P ＜0.05），D3組無(wú)顯著差異（P ＞0.05）。詳見(jiàn)表1。

表1 大鼠血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)比較（± s，n ＝20）Tab.1 Comparison of hemodynamic indexes of rats in each group（± s，n ＝20）

表1 大鼠血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)比較（± s，n ＝20）Tab.1 Comparison of hemodynamic indexes of rats in each group（± s，n ＝20）

注:與A 組比較，a P ＜0.05；與B 組比較，b P ＜0.05；與C 組比較，c P ＜0.05；與D1 組比較，d P ＜0.05；與D2 組比較，e P ＜0.05。表2 同。Note:Compared with those in group A，a P ＜0.05；compared with those in group B，b P ＜0.05；compared with those in group C，c P ＜0.05；compared with those in group D1，d P ＜0.05；compared with those in group D2，e P ＜0.05；as well as Tab.2.

組別A 組B 組C 組D1 組D2 組D3 組LVSP（mmHg）144.3±13.2 121.2±16.5a 141.7±11.9b 129.8±12.5bc 135.7±12.3bcd 141.3±15.7bde LVEDP（mmHg）8.1±1.2 13.4±1.5a 8.7±1.3b 11.3±1.5bc 10.1±1.7bcd 8.6±1.2bde＋dp/dtmax（mmHg/s）3 122.5 ±263.2 2 594.3 ±221.6a 3 097.2 ±279.6b 2 756.8 ±269.4bc 2 899.4 ±271.3bcd 3 092.5 ±286.4bde-dp/dtmax（mmHg/s）2 609.6 ±213.4 1 732.9 ±156.2a 2 586.7 ±231.5b 1 993.4 ±201.2bc 2 249.7 ±223.1bcd 2 593.6 ±247.5bde

2.2 血清及心臟組織炎性因子水平

與A 組比較，B 組cTnI，BNP，TNF-α，IL-1β 水平均顯著升高（P ＜0.05）；與B 組比較，C 組、D1組、D2組、D3組cTnI，BNP，TNF-α，IL-1β 水平均顯著降低（P ＜0.05），且呈劑量依賴性（P＜0.05）；與C 組比較，D1組、D2組cTnI，BNP，TNF-α，IL-1β 水平均顯著升高（P ＜0.05），D3組各指標(biāo)無(wú)顯著差異（P ＞0.05）。詳見(jiàn)表2。

2.3 心臟組織病理結(jié)構(gòu)

A 組大鼠心臟組織結(jié)構(gòu)無(wú)明顯病理變化；B 組大鼠心肌細(xì)胞邊界模糊，細(xì)胞排列紊亂，可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和壞死區(qū)域；D1組、D2組可見(jiàn)少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，細(xì)胞結(jié)構(gòu)及邊界較B 組明顯好轉(zhuǎn)；D3組和C 組心肌細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，邊界清晰，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。詳見(jiàn)圖1。

2.4 心臟組織HIF-1α 和HO-1 蛋白表達(dá)水平

與A 組比較，B 組HIF-1α 和HO-1 蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P ＜0.05）；與B 組比較，C 組、D1組、D2組、D3組HIF-1α 和HO-1 蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P ＜0.05），且呈劑量依賴性（P ＜0.05）；與C 組比較，D1組、D2組HIF-1α 和HO-1 蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P ＜0.05），D3組無(wú)顯著差異（P ＞0.05）。詳見(jiàn)表3和圖2。

表2 大鼠血清及心臟組織炎性因子比較（± s，pg/mL，n ＝20）Tab.2 Comparison of inflammatory factors in serum and heart tissue of rats in each group（± s，pg/mL，n ＝20）

表2 大鼠血清及心臟組織炎性因子比較（± s，pg/mL，n ＝20）Tab.2 Comparison of inflammatory factors in serum and heart tissue of rats in each group（± s，pg/mL，n ＝20）

A 組B 組C 組D1 組D2 組D3 組cTnI 0.68±0.05 3.52±0.29a 0.95±0.11b 2.68±0.29bc 1.95±0.21bcd 1.01±0.12bde BNP 0.85±0.10 2.94±0.27a 1.01±0.11b 2.54±0.31bc 1.79±0.15bcd 1.04±0.10bde TNF-α 22.53±3.21 47.32±5.61a 24.21±2.65b 41.25±4.66bc 31.94±3.25bcd 24.55±2.73bde IL-1β 4.67±0.49 13.91±1.29a 5.75±0.61b 10.55±1.17bc 8.72±0.94bcd 5.78±0.58bde血清 心臟組織組別

表3 大鼠心臟組織HIF-1α 和HO-1 蛋白表達(dá)水平（半定量分析法）比較（只，n ＝20）Tab.3 Comparison of HIF-1α and HO-1 protein expression levels in heart tissues of rats in each group（semi-quantitative assessment，rat，n ＝20）

