葉青雷，劉海軍，馬云橋，于永強(qiáng)，趙愛春

（1 黑龍江省農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣站，哈爾濱 150090；2 西南大學(xué)，重慶 400715）

桑樹是薔薇目 （Rosales） 桑科 （Moraceae） 桑屬（Morus spp. L.） 多年生木本植物，在我國(guó)有廣泛的分布。黑龍江省地處我國(guó)東北部，大部分地區(qū)在北緯45～50°，冬季嚴(yán)寒、漫長(zhǎng)，桑樹資源相對(duì)南方省份匱乏。高耐寒性是黑龍江省桑樹資源的天然特性，通過對(duì)其進(jìn)行深入研究，對(duì)我國(guó)桑樹資源的發(fā)掘與創(chuàng)新利用具有重要意義。關(guān)于桑屬植物染色體研究國(guó)內(nèi)已有諸多報(bào)道，但關(guān)于黑龍江省桑樹品種資源染色體倍性研究方面還未見報(bào)道。桑樹染色體數(shù)目和倍數(shù)性，不僅可以為闡明桑屬植物的分類、起源、進(jìn)化及系統(tǒng)發(fā)育、細(xì)胞遺傳等提供細(xì)胞學(xué)依據(jù)[1，2]，還可以在桑樹雜交育種的材料選擇、育性分析、品種鑒定方面起到指導(dǎo)作用。

本研究在對(duì)黑龍江6個(gè)果桑品種主要性狀進(jìn)行觀察的基礎(chǔ)上，采用去壁低滲法對(duì)其葉片制作染色體玻片標(biāo)本，在顯微鏡下觀察染色體數(shù)量，并進(jìn)行染色體倍性分析，以期為桑樹抗寒資源的挖掘與利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

供試材料為桑樹‘龍桑1號(hào)’‘龍椹1號(hào)’‘選2’‘選3’‘選4’‘矮化1號(hào)’’6個(gè)品種，均為黑龍江省優(yōu)異種質(zhì)資源調(diào)查收集品種，并栽植在哈爾濱市雙城區(qū)五家鎮(zhèn)黑龍江省桑樹種質(zhì)資源圃。資源圃占地面積3 hm2，現(xiàn)保存有白桑、魯桑、雞桑、山桑4個(gè)桑種的種質(zhì)資源32份，采用低干和喬木兩種樹形栽培。黑土。

1.1 主要性狀觀察

2016—2019年，對(duì)6個(gè)果桑品種的主要植物學(xué)特征、生物學(xué)特性進(jìn)行觀察。在對(duì)花、葉片、果實(shí)等形態(tài)特征觀察時(shí)，用數(shù)碼體視顯微鏡拍照記錄。

1.2 染色體玻片制作與染色體數(shù)目的調(diào)查

1.2.1 染色體玻片制作

2016年4月選取6 個(gè)果桑品種健壯越冬枝條中部，每個(gè)品種剪取12 cm短枝5份，在24 ℃條件下水培扦插（圖1），剪取冬芽萌發(fā)長(zhǎng)出的嫩葉，采用去壁低滲法[3，4]制片，每個(gè)處理3次重復(fù)。將嫩葉于0.002 mol/L 8-羥基喹啉溶液中避光預(yù)處理2 h，水洗后用卡諾固定液（甲醇與冰醋酸的體積比為3∶1）于4 ℃下固定24 h，轉(zhuǎn)入0.067 mol/L KCl 溶液中室溫條件下進(jìn)行前低滲處理0.5 h；用混合酶液（2.5%纖維素酶活力≥1 000 U/g）30 ℃酶解3.5 h；轉(zhuǎn)入蒸餾水中后低滲處理0.5 h；吸干蒸餾水后，將材料搗碎，加入固定液用懸滴法制片；干燥后加入Giemsa染液染色過夜后洗片、封片，用于染色體觀察[5，6]。每個(gè)處理制片2 個(gè)，重復(fù)3 次。