A.A 組 B.B 組 C.C 組 D.D1 組 E.D2 組 F.D3 組圖1 各組大鼠心臟組織病理圖（HE 染色，×200）A. Group A B.Group B C.Group C D.Group D1 E. Group D2 F.Group D3Fig.1 Histopathology of the heart tissues of rats in each group（HE staining，×200）

A.A 組 B.B 組 C.C 組 D.D1 組 E.D2 組 F.D3 組圖2 大鼠心臟組織HIF-1α 和HO-1 蛋白表達(dá)水平圖（免疫組化染色，×200）A. Group A B.Group B C.Group C D.Group D1 E. Group D2 F.Group D3Fig.2 The expression of HIF-1α and HO-1 protein in the heart tissue of rats in each group（immunohistochemical staining，×200）

3 討論

金絲桃苷可能通過(guò)HIF-1α/HO-1 信號(hào)通路減輕心臟免疫應(yīng)激反應(yīng)，從而減輕膿毒癥性心肌功能障礙。本研究中，膿毒癥大鼠心肌形態(tài)和功能的致命損傷表現(xiàn)為心肌結(jié)構(gòu)破壞，心肌細(xì)胞凋亡，HIF-1α/HO-1活性，LVSP，dP/dtmax和-dP/dtmax水平均降低，LVEDP水平升高，腹腔注射金絲桃苷后，發(fā)現(xiàn)以劑量依賴的方式逆轉(zhuǎn)以上改變。表明金絲桃苷可能誘導(dǎo)心肌細(xì)胞HIF-1α 和HO-1 蛋白的表達(dá)，減少心肌細(xì)胞凋亡，減輕心臟氧化應(yīng)激反應(yīng)，預(yù)防膿毒癥性心功能不全，從而提高動(dòng)物存活率。

膿毒癥是一種對(duì)感染者全身有害的炎性反應(yīng)，主要導(dǎo)致患者肺功能障礙，其他器官如心臟和腎臟的功能障礙為繼發(fā)于肺功能的障礙［9-10］。一般情況下，心臟功能障礙（如心力衰竭、心律失常、心肌缺血）常繼發(fā)于腎功能或肺功能的突然惡化［11］，故感染性心功能不全發(fā)生后，應(yīng)保護(hù)心臟免受心功能損害。

HIF-1α 具有心臟保護(hù)作用，因其為HO-1 的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，HO-1 是組織中最重要的心臟保護(hù)蛋白之一［12-13］，催化血紅素氧化并產(chǎn)生CO、膽紅素和鐵蛋白，均有助于細(xì)胞抵抗氧化損傷和死亡機(jī)制，以上作用機(jī)制涉及過(guò)氧化氫酶的上調(diào)［14］。心臟特異性過(guò)表達(dá)中，HO-1 可減輕心肌缺血再灌注損傷［15］。此外，用HIF-1激活劑進(jìn)行心臟預(yù)處理可減輕缺血后心肌損傷［16］。因此，HO-1 被認(rèn)為可對(duì)缺血再灌注損傷提供即時(shí)和延遲保護(hù)。本研究中金絲桃苷呈劑量依賴性地誘導(dǎo)HIF -1α 和HO-1 蛋白的表達(dá)，這可能與降低脂質(zhì)過(guò)氧化、心肌細(xì)胞凋亡、心肌母源抗體（MDA）水平及改善心功能有關(guān)。

現(xiàn)有研究證實(shí)，金絲桃苷可提高機(jī)體免疫力。一定劑量的金絲桃苷可顯著增強(qiáng)大鼠T 淋巴細(xì)胞和B 淋巴細(xì)胞的活性，調(diào)節(jié)相關(guān)炎性因子的分泌［17］。cTnI，BNP，TNF-α，IL-1β 等炎性因子與心肌受損程度密切相關(guān)［18］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在膿毒癥模型大鼠中，cTnI，BNP，TNF -α，IL -1β 的表達(dá)量均顯著增加，炎性因子的過(guò)度表達(dá)導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生自身免疫性心肌損傷。腹腔注射金絲桃苷后，大鼠炎性因子的表達(dá)量均下調(diào)，且表達(dá)量與金絲桃苷劑量成反比，具有顯著的劑量-效應(yīng)關(guān)系。表明膿毒癥可導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生自身免疫性損傷，而金絲桃苷可通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)逆轉(zhuǎn)膿毒癥造成的損傷。

綜上所述，金絲桃苷對(duì)膿毒癥心肌損傷大鼠心臟具有一定保護(hù)作用。其作用機(jī)制可能是金絲桃苷通過(guò)誘導(dǎo)HIF-1α/HO-1 信號(hào)通路，激活膿毒癥大鼠HIF-1α和HO-1 蛋白的表達(dá)，從而減輕過(guò)強(qiáng)的免疫應(yīng)答對(duì)機(jī)體造成的損傷，以扭轉(zhuǎn)膿毒癥導(dǎo)致的大鼠心肌損傷，為膿毒癥性心肌損傷的臨床治療提供理論依據(jù)。