圖1 果桑水培扦插

1.2.2 染色體觀察及數(shù)目的確定

根據(jù)李懋學(xué)等提出的染色體核型分析標(biāo)準(zhǔn)，確定在供試桑樹種質(zhì)材料50個(gè)染色體分散良好且著絲點(diǎn)清晰的分裂中期細(xì)胞中，85%以上的細(xì)胞具有恒定一致的染色體數(shù)目，即可認(rèn)為是其體細(xì)胞染色體數(shù)目[6，7]。將染色體制片在Leica DM2500顯微鏡（徠卡顯微系統(tǒng)貿(mào)易有限公司）下進(jìn)行觀察，選取制片中染色體分散良好、染色深度適中、著絲點(diǎn)清晰的細(xì)胞進(jìn)行染色體數(shù)目統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 6 個(gè)果桑品種的主要性狀

龍桑1號(hào) 屬白桑種。樹形開張，成枝力較強(qiáng)，枝條粗長(zhǎng)，稍彎曲，木質(zhì)堅(jiān)硬，髓部較小，皮棕褐色，五列葉序。冬芽飽滿，正三角形，尖離，棕褐色，副芽小而少。葉心臟形，深綠色，葉尖短尾狀，葉緣鈍齒，葉基心形。葉片較大，葉長(zhǎng)18.0 cm，葉幅15.0 cm，葉柄4.8 cm，葉片較厚，葉面稍平而光滑，富有亮澤，葉片向上斜伸。四五年結(jié)果。雌雄同株，雌花比例30%～40%，單芽坐果2～6個(gè)。產(chǎn)量低（666.7 m2產(chǎn)量300 kg）且不穩(wěn)，修剪后一二年越冬枝條不結(jié)果或結(jié)果量很少。

龍椹1號(hào) 屬白桑種。樹形開張，成枝力強(qiáng)，枝條細(xì)、直，皮赤褐色，五列葉序。冬芽三角形，飽滿，黃褐色，腹離，副芽多。葉片長(zhǎng)心形，偶有缺刻現(xiàn)象，綠色，葉尖短尾狀，葉緣鈍齒，葉基淺心形或截形。葉長(zhǎng)14.8 cm，葉幅10.0 cm，葉柄4.0 cm，葉面光澤中。結(jié)果早，栽植后第2年見果，第3年即可豐產(chǎn)。雌雄同株，雌花比例89%以上，單芽坐果數(shù)4～8個(gè)。產(chǎn)量高，每條產(chǎn)果160 g，株產(chǎn)3 kg左右，666.7 m2產(chǎn)量600～750 kg。修剪后，越冬芽都能正常開花結(jié)果，產(chǎn)量不受影響。桑椹圓筒狀，長(zhǎng)2～3 cm，橫徑1 cm，單果重1～2 g，含可溶性固形物11.0%，可滴定酸2.11 g/kg，維生素C 17.7 mg/100 g，口感甘甜（圖2、圖3）。

圖2 ‘龍椹1號(hào)’果實(shí)

選2 雌雄同株。雌花有明顯花柱，柱頭內(nèi)側(cè)具突起（圖3）。葉間距4.26 cm，五列葉序；葉心臟形，邊緣鈍齒，葉面生微小剛毛、粗糙，葉色深綠。聚花果橢圓形，長(zhǎng)2.0～2.5 cm，橫徑1.0～1.5 cm，成熟后紫黑色，果柄短，3～5 mm；含可溶性固形物10.0%，可滴定酸1.89 g/kg，維生素C 16.5 mg/100 g，口感甘甜。果實(shí)結(jié)籽率低，桑籽發(fā)芽率低。發(fā)條力一般，枝條略有彎曲。

選3 雌性株系。葉心臟形，邊緣鈍齒，葉色綠色。聚花果長(zhǎng)筒狀，長(zhǎng)2.0～2.5 cm，橫徑1.0～1.5 cm，成熟后紫黑色，果柄長(zhǎng)10 mm 左右；含可溶性固形物11.6%，可滴定酸1.89 g/kg，維生素C 17.3 mg/100 g，口感甘甜。果實(shí)結(jié)籽率高，桑籽發(fā)芽率高。發(fā)條力一般，枝條直立無彎曲。

選4 雌性株系。雌性花無明顯花柱，柱頭內(nèi)側(cè)具毛（圖3）。葉長(zhǎng)心形，邊緣鈍齒，葉色綠色。聚花果長(zhǎng)筒狀，長(zhǎng)2.0～2.5 cm，橫徑1.0～1.5 cm，成熟后紫黑色，果柄長(zhǎng)5～7 mm；含可溶性固形物8.1%，口感偏酸。果實(shí)結(jié)籽率高，桑籽發(fā)芽率高。早熟，比‘龍桑1 號(hào)’早7 d 左右。

圖3 果桑品種的雌花

矮化1號(hào) 雌性株系。雌性花無明顯花柱，柱頭內(nèi)側(cè)具突起。葉間距2.97cm，五列葉序；花葉，葉片六裂為主，邊緣鈍齒，葉色綠色。聚花果橢圓形，長(zhǎng)1 cm左右，成熟后紫黑色，口感酸甜。果實(shí)結(jié)籽率高，桑籽發(fā)芽率高。樹勢(shì)緊湊，葉間距短。

2.2 6 個(gè)果桑品種的染色體數(shù)目

選取制片中染色體分散良好、染色深度適中、著絲點(diǎn)清晰的細(xì)胞進(jìn)行染色體數(shù)目統(tǒng)計(jì)。表1顯示，在‘龍桑1 號(hào)’細(xì)胞中檢測(cè)到染色體數(shù)目為28 和42，可推斷‘龍桑1 號(hào)’染色體是四倍和六倍的混倍體；‘選2’染色體數(shù)目為42，六倍體；‘龍椹1 號(hào)’‘選3’‘選4’‘矮化1號(hào)’果桑染色體數(shù)目均為28，為四倍體（圖4）。

表1 6 個(gè)果桑品種細(xì)胞染色體數(shù)目

圖4 果桑品種的染色體數(shù)目

3 討論

桑樹染色體基數(shù)一直為桑屬植物細(xì)胞學(xué)研究熱點(diǎn)。早在1909年，日本學(xué)者田原正人確定桑樹的染色體基數(shù)是X=14。1948年，Janaki[8]對(duì)黑桑種（Morus nigra Linn）起源的研究也推測(cè)桑樹的染色體組基數(shù)是14。隨著桑樹細(xì)胞學(xué)研究的推進(jìn)，近年來西南大學(xué)家蠶基因組生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室工作團(tuán)隊(duì)對(duì)川桑和其他桑樹品種細(xì)胞染色體數(shù)目的大量研究，有理由證明桑樹的染色體基數(shù)可能為7[5，6，9]。

‘龍桑1 號(hào)’是上世紀(jì)80年代在朝鮮‘秋雨?！邪l(fā)現(xiàn)的自然變異單株，經(jīng)過多年系統(tǒng)培育而成。以前鑒定認(rèn)為‘龍桑1 號(hào)’是自然六倍體，但本研究在‘龍桑1號(hào)’細(xì)胞中檢測(cè)到染色體數(shù)目28 和42，因此推斷‘龍桑1 號(hào)’染色體是四倍和六倍的混倍體。同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)‘選2’的自然六倍體，并且‘選2’與‘龍桑1 號(hào)’植株性狀上有諸多相似之處。如果實(shí)結(jié)籽率低，桑籽發(fā)芽率低，葉片表面生有微小剛毛，粗糙，枝條略有彎曲等?！堥? 號(hào)’‘選3’‘選4’‘矮化1 號(hào)’ 果桑品種植株性狀差異明顯，染色體倍性均為四倍體。